文摘
氧化应激(OS)和生产的,由内皮一氧化氮合成酶(以挪士),参与勃起功能障碍(ED)的病理生理学。此外,操作系统导致修改的红细胞(RBC)等离子体膜的理化性质和酶的含量相同的膜。由于他们的角色在早期信号膜OS-related病理改变,人类红细胞数质膜和胞质glycohydrolases已经被提议作为新的标记细胞的操作系统。在加拿大皇家银行,NOS可以激活和不激活磷酸化、糖基化。O -在这种监管机制β-N-AcetylGlucosaminidase是一个关键酶。细胞水平的O-GlcNAcylated蛋白质相关操作系统;因此功能失调以挪士O-GlcNAcylation似乎有至关重要的作用。阐明RBC glycohydrolases之间可能存在的相关性和操作系统,等离子体氢过氧化物和抗氧化防御(滞后时间),胞质O -β-N-AcetylGlucosaminidase,胞质膜己糖胺酶、膜β-D-Glucuronidase,α-D-Glucosidase研究了39 ED患者和30控制。ED学科氢过氧化物和质膜glycohydrolases活动显著增加而滞后时间值和胞质glycohydrolases活动明显减少。这些数据证实了强大的操作系统状态在ED患者的角色研究glycohydrolases OS早期生物标志物和建议他们可能使用特定的标志ED患者,尤其是在那些接受营养/药理抗氧化治疗。
1。介绍
勃起功能障碍(ED) (1)被定义为无法实现或维持勃起的阴茎在性交过程中。虽然ED是一个多因素的过程,阴茎动脉血管疾病是一个重要原因在80%的情况下2]。阴茎勃起的结果从不同的生理系统的交互涉及中央和周围神经系统和内皮细胞和血管平滑肌细胞的全集海绵体(3]。越来越多的研究人员的兴趣的作用氧化应激(OS)在ED的病理生理机制4]。阴茎血管功能的障碍与勃起功能障碍在各种血管疾病或有强烈的氧化应激,包括糖尿病(5]。OS是失衡的直接后果的生产活性氧和活性氮物种(ROS和RNS)和细胞内的抗氧化防御系统。
众所周知,操作系统导致理化性质和酶活性的变化6红细胞的等离子体膜。
Glycohydrolases催化特定的水解糖苷在天然苷或glycoconjugates联系。他们无所不在地分布,主要位于溶酶体,和被发现在其他细胞内囊泡与酸性矩阵,在等离子体膜、胞质,和血浆(7,8]。质膜和胞质glycohydrolases,即己糖胺酶(十六进制),β-D-Glucuronidase (GCR),α-D-Glucosidase (α-GLU)和O -β-N-Acetyl-glucosaminidase (O-GlcNAcase),也被发现在人类红细胞(9,10]他们有一个角色在早期信号膜改变(6),在病态与强烈的氧化应激有关,如2型糖尿病(11)或唐氏综合征(12,13]。由于这些原因他们使用新标记细胞氧化应激的建议(6,13,14]。
特别是,O-GlcNAcase nuclear-cytoplasmic酶,最近发现在红细胞质膜(10),首次克隆和表征盾和哈特(15]。一起O-GlcNAc转移酶(油气痕迹),O-GlcNAc ase的动态过程中扮演着重要角色O-linkedβ-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc)蛋白质16]。一大群胞质及核蛋白质携带单残留O-linked GlcNAc并接受功能修改后插入或超然GlcNAc [17]。在这样的大赛,O-GlcNAcase有着至关重要的作用的规定没有生产(不可能是阴茎勃起的主要神经调质(18])代理监管周期O-glycosylation /磷酸化的具体残渣Ser 1177内皮一氧化氮合成酶的活性部位(以挪士)。
最近的一项研究表明,在人类红细胞(RBC)号(RBC-NOS)存在,像以挪士一样,可以在同一特定站点(磷酸化、糖基化的19),其激活是由流体剪切应力刺激和诱导血管内皮生长因子信号。因此,考虑到RBC-NOS在生产中的作用[20.)和最近提出RBC-NOS释放没有在剪切应力的作用[21,22),也可以假设RBC-NOS可能在海绵平滑肌松弛作用。此外,最近的研究显示没有通路的损害红细胞与没有合酶活动的减少病态与强氧化应激有关,例如,冠状动脉疾病(23,24]。
