文摘

本研究确定微rna的表达- 133 a (mir - 133 - a)在结直肠癌(CRC)和相邻的正常粘膜样本在CRC和评估其临床病理的作用。mir - 133 a的表达在125对组织样本进行了分析定量实时聚合酶链反应(存在)和与病人的临床病理的数据统计分析。内生的几个潜在的目标基因表达水平测定中存在并使用皮尔逊相关的方法。mir - 133 a是表达下调83.2%的肿瘤与正常粘膜组织。高mir - 133 a的表达在肿瘤组织中与远处转移的发展,先进的公爵和TNM分期,可怜的生存。上涨的不利预后mir - 133 a表达伴随着失调的潜在mir - 133目标基因,LIM和SH3域蛋白1 (LASP1) Caveolin-1 (CAV1)和Fascin-1 (FSCN1)。LASP1被发现拥有一个负相关(),而CAV1表现出显著正相关(),和一个更强的相关性被发现在患者远处转移()。此外,在nonmetastatic FSCN1只是发现患者的负相关。总之,mir - 133 a是CRC组织中表达下调,但其高表达与不良临床特点和预后不良有关。

1。介绍

孤独,结直肠癌(CRC)负责600000年死亡率每年,每年大约有120万新发病例报道1]。这使得CRC第三全球最常见的癌症,癌症相关死亡的第二大原因在欧洲和美国(2]。零星发生的CRC是环境和遗传因素的结合效应导致的多级发展正常的腺瘤最后几年几十年的恶性癌(3]。在大约20%的情况下,有一种强烈的遗传因素涉及作为一级亲属被诊断为癌症或者他们有一个潜在的遗传倾向(如糖尿病、肥胖症、性别和炎症性肠病),增加了CRC的风险。主要的重要的外在因素是生活方式。特别是饮食摄入量高的酒精,证明和脂肪,纤维摄取不足会增加患CRC (4]。

microrna是高度保守的,小的,非编码RNA大约19-25核苷酸长度,每个有能力调节数百个基因和作为主要监管机构可能影响癌基因和肿瘤抑制基因的表达(5]。他们通过目标函数多个记录epigenetically调节基因的翻译速度和诱导信使核糖核酸(mRNA)退化根据绑定的力量(3′UTR) 3′端非翻译区。其重要性所反映出的事实是它们参与几乎所有重要的生物细胞过程包括细胞凋亡、分化、增殖和迁移,建议调整超过50%的蛋白编码基因(6]。维尔康姆基金会桑格研究所内,发布20,2013年6月,1872序列的人类microrna已确定到目前为止(7]。

潜在的microrna是后生生物标志物一直被认为是一种非侵入性方法早期CRC检测,使生存的更有效的治疗和评价(8]。然而,microrna的确切机制失调的CRC发病机制并不完全理解,但独特的microrna的表达谱集已确定在一个大量的癌症,例如,卵巢癌,乳腺癌和前列腺癌。这个概要文件的改变在治疗反应和疾病进展提供了潜在的促进癌症治疗(6]。

mir - 133——据报道在一些场合中表达下调肿瘤与邻近正常组织相比,它被实现为一个肿瘤抑制针对几个致癌基因。mir - 133 a目标FSCN1膀胱癌和CAV1头颈部鳞状细胞癌作为一个肿瘤抑制功能(9,10]。发表论文涉及许多microrna数组数据显示,mir - 133 a是CRC underexpressed邻近正常组织相比,和mir - 133还被记录目标LASP1通过增殖蛋白激酶通路(MAPK) [11]。在乳腺癌,mir - 133 a表达的损失与贫穷有关生存,和恢复这个表达式被发现减少乳腺癌细胞系细胞入侵和调节扩散通过针对表皮生长因子受体(12]。

2。材料和方法

2.1。病人和组织样本

该研究包括125例(29 - 95岁,平均年龄71.8岁)与主CRC诊断和切除的手术,玛丽女王医院,香港,2008年和2012年之间。对于每个案例,原发肿瘤样本和对应的正常结直肠粘膜被检索的比较。所有样品在液氮瞬间冷冻和储存在−80°C,直到进一步的分子分析。收到书面同意对所有患者招募。从医院获得临床和病理数据记录与年龄、性别、诊断、肿瘤位置和大小、TNM分期,当地的入侵,分化和远处转移。U6小核RNA (U6)和小核仁的RNA, C / D盒48 (RNU48),被用作基因和潜在引用U6用于进一步分析。表达水平是“规范化”用小核RNA U6已经被许多其他的研究。本研究经医院的机构审查委员会批准。

