文摘

MHC班上改变我表达中起到至关重要的一步免疫逃避的癌症或感染病毒的细胞。本研究旨在研究是否获得耐受性移植修改我表达MHC类。FVB / N C57BL / 6小鼠呈现宽容同种抗原在子宫内C57BL / 6骨髓移植。后天,道供体皮肤和白细胞检查MHC表达式定量实时PCR和流式细胞术。道供体皮肤调节他们的MHC类我相关基因转录后短期(1 ~ 2周)或长期(> 1个月)移植。这种生理现象是同时与upregulation TAP1基因的转录,表明一个重要的角色中TAP1 MHC的规定类路径。表面类MHC分子h2o 在道供体白细胞持续显示超表达。最终,涉及的同种异体移植物耐受诱导供体移植的生物学的修改。MHC类的超表达我道内移植的宽容的老鼠可能使用的公差生物标记标识移植耐受状态。

1。介绍

器官移植已失败或失败的标准实践器官。然而,长期移植物的生存依赖免疫抑制疗法减轻或预防排斥反应的成本直接器官毒性,对机会性感染的易感性,恶性肿瘤,加速心血管疾病(1,2]。尽管几乎没有想象的概念在过去,实现公差器官移植是解决问题最好的办法由免疫抑制疗法。因此,现代移植医学是远离的探索新型免疫抑制剂对同种异体移植物耐受的感应器官接受者。它会导致迫切需要寻找独特的宽容生物标志物作为免疫抑制策略的替代终点,或者预测成功的宽容感应措施2,3]。接受者与贪污公差保持运转良好的移植免疫抑制治疗停止后,称为操作公差(4]。他们是最好的概念证明immunosuppressive-free移植物的生存和宽容的潜在候选人寻求签名(1,5- - - - - -7]。然而,这种独特的范式的人类宽容开发专门的庇护下前期免疫抑制疗法。免疫抑制的影响停止这些收件人保持宽容的解释的问题关注生物标记生成的(1,8]。几行MHC类证据揭示了一个关键的角色我(MHC I)分子在病毒感染或肿瘤细胞免疫逃避9,10),这表明获得耐受性移植可能不得不接受类似的生物学变化。在这个公差模型没有就业的免疫抑制,道供体皮肤调节mhc i相关基因转录和道供者细胞表面也过表达mhc i分子。因此,移植耐受化促进mhc i供体移植物内表达。

2。材料和方法

2.1。老鼠

FVB / N (H - )小鼠作为接受者,C57BL / 6 (H - 捐助者),摘要(H - )作为第三方同种抗原的来源。他们购买他们的年龄6 - 8周和培育研究的动物研究委员会的批准在长庚医院。接受女性被关在笼子里的男性在下午和第二天早晨检查阴道栓。那一天观察插头被指定为第0天怀孕的。

2.2。供体细胞和做准备在子宫内移植

C57BL / 6骨髓细胞(bmc)被冲洗收获胫骨和股骨磷酸缓冲盐(PBS)使用26-gauge针,分层在NycoPrep 1.077(奈科明,制药,奥斯陆,挪威),和离心机在600 g为25分钟。亮度的bmc被anti-CD3然后耗尽的t细胞ε圣地亚哥FITC (BioLegend CA)和anti-FITC微(Miltenyi研究,赤褐色,CA)。T-cell-depleted bmc包含CD3+流式细胞仪细胞< 0.5%。

捐赠者的bmc是新鲜注射后3小时内准备。短暂,妊娠的子宫怀孕第14天FVB / N小鼠暴露通过垂直剖腹手术。一个60μ米的玻璃微量吸液管、斜顶用于注入5 - 10×106T-cell-depleted bmc在5 - 10μL (PBS的腹膜腔所有胎儿通过transuterine垃圾的方法。然后,怀孕的老鼠的腹部被关闭在两层以丝绸。操作后,所有老鼠住在一个安静的房间里没有床上用品变化,直到幼崽是1周。小狗断奶在3周的年龄。