因此我们测量上述酶活性在膜和胞质ED患者的红细胞来评估其可能参与ED和他们可能使用马克氧化应激和监控患者接受抗氧化治疗(25]。
2。材料和方法
2.1。主题
39 ED患者,他们招募了52.9±10.6岁u.o圣保罗大学的男科学医院、米兰、意大利。控制30成年男性志愿献血者,50.1±5.9岁的意大利血志愿者协会(AVIS)在米兰,意大利。这次调查符合赫尔辛基宣言中概述的原则。签署知情同意书之前获得所有受试者参与研究。没有道德的批准是必需的,因为不需要额外的血液是在这项研究中,这是彻底解释所有的病人。这个过程已经被接受由几个期刊(26]。
勃起功能的评估在一个适当的临床检查研究和利用的删节five-item版本国际勃起功能指数问卷(IIEF-5),验证,自报问卷(27];所有受试者分类与勃起功能障碍(IIEF = 13±5)。所有受试者选择基于以下排除标准:冠状动脉疾病、糖尿病、高血压、恶性肿瘤、肾功能衰竭、充血性心力衰竭、系统性炎性疾病,或心脏心律失常。
2.2。材料
商业化学品是可用的最高等级。水经常使用新鲜再蒸馏的玻璃仪器。牛血清白蛋白(BSA), CuSO41 6-Diphenyl-1 3 5-hexatriene(衰变时),其阳离子衍生物1 - [4 - (trimethyl-amino)苯基]6-phenyl-1, 3, 5-hexatriene (TMA-DPH) 4-Methylumbelliferone (MUB),α- - -β苷、用作酶底物和N-Acetyl-D-galactosamine (GalNAc)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。MUB,购买从丙烯酰胺GmbH(书、瑞士),乙醇重结晶三次。
d-ROMs装备测试从Diacron购买国际(格罗、意大利)。
2.3。血液红细胞的取样和制备膜和胞质分数
从肝素化静脉血液红细胞和血浆的准备。总之,收集后,血液样本立即离心机15分钟在3000g和等离子体立即撤回并储存在−20°C到进一步化验。淡黄色的外套,送气音从颗粒的表面,都被丢弃和剩余材料稀释(1:1,v / v)与磷酸缓冲溶液(PBS) pH值7.4和过滤Leucostop 4 lt-b过滤器(巴克斯特Spa、德娄·米兰多拉,摩德纳,意大利)为了消除所有的血小板和白细胞污染物。过滤材料,只包含红细胞,离心5分钟在1200g和颗粒被(1200年的两倍克每5分钟)和PBS pH值7.4,立即用于鬼准备。启封鬼膜准备在4°C的方法Steck康德(28),采用低渗的治疗(从5.0到1.25更易与L PBS, pH值8.0)。胞质是通过池的三个浮在表面的张力减退的治疗启封鬼膜的制备。
2.4。酶化验
以下glycohydrolases化验了microfluorimetric方法利用4-MU-glycosides方法后的基板和Goi et al。9]:O-GlcNAcase(提到过3.2.1.169),十六进制(提到过3.2.1.52)、GCR(提到过3.2.1.31)α-GLU(提到过3.2.1.20)。简单地说,50μL(红细胞质膜或胞质分数,根据需要稀释,孕育了250年第四卷μL包含25μL 50更易与L柠檬acid-sodium磷酸缓冲在适当的pH值,和175年μL的特定的底物溶解在水中。混合物被孵化瓶浴在37°C的建立时间。反应停止,荧光由增加750μL碱性溶液(0.2 mol / L glycine-NaOH缓冲区,包含0.125 mol / L氯化钠,pH值10.75)。控制孵化混合物(空白)建立使用孵化混合物没有红细胞样本,分别是孵化并添加之前立即停止反应。确定O-GlcNAcase的活动,只有积极向GlcNAc衍生品使用的测定4-MUB-N-acetyl -β-D-glucosaminide作为衬底,在GalNAc(50更易/ L)己糖胺酶的竞争性抑制剂和己糖胺酶B (29日]。酶活性在质膜和胞质表达μU /毫克的蛋白质和μ/毫升,分别。蛋白质含量是由洛瑞的方法等。30.),使用水晶牛血清白蛋白作为标准。