2.2。RNA提取和定量rt - pcr

TaqMan微分析(应用生物系统公司,培育城市,CA)是用于相对量化的microRNA的水平和检测mir - 133 a(化验ID。002246);U6(化验ID。001973)和RNU48(化验ID。001006)是利用内部控制。从肿瘤组织中提取总RNA,相邻的正常粘膜使用mirVana microrna的隔离设备(Ambion、奥斯汀、TX)根据制造商的指示。RNA浓度测量使用Nanodrop nd - 1000分光光度计(Nanodrop技术,威明顿、德、美国)。

这个总RNA用于反向转录mRNA互补DNA(互补)和microrna使用TaqMan微阵列分析(应用生物系统公司,培育城市,CA)从125年病人的组织样本。每个逆转录酶反应利用10 ng的总RNA (5.00μL), 0.15μ1.00 L核苷酸总量(100毫米)μL Multiscribe RT酶(50 U /μL), 1.50μL 10 x RT缓冲区,0.19μL核糖核酸酶抑制剂(20 U /μL), 4.16μL核酸酶游离水,3μL 5 x RT引物反应总额到15μl .豆类PCR热循环骰子程序如下:30分钟16°C,在42°C, 30分钟和5分钟在85°C。实时PCR进行使用实时PCR 7900 ht系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。相对地转录cDNA稀释1:20 qPCR反应体积混合之前,1.33μL结合10μL 2 x普遍PCR反应混合液(没有AmpErase)), 7.67μL水,1.0μL 20 x微rna分析。20的总量μL /反应被转移到一个96微安板块(应用生物系统公司,培育城市,CA)和孵化10分钟在95°C,紧随其后的是40周期为15秒95°C。然后60°C,持续60秒。所有的样品都在重复运行。

mir - 133 a,引物如下:向前,5′-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3′和反向,5′-UAAACCAAGGUAAAAUGGUCGA-3′。

互补脱氧核糖核酸合成mRNA表达是混合使用Primescript RT执行主根据制造商的协议(豆类生物、日本)。LASP1存在放大,CAV1 FSCN1,β肌动蛋白(内部控制)mRNA进行使用实时PCR 7900 ht系统(应用生物系统公司,培育城市,CA),由于“快速上手”项目SYBR绿色PCR反应混合液(罗氏诊断,曼海姆,德国)根据制造商的指示。PCR条件50°C 2分钟和10分钟95°C,紧随其后的是40周期为15秒和60 95°C,持续60秒。LASP1的表达水平,CAV1, FSCN1信使rna被规范化β肌动蛋白mRNA的表达。特定的引物如下:LASP1 5′-CTTCGCCTCAAGCAACAGAGTG-3′(向前)和5′-TGTCTGCCACTACGCTGAAACC-3′(反向);CAV1, 5-CCAAGGAGATCGACCTGGTCAA-3′(向前)5′-GCCGTCAAAACTGTGTGTCCCT-3′(反向);FSCN1, 5-GACACCAAAAAGTGTGCCTTCCG-3′(向前)5′-CAAACTTGCCATTGGACGCCCT-3′(反向)β肌动蛋白,5′-CGAGCATCCCCCAAAGTT-3′(向前)5′-GCACGAAGGCTCATCATT-3′(反向)。

2.3。统计分析

所有关系的相对目标microrna的表达进行使用棱镜5(美国CA Graphpad)统计软件。值是双面的,被认为是具有统计学意义。mir - 133之间的联系——一个使用Mann-Whitney表达和临床病理特征进行了探讨克鲁斯卡尔-沃利斯检验,合适。生存估计使用kaplan meier方法使用生存率较和比较。总的来说,metastasis-free生存和生存曲线计算基于手术直到死亡日期或日期转移的诊断。病人随访2年以上或直到死亡时间被用来计算总生存期(OS)。被认为是表达水平下调如果褶皱变化低于0.40或调节如果超过2.5,分别。ΔΔ所示的数据表单数据,更高的价值是指示性较低的表达式,并计算了规范化的内部控制和正常组织表达。积极的价值观。差别代表对这些相对mir - 133——一个表达式是使用公式计算。mir - 133 a之间的相关性和潜在目标基因被皮尔森分析的方法;的值计算测试(Graphpad、钙、美国)。

