CD4组蛋白H3乙酰化还原⁺T淋巴细胞:成人潜伏性自身免疫性糖尿病的潜在机制

摘要

目标成人潜伏性自身免疫性糖尿病（LADA）是基因-环境相互作用的结果。组蛋白乙酰化调节基因表达，并可能解释环境因素如何修饰LADA。因此，我们研究了CD4中的组蛋白乙酰化模式⁺LADA患者的T淋巴细胞。方法．血液CD4⁺取28例LADA患者和28例健康对照者的T淋巴细胞检测组蛋白H3乙酰化和H4乙酰化，用实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测组蛋白乙酰转移酶（P300和CREBBP）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC1、HDAC2和HDAC7）的基因表达。结果．与健康对照组相比，LADA患者CD4中H3乙酰化整体降低⁺T淋巴细胞()．全球H4乙酰化水平无统计学差异。在拉达,CD4⁺T淋巴细胞H3乙酰化与糖化血红蛋白（HbA1c）和GADA滴度相关。与健康对照组相比，LADA患者组蛋白乙酰转移酶CREBBP的表达下调，组蛋白脱乙酰酶HDAC1和HDAC7的表达上调。结论．在CD4细胞中发现组蛋白H3乙酰化的协同下调⁺这可能为LADA及其并发症的发病机制提供新的表观遗传学解释。

1.导言

成人潜伏自身免疫性糖尿病(LADA)是发生在成人的1型糖尿病的一种形式，通常发病过程较慢。根据LADA中国多中心研究，中国的LADA患病率并不低[1］.LADA是一种由遗传和环境因素复杂相互作用引起的自身免疫性疾病。其特征是t细胞介导的胰岛分泌胰岛素的破坏β肽。LADA的发病机制涉及许多免疫细胞，包括CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞，B淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，以及CD4⁺T淋巴细胞起主要作用[2，3.]尽管现有的研究已经提供了很多关于LADA相关的遗传因素和自身免疫的知识[4，5，其潜在机制仍有待进一步研究。

组蛋白乙酰化在调控基因表达中起重要作用[6，7］.最近的证据表明，组蛋白乙酰化有助于某些自身免疫性疾病的发病机制[8，9］.有证据表明，糖尿病及其并发症也涉及组蛋白乙酰化[10- - - - - -12］.LADA是一种自身免疫性糖尿病;我们推测组蛋白乙酰化参与了LADA的发病机制。

1型糖尿病分为急性发作（典型1型糖尿病）和潜伏发作（LADA）两个亚型与其他自身免疫性疾病相比，1型糖尿病组蛋白乙酰化的研究在LADA中相对较少和罕见。目前，Miao等人对1型糖尿病患者组蛋白修饰进行了研究。他们的研究表明，1型糖尿病单核细胞中H3K9乙酰化水平相对于健康对照组有显著差异特洛尔[13]，单核细胞H3K9乙酰化与平均HbA1c水平显著相关[14］.他们的研究对象是典型的1型糖尿病。

典型的1型糖尿病以发病时胰岛功能衰竭为特征。目前对1型糖尿病组蛋白乙酰化的研究主要集中在经典的1型糖尿病，很少有LADA组蛋白乙酰化的研究。然而，LADA的胰岛功能并不是完全破坏，而是部分破坏，LADA发展到依赖胰岛素治疗有一定的时间间隔(往往是几年)[15，16]因此，对LADA的研究和早期干预具有更重要的意义。目前对1型糖尿病患者组蛋白乙酰化的研究选择淋巴细胞或单核细胞，而不是CD4⁺T淋巴细胞在LADA发病机制中起核心作用，选择CD4⁺在本研究中，我们首先研究了组蛋白H3乙酰化和H4乙酰化的整体状态以及组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶在CD4细胞中的基因表达模式⁺和健康对照组的T淋巴细胞

2.研究设计与方法

2.1.人文学科注册

本研究经浙江大学医学院第四附属医院伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》。受试者在使用临床记录前需签署知情同意书。患者记录/信息在分析前被匿名和识别。我们将56名志愿者分为两组，第一组28名确诊为潜伏性自身免疫性糖尿病的成年人(LADA)，第二组28名健康对照组。本研究采用糖尿病免疫学协会提出的LADA诊断标准。在本研究中，LADA定义为年龄在30岁以上，初次诊断后6个月不需要注射胰岛素，且谷氨酸脱羧酶自身抗体(GADA)阳性的患者。所有患者均无其他自身免疫性疾病。健康对照组无自身免疫史和糖尿病史;OGTT值正常，未检测自身抗体状态。受试者特征见表1．两组患者年龄、性别比例差异无统计学意义。数字1论证了本研究的实验设计。