2.3。分析嵌合和mhc i供体白细胞的表情

嵌合水平检查1个月岁老了。外周血是通过尾静脉和采样枯竭的红细胞使用ACK赖氨酸缓冲区。细胞被第一次孵化anti-mouse Fcγ2 / Fcγ三世抗体(BioLegend),然后沾anti-H-2 FITC (BioLegend)和anti-H-2 体育(BioLegend)。嵌合水平流式细胞术测定浇注后死细胞高propidium碘染色。消极的控制由anti-H-2 FITC和鼠标IgG2a PE (BioLegend)来定义背景染色。收件人收集第一个月外围嵌合> 3%,进一步验证皮肤移植的宽容,因为他们可以一直呈现宽容供体皮肤(11]。至于量化供体白细胞的mhc i表情,道供体白细胞是封闭的,荧光强度(FIs,包括的意思是,地理的意思是,和中位数)anti-H-2 体育测量。野生型C57BL / 6小鼠作为控制。

2.4。皮肤移植

麻醉,收件人的剃了快船队和消毒beta-iodine解决方案。与完整的膜移植床carnosus是由剪刀(12]。皮肤移植从反面放置在移植床,固定针,凡士林纱布覆盖,穿了创可贴。移除敷料后7天,每天监测移植。宽容是定义为供体皮肤移植具有良好的头发生长至少4个月。道供体皮肤受到hematoxylin-eosin染色后光镜组织学检查以排除微观排斥的可能性。

2.5。信使rna提取小鼠皮肤移植的宽容

道皮肤移植在宽容的老鼠在表示时间点。然后,他们的细胞成分被物理治疗使用均质组织tearor试剂盒中的试剂(美国表达载体)。信使rna提取与RNeasy迷你包(试剂盒株式会社根据说明书、东京、日本)。RNA样品的纯度是评估使用吸收光的260和280海里(A260/280) nd - 2000分光光度计(美国Nanodrop技术)。高质量的mRNA显示A260/280比≥1.97。

2.6。定量实时PCR MHC皮肤移植的表情

第一链cDNA是相对地从mRNA转录模板等量的每个皮肤样本,使用MMLV高性能逆转录酶装备的低聚糖(dT)底漆(生物技术中心,麦迪逊,WI)。然后,mhc i相关目标基因表达被Bio-RAD量化iQ5实时PCR检测系统,使用Maxima SYBR绿色/火箭qPCR大师混合(2 x) (Fermentas,热科学)。实时PCR的特异性反应被融化曲线分析进一步证实了。归一化值目标mRNA表达计算每个样本的相对数量目标基因的相对数量除以glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)。所有基因的引物设计引物3的在线引物设计工具如表所示1。

表1
用于定量实时PCR引物。
2.7。统计分析

平等意味着被学生的检查 以及两个独立或paired-sample组。差异被认为是重要的 。

3所示。结果

3.1。筛选道供体皮肤的MHC基因表达

我们收集了13混合嵌合体与第一个月供体细胞(C57BL / 6)水平的6.05 ~ 28.18%。都容易宽容供体皮肤呈现至少4个月(图1)。道供体皮肤没有组织学炎症细胞浸润(图的证据1)。信使rna提取后,10个样本显示高质量的mRNA A260/280≥1.97。剩下的3个样品不合格是由于A260/280 1.84 ~ 1.92的比例较低。信使rna提取从5野生型C57BL / 6皮肤的A260/280比≥1.97。定量实时PCR然后从信使rna逆转录后执行每个样本的数量相等。mRNA的表达β2 m, H-2K ,H-2D ,H-2L h - 2 a, 和h - 2 a 基因是由规范化褶皱表达相对于内部控制GAPDH基因的信使rna数量。这个调查对MHC基因表达透露道供体皮肤显著调节 2 m, H-2K ,H-2D ,H-2L 相对于野生型控制(图2)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
供体特异性皮肤耐受性。混合嵌合成立于FVB / N小鼠在子宫内C57BL / 6骨髓移植。代表FVB / N混合嵌合体呈现宽容C57BL / 6供体皮肤(A),供体特异性(黑色的头发)和同系的(箭头所指)皮肤接受了4个多月后,他们的位置。拒绝第三方影响皮肤引起的疤痕(箭头)。Hematoxylin-eosin染色并没有透露炎性细胞浸润的道C57BL / 6供体皮肤(b),含有黑色素角质细胞内色素表皮基底(箭头)和真皮(箭头所指)。

