文摘

我们比较如何测量乳素血浆蛋白(PAPP-A)和自由人类绒毛膜促性腺激素(f的β亚基β人类绒毛膜促性腺)母体血液中受到了不同采血方法,样本矩阵,和免疫分析平台。血清和干血滴(DBS)是通过静脉穿刺和19个孕妇的手指戳破。PAPP-A和fβhcg血清和DBS是衡量传统间接免疫测定AutoDELFIA平台,通过抗体微阵列。我们比较方法基于标记的复苏以及跨样本标记水平相关性。所有的方法比较显示标记浓度高的相关性。复苏水平的PAPP-A DBS下降了30%,而fβ人类绒毛膜促性腺从传统静脉穿刺血清DBS相比高出50%。经济复苏并不影响采血或免疫测定方法。标记的高相关系数表明,从指尖DBS可以可靠地在产前筛查环境使用,作为静脉穿刺的低成本和微创替代血清,以极大的物流优势。此外,抗体的使用数组将允许延长妊娠早期筛选标记的数量在孕产妇和胎儿的健康。

1。介绍

传统上,荷兰筛查唐氏综合症是由结合生化和超声波测试在妊娠前三个月。乳素浓度的血浆蛋白(PAPP-A)和绒毛膜促性腺激素(fβ在血清hcg)测量,而颈背的半透明超声厚度测量。孕龄的值归一化的多个值(妈妈)人口的影响。通常,全血静脉穿刺和旋转下来准备收集的血清在集合地点,血清在哪里存储在4°C到发货邮件。

两个fβhcg和PAPP-A适当稳定的常规筛查,及时提供血液分离,血清存储在冰箱温度,和运输时间维持在最低限度。检测到fβhcg水平与储存和运输时间增加,进一步加剧了这一效应增加温度(1]。fβhcg稳定性大大提高干血滴相比,血清中存储,而PAPP-A水平保持稳定(2]。可能,干血滴(DBS)是一个高级相比血清样本矩阵。此外,DBS集合允许使用指尖血,这是一个针对静脉穿刺的微创替代血清,并允许外部实验室集合,例如,在家里或在助产士的访问。这两个问题,指尖收集和DBS样本矩阵,有很大的物流优势,特别是在筛选设置低人口密度和当地的可用性实验室设备不足。因此,我们制定了比较血清样本和干血现货样品,收集通过静脉穿刺或手指戳破,建立是否获得浓度测量PAPP-A和fβ标准的收集和样本矩阵方法之间的比较。

此外,一些额外的参数是最近发现的潜在改善妊娠早期筛查非整倍性(例如,候选人PlGF, ADAM12,法新社,PP13,并抑制素)(3- - - - - -7),但也允许筛查不良妊娠结局。众所周知,PAPP-A、PlGF PP13是子痫前期的筛选标记,宫内生长受限(IUGR),和宫内胎儿死亡8- - - - - -12]。同时,参数产前筛查不规则的红细胞抗原和传染病在怀孕期间在妊娠前三个月最好测量。

当前测试方法需要额外的血清对于每一个标记,尽管另外方法是最近推出了允许多个标记测试小卷在手指戳破血清或DBS卷。抗体芯片是适合潜在港数十名生物标志物检测在同一个试验(13]。在先前的纸,我们表明,静脉血清PAPP-A和f之间有很好的相关性β标准浓度测量AutoDELFIA分析仪和抗体阵列(14]。在这项研究中,我们调查了少量的样本是否从指尖和DBS收集结合抗体阵列免疫测定平台适用于妊娠早期筛查。

2。方法

2.1。研究设计

19在第一次怀孕三个月孕妇被要求参与这个实验作为研究的一部分关于标记水平纵向变化的血。本研究方法是科学伦理委员会批准的“乌得勒支大学医学中心(METC乌特勒支),荷兰(协议编号:07 - 222)。本文所有参与妇女给书面知情同意参加这个纵向研究。

2.2。血液采样

样本收集2011年5月至10月间举行。血液收集的静脉穿刺(5毫升)和手指贴(0.5毫升)的所有人。获得血的手指,手简要热身下温水和酒精清洗,后用手指粘针是用来获得血液。血液被收集到一个超小型电子管的手指没有施加压力。直接采血后,几滴50μL两种方法获得的全血被发现到一张滤纸(seppo公司seppo 226年,芬兰赫尔辛基)的塑料吸管产生斑点直径1厘米,被允许在室温下晾干3小时(RT)。血清的制备、血样留给凝结为15 - 30分钟RT和离心机RT 10分钟2000 g。血清样本和干滤纸卡片是储存在−80°C到分析。