2.2.CD4的分离⁺T淋巴细胞

总共60人 从每位患者和健康对照受试者中采集静脉外周血mL，采用Ficoll梯度密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）⁺根据制造商（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）提供的方案，使用磁珠通过阳性选择分离T淋巴细胞。CD4的纯度⁺流式细胞术检测，T细胞普遍高于95%。

2.3.实时定量PCR

总RNA通过Trizol法（美国Invitrogen）制备；通过测量260和280处的光密度确定数量和纯度 纳米，储存于−80°C。根据制造商的说明（Takara），使用一步法SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒进行实时定量PCR。β-肌动蛋白用作内部对照。使用染色质修饰基因的引物，包括组蛋白乙酰转移酶（P300和CREBBP）和组蛋白脱乙酰基酶（HDAC1、HDAC2和HDAC7）。引物序列列于表12．

2.4.检测全局H3/H4乙酰化

根据制造商说明书(Epigentek)，使用EpiQuik组蛋白H3乙酰化和H4乙酰化检测试剂盒进行组蛋白提取和H3和H4乙酰化检测。简单地说，将细胞收集到一个管中，使用提供的裂解缓冲液裂解细胞。使用提取缓冲液和三羧酸溶液提取组蛋白。样品的组蛋白和乙酰化的H3或H4对照蛋白稳定地斑点在带孔上。洗涤后加入捕获抗体。乙酰化组蛋白H3/H4被高亲和抗体识别。加入显影液显影，然后在450nm的酶标仪上读取吸光度。通过OD值(样品空白)/OD值(对照空白)定量测定H3/H4乙酰化量。

2.5.统计分析

结果以平均值±标准差表示。各组变量通过Student’s进行比较-连续变量检验。根据数据的正态性，相关性由皮尔逊秩次或斯皮尔曼秩次相关性确定。被认为是重要的。实时荧光定量PCR数据采用比较CT法(也称比较CT法)进行分析方法)，以> 2绝对值为显著性。

3.结果

受试者特征见表1.LADA患者和健康对照组之间的糖尿病持续时间和HbA1c存在显著差异()，两组间年龄、性别比例、BMI、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血清肌酸无显著差异()．

３．１．CD4组蛋白H3/H4乙酰化⁺T淋巴细胞

为了评估LADA患者的整体组蛋白H3/H4乙酰化水平，我们分离了CD4⁺来自28名LADA患者和28名健康对照者的T淋巴细胞。我们发现H3乙酰化减少()在CD4细胞中观察到⁺与健康对照组相比，LADA患者的T淋巴细胞。H4乙酰化水平在患者和对照组之间无统计学差异（图1）2（a）)．

3.2.H3乙酰化和HbA1c之间存在明显关联

接下来我们分析H3乙酰化与HbA1c等的关系。如表所示3.，我们发现LADA-CD4⁺T淋巴细胞H3乙酰化与HbA1c相关().然而，LADA患者的CD4⁺T淋巴细胞H3乙酰化与空腹血糖、餐后血糖、空腹c肽、餐后c肽、年龄、病程、糖尿病肾病、心血管疾病均无相关性。

将LADA患者进一步分为两个亚组，HbA1c > 7% ()及糖化血红蛋白< 7% ()，考虑到糖尿病治疗的目标是实现HbA1c<7%。与HbA1c<7%的LADA患者相比，H3乙酰化降低()在CD4细胞中观察到⁺HbA1c > 7%的LADA患者的T淋巴细胞(图2（b）)．

据报道，HbA1c与并发症进展相关。然后我们将LADA患者分为两个亚组，即有并发症的患者()及没有()．与无并发症的LADA患者相比，H3乙酰化整体降低()在CD4细胞中观察到⁺伴并发症的LADA患者的T淋巴细胞(图2（c）)．

３．３．H3乙酰化与GADA效价的关系

LADA是一种自身免疫性疾病，采用gada阳性对LADA进行分类。我们比较了低GADA滴度(18单位/mL) LADA患者的H3乙酰化水平GADA < 180单位/mL)和GADA滴度高(GADA180单位/毫升)。与GADA滴度低的LADA患者相比，CD4中H3乙酰化水平整体降低⁺高GADA滴度LADA患者的T淋巴细胞()（图2（d）)．