3所示。结果

3.1。mir - 133 a表达的比较相邻正常粘膜组织和肿瘤组织

mir - 133 a的表达水平显著下调肿瘤相比邻nontumor粘膜(图1(一),)的平均值0.04倍的差异。125个样本中,104例(83.2%)肿瘤显示低mir - 133 a的表达;其他的21个肿瘤,肿瘤4例(3.2%)显示调节mir - 133 a的表达和17例(13.6%)肿瘤显示没有变化表达式与相邻nontumor粘膜相比,表明mir - 133 a镇压CRC患者经常被观察到。

3.2。Reexpression CRC的mir - 133 a与先进的分段和远处转移的发展

mir - 133 a表达的临床病理意义。之间没有显著相关性mir - 133 a的表达和其他临床病理的特点,如性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型、肿瘤位置和深度的入侵(、表1)。然而,当比较早期和晚期TNM临床和公爵登台,mir - 133 a表达的显著差异被发现,分别为(数字1 (b)和1 (c),,)。先进的TNM和公爵分期与高mir - 133 a的表达即使其表达式仍然是,在肿瘤组织较低。此外,mir - 133 a的高表达与远处转移(图的发展1 (d),CRC患者),表明mir - 133的意义——一个在肿瘤转移。

101 CRC患者的预后进展后手术切除后也进行了分析。基于中值mir - 133 a的表达水平,结果的患者被分为2组,高、低mir - 133 a的表情,和被证明有显著差异使用kaplan meier生存分析和Gehan-Breslow Wilcoxon测试(图1 (e),)。mir - 133的高表达患者有显著降低的患者总生存期比低mir - 133 a的表达。

3.3。表达下调mir - 133 a表达与一些潜在的目标转移相关的基因

总的来说,95年病人的LASP1和mir - 133 a表达进行分析,一个负相关(图2(一个),,)被发现,这表明LASP1确实是消极的规定在CRC mir - 133 a。有趣的是,有一个积极的相关性CAV1 CRC患者和mir - 133 a表达(图2 (b),,)。此外,之间存在着较强的正相关mir - 133 a和CAV1表达患者远处转移(图2 (c),,)。在患者未出现转移,FSCN1之间有显著负相关和mir - 133——一个表达式(图2 (f),,),但没有明显的协会在转移性疾病患者。这些结果表明目标基因的复杂机制受mir - 133 a, mir - 133 a的监管效果是相反的,在其他的研究报告(CAV1),甚至在CRC不同转移潜能(CAV1和FSCN1)。

4所示。讨论

尽管mir - 133 a的表达,在大多数地区,在肿瘤组织中表达下调,患者的高表达与预后不良相关和不良的临床特征。mir - 133 a表达的相关性与远处转移的发展以及先进的TNM和公爵分段表明mir - 133 a的表达与肿瘤转移,因此CRC的进展。

许多功能研究一直在进行mir - 133 a及其实验证明致癌基因目标,表明其作为一个肿瘤抑制在各种癌症9,13,14]。然而,有限的研究一直在进行临床资料之间的相关性和mir - 133 a表达在大群病人,表明缺乏临床病理的知识关于mir - 133 a CRC和有限的尝试在临床样本识别其直接目标。在分子的研究中,mir - 133 a可以直接调节几个metastasis-related致癌基因,包括FSCN1膀胱癌(9),LASP1 CRC (11],CAV1在头颈部鳞状细胞癌(15]。有冲突的报道关于mir - 133的作用在癌症的发展过程中,功能的研究已经被证明能够抑制转移和肿瘤发生在CRC(使用分子研究和动物模型6]。