图2
MHC相关基因的表达在道C57BL / 6供体皮肤。mhc i基因包括 2 m, H-2K ,H-2D ,H-2L 在道供体皮肤调节(T)与野生型相比供体皮肤(W)。然而,MHC II级的表达式(MHC II) h - 2 a 和h - 2 a 道和野生型C57BL / 6皮肤具有可比性。mhc ii H-2E C57BL / 6小鼠非功能性,而不是测试。意味着及其95%置信区间显示为水平线和阴影框,分别。
3.2。辅助蛋白的基因表达mhc i处理途径

我们进一步检查mRNA的表达翻译辅助蛋白质负责组装和运输的mhc i分子。这些chaperone-like蛋白质在mhc i处理途径包括抗原处理相关转运子(TAP1 & TAP2), tapasin, calnexin calreticulin, ERp57。道的供体皮肤显示重要upregulation TAP1,但只有边际upregulation TAP2(图3)。


图3
的附属蛋白mRNA表达mhc i途径。与野生型相比供体皮肤(W),道供体皮肤(T)有重大upregulation TAP1 ( ),但是只有边缘型upregulation TAP2 ( )。意味着及其95%置信区间显示为水平线和阴影框,分别。
3.3。mhc i和丝锥在供体皮肤移植前后基因表达

为进一步验证upregulation mhc i在获得耐受性移植相关基因转录本,我们进行了mhc i配对研究( 2 m, H-2K ,H-2D ,H-2L )和TAP1&2基因的表达皮肤移植前和移植后。小鼠皮肤耐受后被用作二次皮肤移植接受者道皮之前删除。同种异体(C57BL / 6)和同系的(FVB / N)尾部皮肤首次之前收集他们的位置在宽容的老鼠。皮肤移植后,道植皮来自同一个捐赠者尾巴收获在表示时间点(1 ~ 2周,> 1个月)。信使rna提取后(A260/280比≥1.97)和逆转录,测量目标基因的表达与这些内生GAPDH参考基因的定量实时PCR。Paired-sample 以及被用来计算两个规范化表达变量的值之间的差异为每个皮肤移植前后同一供体移植(pre-ST和post-ST)。的表达式 2 m, H-2K ,H-2L 在供体皮肤,TAP1显著增加短期(1 ~ 2周)和长期(> 1个月)移植。然而,H-2D 只有显著调节短期道供体皮肤(数据吗4和5)。同系的皮肤移植并没有表现出显著upregulation mhc i移植后相关基因。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
mhc i upregulation捐赠过程中皮肤耐受化。mhc i相关基因表达的供体皮肤检查(Post-ST)之前(Pre-ST)和之后的皮肤移植。的upregulationβ2 m (a), H-2K (b), H-2D (c)和H-2L (d)移植的供体皮肤出现在开始(1 2周, 在宽容的老鼠和保持在1 6个月( 除了H-2D皮肤移植后) 。同基因的供体皮肤也表现出类似的mhc i upregulation相关基因在短期(1 2周, )和长期(1 6个月, )移植。
(一)
(一)
(b)
(b)
图5
TAP1和TAP2表达过程中供体皮肤耐受化。供体皮肤移植的宽容的接受,无论是短期( )或长期( ),增强TAP1的表达(一)而不是TAP2供体皮肤内(b)。无论是TAP1还是TAP2一直调节短期(后同系的皮内 )和长期( )移植。
3.4。表面的mhc i表达供体白细胞在宽容混合嵌合体