3．4．组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶在CD4中的基因表达⁺T淋巴细胞

由于组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶调节组蛋白乙酰化，为了研究LADA患者H3乙酰化模式降低的原因，我们评估了CD4组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶基因的mRNA水平⁺T淋巴细胞实时荧光定量PCR检测。

如图所示3.，我们发现与健康对照组相比，LADA患者组蛋白乙酰转移酶CREBBP的表达下调（图3（a）组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC7表达上调(图2)3（b）)．在我们的研究中检测到的其他组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶在患者和健康对照组之间没有统计学差异。与无并发症LADA患者相比，有并发症LADA患者CREBBP表达下调(图)4(一))同时，伴有并发症的LADA患者HDAC1和HDAC7的表达上调（图4 (b))．与HbA1c < 7%的LADA亚组相比，在HbA1c > 7%的LADA患者中，CREBBP表达下调，HDAC1和HDAC7表达上调(图)4 (c)和4 (d))．

4.讨论

本研究的目的是探讨组蛋白乙酰化是否参与LADA的发病和发展。选择LADA疾病进行研究的原因如下。糖尿病的患病率逐年增加，LADA是糖尿病的一种亚型，其分子机制尚不清楚。组蛋白乙酰化是近年来的研究热点，大量研究表明组蛋白乙酰化与自身免疫性疾病和糖尿病相关;然而，很少有研究关注LADA。因此，我们研究了LADA患者组蛋白乙酰化模式。选择CD4的基本原理⁺要研究的T淋巴细胞如下：第一，CD4⁺T淋巴细胞可以从外周血中分离出来，可以在定期就诊时以相对无创的方式获得。其次，与基因组不同，表观基因组是细胞类型特异性的。最重要的是，LADA的特征是T细胞介导的胰岛自身免疫破坏，以及CD4⁺T淋巴细胞在LADA的发病机制中起着核心作用[2，3.];因此,选择CD4⁺T淋巴细胞的研究更为直接和深入。

我们证明了CD4细胞的组蛋白乙酰化模式⁺LADA患者的T淋巴细胞。我们发现在CD4中存在H3乙酰化的减少⁺LADA患者的T淋巴细胞和H3乙酰化水平降低与GADA滴度相关。LADA是一种自身免疫性疾病，GADA阳性是LADA最重要的自身免疫标记物。因此，我们推测H3乙酰化可能参与了LADA的发病机制。

为了研究LADA患者H3乙酰化模式降低的原因，我们评估了组蛋白修饰物mRNA水平。结果显示LADA患者乙酰转移酶CREBBP表达下调，组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC7表达上调。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶调控[17，18］.特异性乙酰转移酶CREBBP的低表达和去乙酰化酶HDAC1和HDAC7的高表达可能解释了我们在CD4细胞中观察到的整体组蛋白H3乙酰化的显著降低⁺LADA患者的T淋巴细胞。

分析H3乙酰化与糖尿病代谢指标的关系。我们发现H3乙酰化水平与HbA1c相关。同时，我们发现与无并发症的LADA患者相比，有并发症的LADA患者整体H3乙酰化水平相对降低。上述两项结果与DCCT先前的分析一致[19，20.显示HbA1c与并发症进展之间存在非线性关系。Miao等人[14]发现1型糖尿病单核细胞H3K9乙酰化与HbA1c显著相关，且高乙酰化启动子包含50%以上与NF-相关的基因κB炎症途径。结合我们的研究，这表明NF在多个水平上组蛋白H3乙酰化减少-κB通路或其他通路可能与LADA的并发症有关。