2.3。AutoDELFIA分析

分析PAPP-A和fβhcg进行在一个1235 AutoDELFIA分析仪运行,使用一个自动dissociation-enhanced镧系荧光免疫测定(AutoDELFIA;PerkinElmer,图尔库,芬兰)。分析PAPP-A和fβ人类绒毛膜促性腺在星展银行,一个3毫米点打到96 -手动孔板。分析是根据制造商的指导方针。简单地说,蛋白质在150年被筛选了3小时μL的缓冲与anti-PAPP-A井预镀和fβ促性抗体。孵化后,缓冲区和纸过滤磁盘吸气,井洗6次。PAPP-A和fβ人类绒毛膜促性腺量化使用浓度(欧盟)和钐铕(Sm)示踪标记抗体。示踪剂的离解后抗体和标签和欧盟和Sm的螯合离子,欧盟和Sm标签的数量是衡量激发与发射光的波长340纳米的激光和检测610和650海里,分别。

2.4。抗体阵列生产

捕获抗体鼠标反PAPP-A 10 e1(疯狂的,图尔库,芬兰)和鼠标反人类绒毛膜促性腺β7(阿克利抗体GmbH, Herford,德国)在2 x蛋白稀释数组缓冲区(绘画纸,肯特,英国)的浓度为1毫克/毫升为anti-f anti-PAPP-A和0.5毫克/毫升β人类绒毛膜促性腺。抗体被发现在16-array硝基FAST-slides(绘画纸)使用Piezorray非接触芯片系统(PerkinElmer,韦尔斯利,妈,美国)。两滴/位置,估计有330的pL /下降,被发现在湿度低于40%。四个复制每个抗体的排列,以确保足够的统计数字。幻灯片被存储在一个干燥器内阁(耐尔根,罗切斯特,纽约,美国)。PAPP-A和f标准β人类绒毛膜促性腺AutoDELFIA包了。这些标准是校准与国际参考准备(SP1 PAPP-A: 78/610, fβ人类绒毛膜促性腺:75/551)。

2.5。抗体阵列分析

分析PAPP-A和fβ人类绒毛膜促性腺在星展银行,两个6.35毫米(1/4英寸)磁盘穿孔管有120μL PBS, 0.5% Tween-20(热费希尔科学Surfact安培20日,罗克福德,美国)。磁盘在摇晃中筛选了45分钟在500 rpm。与洗出液过滤磁盘被转移到棉签提取管系统(罗氏应用科学,德国)和离心10分钟2200 g。数组被封锁在100年μL蛋白质阵列阻断缓冲区(绘画纸),随后与90年孵化μL(1: 10稀释血清,筛选了DBS或汇集PAPP-A和fβ标准的标准。数组是洗(PBS, pH值7.4,0.05%的渐变,Sigma-Aldrich)和孵化的混合生物素化的山羊反PAPP-A(1: 100年,研发系统、明尼阿波利斯、锰、美国)和生物素化的鼠标反人类绒毛膜促性腺28 a4(1: 250年,疯狂的)检测抗体。孵化后稀释DyLight649-conjugated链霉亲和素(1:500年,杰克逊ImmunoResearch实验室、西树林,PA,美国)数组被去离子水清洗和真空干燥。

2.6。数据提取、数据分析和统计分析

数组和一个共焦扫描芯片扫描仪的分辨率(PerkinElmer) 10μm。ScanArray表达软件V4.0 (PerkinElmer)是用来量化每个地方使用自适应圆的强度的方法。纠正每个点的平均强度值(中等强度-当地平均背景)被用于进一步分析。中等强度值的四个复制点计算使用Microsoft Excel。参数拟合进行了统计计划””(http://www.r-project.org/),基于参数逻辑日志(4 pl)模型(15]。

使用Passing-Bablok回归浓度做了比较。值> 0.90被认为是表明相似的浓度。

3所示。结果

3.1。人口特征

当前标记PAPP-A和fβhcg血清浓度和全血干点,获得19个单例妊娠,测定和比较。母亲的年龄中位数为33年(范围:25-41),中位数产妇体重70公斤(范围:57 - 110公斤),和妊娠年龄中位数是88天(范围:76 - 97天)(1)样本在10周,1周11日12日在第12周,和5周13)。

3.2。收藏:手指与静脉血清

血清收集从静脉或手指并不影响PAPP-A和fβ人类绒毛膜促性腺浓度(图1)。PAPP-A和f的相关性β线都是(数据1(一)和1 (b)、职责),平均回收率分别为103%(表1)。

3.3。样本矩阵:血清和星展

fβ促经济复苏增加DBS血清存储相比,对应之前的数据16]。这是独立于静脉(156%)或手指起源(151%)(表1)。PAPP-A少显示复苏DBS样本矩阵对静脉和指尖血,显示经济复苏静脉DBS的71%和67%的手指DBS(表1)。星展银行和手指之间的相关性血清标记(图> 0.942)。此外,比较不同采血方法以及样本矩阵显示类似的定量性能在所有四个条件,PAPP-A(见补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/509821)以及fβhcg(补充图2)总结,结果表明,手指和静脉收集和标记允许血清和DBS矩阵。