本研究发现CAV1没有直接的目标在crc mir - 133 a有一个总体之间的正相关mir - 133 a和CAV1表达式(图2 (b),,),甚至更强的相关性在患者远处转移(图2 (d),,)。这种变化相关性CAV1和mir - 133表达意味着失调的一个或两个基因,提供额外的证据之前论文的reexpression CAV1增加转移性和迁徙的潜力。的证据mir - 133 a的失调在转移类似于CAV1以来它在转移过程中被重新激活表达变化在肿瘤进展(16- - - - - -18]。CAV1已经拥有的特点是双重功能在癌症的发展过程中作为一个肿瘤抑制和致癌基因,及其reexpression已经隐含在某些类型的癌症转移的必要条件,促进细胞迁移和入侵,例如,乳腺癌、肺癌、和前列腺癌(19- - - - - -21]。这些活化和upregulation表明更积极和chemoresistant表型在某些癌症预后差22,23]。CAV1的对比函数部分解释为威廉姆斯和Lisanti观察CAV1拥有几个肽区域不同的角色(16]。以前,CAV1报道中表达下调CRC和拥有“两相的差异表达”,支持发现CAV1呈正相关,mir - 133 - CRC患者,尤其是在那些发达的远处转移,因为先进的肿瘤进展和转移与高mir - 133 a中说明的表达研究[17,18,24]。

mir - 133 a表达式被发现与LASP1反向相关表达式(图2(一个),,)王等人关于LASP1确凿之前研究的直接目标mir - 133 a CRC的功能研究中涉及一个正交的模型(25]。有趣的是,LASP1基因曾被报道在CRC具有功能性作用在肿瘤转移和发展,及其在转移性乳腺癌和卵巢癌超表达进一步支持这个11,26]。相反,FSCN1才发现是负相关的患者尚未开发的转移(图2 (f),,),这表明FSCN1 mir - 133 a及其特异表达抑制受损的转移。FSCN1已被证明是一个转移性基因和mir - 133的目标——一个在食管鳞状细胞癌和膀胱癌9,10]。所记录的功能作用很多报纸表明人们普遍参与迁移和入侵,因此,参与到播种的循环肿瘤细胞转移性网站,因此解释其抑制mir - 133 a nonmetastatic患者(27,28]。在CRC, mir - 451也被证明调解FSCN1表达式通过抑制5′活化蛋白激酶(AMPK)当过表达,进而激活了哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)可以调节FSCN1 [29日]。这表明至少两个小分子核糖核酸的CRC调节FSCN1表达式,提供了一个解释为什么mir - 133 a的表达与FSCN1 nonmetastatic CRC患者。

高mir - 133 a的表达也会增加转移Nohata et al .,进行的研究发现mir - 133 a是增加大脑转移相关基因的启动子CRC (30.]。基于这篇论文之前,mir - 133 a表达不仅提高原发性肿瘤,而且转移,mir - 133 a的表达高于主。

更高的mir - 133 b的表达,mir - 133 a的同系物股票相同的转录单位,展示了与贫困有关生存相比,低表达在106年膀胱癌患者()表明潜在的这群microrna函数作为oncomirs [31日]。mir - 133 - a和mir - 133 b已被证明对目标FSCN1食管鳞状细胞癌,可能反映在CRC分享一些其他潜在目标基因由于其高相似性序列,也就是说,只有不同的核苷酸(10,30.]。

在这项研究中,高mir - 133 a的表达显著相关的短OS 102 CRC患者的5年生存分析,表明mir - 133 a的潜力在CRC治疗预后标记。高表达似乎是一个重要的预测预后不良和转移的发展。mir - 133 -一个被发现调节5 -氟尿嘧啶chemoresistant细胞和可能拥有更高比例的细胞与癌症干细胞表型,因此具有更高的转移可能基于达拉斯et al。31日,32]。有趣的是,mir - 133 a的表达也发现调节CRC患者的血浆样品neoplasm-free控制相比,也与许多组织的研究,表明mir - 133——不仅仅是一个肿瘤抑制许多报纸报道(33]。

总之,mir - 133 a的表达下调在CRC致癌作用,但其在肿瘤组织高表达与先进的公爵和TNM阶段,发展的远处转移,预后不良。因此,mir - 133 a具有潜力作为临床标记来识别咄咄逼人的CRC患者的生存率可能低,容易出现远处转移。同时,mir - 133 a表达式与FSCN1负相关表达式的病人没有出现远处转移,但与CAV1呈正相关表达式并建立远处转移的病人。这表明mir - 133的作用——一个比一个简单的肿瘤抑制要复杂得多。需要进一步的研究来理解mir - 133 a的作用在肿瘤进展及其复杂的交互与癌基因和肿瘤抑制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

这项研究受到了香港大学研究基金会资助。