总之，我们发现CD4中的整体组蛋白H3乙酰化水平⁺LADA患者的T淋巴细胞显著减少。这可能为LADA及其并发症的发病机制提供新的表观遗传学解释。

利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

浙江省医药卫生与科技项目(no . 201473015)。

参考文献

1. 周志强，项耀，季立群等，“中国潜伏性自身免疫性糖尿病的发病率、免疫遗传学和临床特征（LADA中国研究）：一项全国性、多中心、临床为基础的横断面研究，”糖尿病第62期2, pp. 543 - 550,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. N.Marek Trzonkowska，M.Myśliwiec，A.Dobyszuk等人，“1型糖尿病合并糖尿病的治疗”${\text{CD}4}^{+}{\text{CD25}}^{\text{高}}\text{CD}127$—调节性T细胞延长胰岛存活—一年随访结果临床免疫学，第153卷，第153期1, pp. 23-30, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. R. Dahan, J. A. Gebe, A. Preisinger等人，“针对糖尿病相关的自反应T细胞表位的新型重组抗体对1型糖尿病的抗原特异性免疫调节，”自身免疫杂志， vol. 47, pp. 83-93, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. E.Laugesen，J.A.stergaard和R.D.Leslie，“成人潜伏性自身免疫性糖尿病：当前知识和不确定性，”糖尿病医学，第32卷，第7期，第843-852页，2015年。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. K. J. Basile, V. C. Guy, S. Schwartz和S. F. A. Grant，“成人1型糖尿病、2型糖尿病和潜在自身免疫性糖尿病的遗传易感性重叠”，当前糖尿病报告第14卷第2期2014年第550条第11条。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. A.Galvani和C.Thiriet，“核小体以组蛋白尾部乙酰化的速度跳舞，”基因，第6卷，第2期3, pp. 607-621, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. D. Molina-Serrano和A. Kirmizis，“组蛋白尾之外:核小体二联体的乙酰化控制转录”，核，第4卷，第4期。5, pp. 343-348, 2013。视图:谷歌学者
8. B. Gupta和R. D. Hawkins，“自身免疫性疾病的表观基因组学”，免疫学和细胞生物学，第93卷，第3期，第271-276页，2015年。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. L.Haery，R.C.Thompson和T.D.Gilmore，“B细胞和T细胞发育、生理学和恶性肿瘤中的组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶，”癌症基因，第6卷，第2期5-6, pp. 184-213, 2015。视图:谷歌学者
10. “2型糖尿病的发生可能与肝组蛋白H3甲基化和乙酰化有关。”生理生化杂志，第71卷，第71期1, pp. 89-98, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. Wang Y.， Wang Y.， Luo M.等，“新型姜黄素类似物C66通过参与p300/ cbp介导的组蛋白乙酰化的JNK途径预防糖尿病肾病，”生物化学与生物物理学——疾病的分子基础，第1852卷，第2期。1, pp. 34-46, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. M. A. Reddy, E. Zhang, R. Natarajan，“糖尿病并发症和代谢记忆的表观遗传机制”，Diabetologia，第58卷，第2期3, pp. 443-455, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. Miao，Z.Chen，L.Zhang等，“1型糖尿病易感基因的表观遗传组蛋白翻译后修饰谱，”生物化学杂志，第287卷，第20期，第16335-16345页，2012年。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. Miao，Z.Chen，S.Genuth等人，“评估表观遗传组蛋白修饰在1型糖尿病代谢记忆中的作用，”糖尿病，第63卷，第5期，第1748-1762页，2014年。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. M.Hernandez，A.Mollo，J.R.Marsal等人，“潜伏性自身免疫性糖尿病（LADA）患者的胰岛素分泌：介于1型和2型糖尿病之间的一半：LADA的作用9，”BMC内分泌失调， 2015年第15卷，第1条。视图:谷歌学者
16. T. Tuomi, N. Santoro, S. Caprio, M. Cai, J. Weng, L. Groop，《糖尿病的许多方面:一种日益异质性的疾病》，《柳叶刀》，第383卷，第2期。9922, pp. 1084-1094, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. H.Ü.Kaniskan，K.D.Konze和J.Jin，“蛋白质甲基转移酶的选择性抑制剂，”药物化学杂志，第58卷，第4期，第1596-16292015页。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. C.C.Thinks，K.S.England，A.Kawamura，R.Chowdhury，C.J.Schofield和R.J.Hopkinson，“针对组蛋白赖氨酸脱甲基酶的进展、挑战和未来，”生物嵌合与生物物理学Acta基因调控机制，第1839卷，第12期，第1416-1432页，2014年。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. S. Genuth，“糖尿病控制和并发症试验/糖尿病干预和并发症研究的流行病学见解，使用强化血糖治疗降低1型糖尿病并发症的风险，”内分泌实践，第12卷，增刊1，第34-41页，2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. J.M.Lachin，N.H.White，D.P.Hainsworth，W.Sun，P.A.Cleary和D.M.Nathan，“强化糖尿病治疗对1型糖尿病患者糖尿病视网膜病变进展的影响：DCCT/EDIC的18年随访，”糖尿病号，第64卷。2, pp. 631-642, 2015。视图:谷歌学者

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