表面蛋白质表达mhc i道供体白细胞被流式细胞术量化。五个宽容混合嵌合体与供体细胞水平的4.28 ~ 35.12%,年龄6个月收集的2的评价 意思是,地理的意思是,中位数金融中间人。在宽容的老鼠,道供体白细胞FIs的3 ~ 4倍增加相对于野生型白细胞(图6)。


图6
表面2 FIs的道供体白细胞在6个月大的混合嵌合体皮肤耐受性。这代表直方图显示表面,氢 PE FIs C57BL / 6供体白细胞从混合嵌合体和同龄野生型C57BL / 6控制。嵌合体( )有更高的意思是,地理的意思是,中位数2 比野生型FIs C57BL / 6控制( )。数据表示为平均值±标准误差的意思。 的意思是,地理(GeoMean),和中等金融中间人。

4所示。讨论

研究人员所面临的第一个挑战开始宽容生物标志物的研究在于招聘对象与操作公差(2,13]。人类的接受者可以有时呈现宽容移植肾脏(5,8)或肝脏6]。逐渐或突然撤军,在肾的患者的免疫抑制治疗方案可能引发的急性排斥反应。这不可避免地导致一定程度的不可逆肾实质损害损害肾移植的功能和寿命1]。虽然肝移植排斥的长期后遗症可能极小,甚至没有由于肝脏再生能力强,它是可行的只有当肝拒绝集可以及早发现和治疗后免疫抑制最小化或中止1]。因此,它是不可取的故意锥度或终止在接受者的免疫抑制方案审查现有的运营状态宽容。

临床,临床操作公差通常是一个偶然事件,发生在10 - 20%的肾(14)和肝脏(15收件人。这一小部分的人通常是公认的在一个特殊的情况下,他们做得很好后导致免疫抑制中止医疗不服从,或临床必要性等危及生命的感染,恶性肿瘤,或不可接受的药物毒性1]。随着高通量生物技术(16),这些偶然的接受者被收集来描绘他们的基因或蛋白质组表达模式(17]。基因或蛋白质组的分析表达式要求适当的平滑控制比较,研究人员可以识别特定的变化归因于国家或生物过程的操作宽容。然而,在宽容的接受高度选择情况下,普遍受到长期免疫抑制治疗多样化和复杂的临床课程。这使得很难甚至不可能找到合适的对照组。在其最简单的形式中,研究人员可能会发现足以辨别宽容的生物标志物nontolerance接受者。然而,很难确保生物标志物不仅仅是一个测试来确定公差患者没有服用免疫抑制方案(8]。因此,重要的是要参加健康的情况下给予免疫抑制方案,没有后续的免疫抑制停药,这样我们可以分析免疫抑制药物的贡献或移植试验结果的概要文件。然而,这仅仅是一个科学而不是道德的声音的方法。尽管如此不可逾越的障碍在人类主题研究宽容生物标志物,几项研究已经相关操作宽容自然杀伤(NK)的改变,监管(Treg), B -或γδt细胞相关基因表达(4,8,18]。