3.4。抗体阵列平台

抗体阵列平台允许并行分析多个标记,用类似于AutoDELFIA阵列的性能,如我们之前所示文献[14]。在这项研究中,研究使用抗体阵列筛选试验的可行性,我们第一次开始证实量化性能显示AutoDELFIA本文前面,也就是说,在样本收集和样本矩阵,当抗体阵列平台上相应的样本进行了分析。之间的相关性血清与DBS静脉血清和手指与手指血清,分别总是> 0.9时衡量抗体阵列平台(补充图3)。此外,这些相关值使用AutoDELFIA类似决定。后者比较的斜坡下降为f PAPP-A和增加β人类绒毛膜促性腺。这也对应于不同的复苏发现使用AutoDELFIA平台(表1)。

3.5。抗体阵列与AutoDELFIA

除了在抗体阵列(即测试一致的性能。,within a platform), we expanded the comparison of AutoDELFIA versus antibody array (i.e., across platforms) to the four blood collection and sample matrix methods mentioned above (vein-serum, vein-DBS, finger-serum, finger-DBS). Using current samples on two platforms, we find that the four pairwise comparisons give consistent correlation值> 0.9(数字3和4)。

有趣的是,我们还发现,手指之间的比较血清抗体阵列和静脉血清AutoDELFIA产生了关联PAPP-A和f值> 0.9β人类绒毛膜促性腺(图5)。这表明组合改变血液收集、样本矩阵,和免疫分析平台不妥协筛查试验的整体性能。

最终,手指DBS将允许提高物流包括扩展生物标记的数量结合使用时数组平台。手指DBS结合数组平台显示高相关性DELFIA平台使用当前使用静脉血清样本(图5)。PAPP-A的平均回收率和fβ血清hcg手指DBS相比传统静脉穿刺复苏总结表1。

4所示。讨论

本研究的目的是比较两种方法对采血(静脉穿刺和指尖)和两个样本矩阵(血清和DBS)可以用于产前筛查。此外,我们比较两种免疫分析平台(AutoDELFIA和抗体阵列)描述的性能潜力multimarker平台未来的产前筛查的目的在妊娠前三个月。特定的工作目的是并行执行多个方法比较,这样不仅成对方法比较是可能的,但是我们也可以给多个同时方法论的可行性理论水平在产前筛查环境变化,如从传统静脉血清分析AutoDELFIA抗体的手指戳破了DBS分析数组(图5)。

关于血液采集,我们展示PAPP-A浓度和fβhcg血清中从静脉血清中抽样相媲美的手指刺破血。

样本矩阵的选择影响着蛋白质回收和储存稳定性。关于后者,它显示了考恩夫妇等。2)fβ血清促稳定在DBS相比大大提高存储。至于蛋白质复苏,我们表明,该静脉和手指戳破收集类似,但是干血滴的复苏是高出大约45%。PAPP-A复苏比血液在星展银行低30%,独立于静脉或手指的起源。不同的恢复或数量相比,DBS血清可能是由于测量在星展银行实际上是测量在血液和血清。这个星展银行和血清的区别是前面所述,归因于fβ促性单元释放的离解hCG血清发生血液的速度比(2,16]。另一方面,类似离解的PAPP-A heterotetrameric和MBP会导致复杂的构象变化和降低试验的检测抗体(2]。应对在筛查是准备单独的数学方程之间的关系妊娠年龄和血液浓度测量中值点(17)和适应风险计算算法考虑人口分布参数的差异(2,16]。因此,正如一个样本矩阵,血清和DBS合适(计算适合实验室应用协议)提供与星展银行提供后勤和贮存稳定性的优势。

第三,我们表明,这些浓度测量与传统AutoDELFIA技术相媲美与抗体阵列分析测量。当前传统静脉血清AutoDELFIA测试显示高相关性的手指DBS决心数组当前唐氏综合症的标记。

所有的比较在这项研究中,我们发现高与浓度之间的线性相关性测量扩展在浓度范围早期妊娠的产前筛查的代表。

综上所述,本文的研究结果发布大量筛选的可能性在妊娠前三个月使用生化标记。而不是静脉穿刺,一根手指戳破可以用来获得血清或星展。而不是4.5毫升管,只有microvial邮寄样品到实验室就足够了。指尖结合星展也将在抽样和运输成本更低。星展银行会给比保存在运输的额外优势。使用DBS抗体阵列允许扩展的标记集(或小血卷),例如,与其他预断结合DS测试或其他不良妊娠结局。

更广泛的实现方法设想在这个概念验证文章,然而,需要使用更多的样本和multilaboratory比较验证。这些将用来确定适应数学关系标记水平和胎龄(基于试验方法以及其他实验室环境温度等因素),以及评估量化性能。

5。结论

总之,我们表明,定量PAPP-A和f的性能一致β促性测量在血液采集、样本矩阵和免疫分析平台允许改善样品物流和筛查。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

珀斯洛杉矶彭宁斯j .和杰奎琳·e·Siljee这项研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

作者要感谢Gert-Jan Godeke实际支持和Jose Ferreira统计支持。

补充材料