发现微不足道的供体组织或血液中的白细胞长期存在器官接受者曾经导致贪污公差的概念联系在一起的共同依赖的存在供体细胞嵌合现象(19,20.]。它提高了预期使用供体细胞嵌合现象是一种理想的生物标志物的容忍度。然而,随后的动物21,22和人类23]研究表明,移植耐受可能坚持供体细胞嵌合的缺失。此外,移植排斥甚至发生在供体细胞嵌合状态(24,25]。这种冲突可能归因于新兴共识,造血嵌合现象相关的移植耐受的诱导,而不是维护阶段(11,26]。尽管不可靠的供体细胞嵌合宽容生物标志物(27,28),建立混合嵌合现象仍然是最受欢迎的策略来促进同种异体移植物耐受各种动物模型免疫耐受的调查29日,30.]。令人惊讶的是,很少有这种动物研究试图确定公差生物标记(1]。这可能是因为在动物实验中获得的结果可能并不总是适用于人类。然而,动物研究仍是许多生物现象的重要试金石。建立混合嵌合能够通过促进移植耐受常规骨髓移植需要骨髓或免疫抑制疗法来修改宿主免疫(20.,31日]。在这种情况下,宽容生物标志物的研究仍然需要面对免疫抑制疗法的干扰。在这方面,在子宫内骨髓移植,无需myeloablation和免疫抑制传统tolerance-related研究方法有无与伦比的优势。因此,upregulation道内的mhc i移植代表一种生物现象,是独立于免疫抑制对接受者的影响。

追求宽容生物标志物,研究人员主要集中在接受者的偏好供体移植用于检查各种生物活动或产品就够了,意味着一个宽容的国家。然而,当地监管机制可能导致贪污公差内由于Treg活动特别容忍移植(32,33]。证据还表明,Treg-associated基因表达式接受者注定贪污宽容和移植排斥主要不同在移植本身而不是系统或在脾脏和淋巴结的接受者(18]。因此,移植耐受未必会引起循环系统,而是一种独特的生物标志物是一个目标移植免疫中的本地事件发生。因此,它是有意义的搜索宽容容忍移植或细胞生物标志物尽管生物标志物等易接近的来源是最好是可衡量的主机的血液。同种异体皮道短期或长期表现出相关的mhc i upregulation记录而非同源的皮肤移植。因此,mhc i upregulation并非源于皮肤移植的过程本身,而是生物修改供体同种异体移植的过程中宽容。同时upregulation TAP1基因的转录建议活动的关键作用TAP1 mhc i监管的途径。mhc i蛋白表达在道供体白细胞通过流式细胞术量化。道供者细胞表面2过表达 (mhc i)。

发现生物标志物用于移植耐受不一定相当于揭露他们的因果关系。然而,我们的方法二次捐献皮肤接受宽容接受者建议mhc i超表达是收件人的tolerizing对供体移植的影响。供体移植物内炎症反应可能上调他们的mhc i和相关基因。贪污炎症通常是由于同种免疫的反应。然而,单核细胞浸润的缺失反映了缺乏持续道供体皮肤内的炎症过程。因此,mhc i upregulation应该具体到宽容而不是alloimmunity的结果。我们已经知道mhc i表达的改变起到至关重要的一步免疫逃避的癌症或感染病毒的细胞通过自适应的调节t细胞细胞毒性(34和天生的NK细胞功能35]。大多数癌症(9)或感染病毒的细胞(10]表达下调mhc i逃离适应性t细胞细胞溶解。相比之下,耐多药人类癌症细胞系和黄病毒如丙型肝炎病毒可能上调mhc i与TAP1逃避先天NK细胞攻击建立多药耐药性(36和慢性丙型肝炎感染37]。鉴于NK细胞的关键作用在防御病毒感染,肿瘤,同种异体细胞(38),抑制NK细胞的细胞毒性的mhc i NK抑制性受体与配体的相互作用[39,40)可能与建立移植宽容和等待在未来进一步的实验说明。

5。结论

免疫耐受供体移植涉及生物修改的mhc i upregulation道内捐赠移植。这一生理现象很有可能是一个宽容设置生物标记的移植。更重要的是,它可能铺平道路,进一步研究未来移植耐受的机制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了资助nsc100 - 2314 - b - 182 - 101 - 2314 - 043和NSC - b - 182 - 093(陈Jeng-Chang)从国家科学委员会,台湾,和CMRPG4A0131(陈Jeng-Chang)从长庚医院,台湾。