2.5。质膜荧光各向异性
我们评估了碳氢化合物的膜流动性的核心和磷脂头部区域的组织通过测量,分别衰变时的稳态各向异性和TMA-DPH姚什科fp - 770荧光光谱仪,以下的方法Cazzola et al。31日]。衰变时和TMA-DPH探针在波长340 nm,兴奋和发射波长被设定为420海里。样本然后兴奋与垂直偏振光和我们测量发射光的强度,垂直(Iv)和横向(Ih)极化对令人兴奋的光。各向异性计算方程,在那里膜流动性负相关。
2.6。评价血浆过氧化反应和等离子体氧化平衡
等离子体氢过氧化脂质(ROS)水平测定colorimetrically根据Trotti et al。32),表示为H2O2等价物。
引起的等离子体氧化的动力学,增加0.5 CuSO4,测定37°C通过监测荧光在430纳米的发展,激发设定在355 nm描述Cervato et al。33从PerkinElmer] Multilabel计数器Wallac 1420。这种方法允许过氧化反应动力学的评估监控后荧光加合物的形成来自醛的反应(来自铜所推行的脂质过氧化作用+ +绑定到载脂蛋白)和氨基酸组血浆蛋白和/或磷脂。动能表示的曲线可分为初始延迟阶段,其次是第二个传播阶段。初始延迟阶段(滞后时间,表示在几分钟内和计算的线性回归的拦截传播阶段与延迟阶段)是脂蛋白抗过氧化作用的一个索引。
2.7。统计分析
测试Kolmogorov-Smirnov显示从正态分布的数据无显著差异。因此参数的技术。意味着用单向方差分析比较(方差分析)。所有使用SPSS统计分析22包(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。
3所示。结果
的临床和代谢参数研究的实验对象报告称,在桌子上1。所有的参数评估的参考范围,在控制和主题。
等离子体氢过氧化物水平和等离子体对过氧化(滞后时间)报道,在图1。正如所料,氢过氧化物的ED患者(平均水平SD:;(范围:20.2 - -36.0))(+ 15%)高于对照组(;(19.2 - -29.7))。所需的时间流逝的总抗氧化防御系统等离子体抑制过氧化过程显著(滞后时间)低(−15%)ED患者(116±16;(89 - 145))比对照组(135±20;(110 - 168))。
在图2荧光各向异性分析(红细胞膜的报道。衰变时调查显示ED患者之间没有显著差异(0.185±0.004;(0.178 - -0.192))和对照组(0.1870.007;(0.171 - -0.196));一个类似的模式是紧随其后的是TMA-DPH探针ED患者之间无显著差异(0.231±0.004;(0.225 - -0.240))和对照组(0.234±0.010;(0.217 - -0.251))。而不是膜结合酶活动的glycohydrolases,图2在ED,明显高于控制:十六进制(+ 27%)(ED患者:58.1±14.9;(27.9 - -93.1);对照组:45.7±20.0;(19.8 - -71.2));GCR(+ 22%)(ED患者:539.3±126.7;(315.8 - -893.7);对照组:441.7±175.1;(190.2 - -768.6));和-GLU(+ 36%)(ED患者:269.8±71.2;(141.4 - -424.4);对照组:198.3±50.3;(109.7 - -317.8))。
胞质十六进制和O-GlcNAcase活动,显示在图3,ED患者明显低于控制:十六进制(−39%)(ED患者:31.3±10.4;(11.5 - -55.6);对照组:51.6±26.8;(18.3 - -99.7))和O-GlcNAcase(−33%)(ED患者:21.0±6.8;(6.9 - -37.9);对照组:31.0±17.4;(11.7 - -59.9))。
4所示。讨论
最近的研究强调了氧化应激的作用在ED引入的概念作为自由基相关的氧化应激损伤阴茎神经病变(34]。它也是众所周知,不,来源于内皮和神经来源,扮演一个重要角色在勃起的早期阶段3,18,35]。因此一氧化氮之间的相互作用,合成了以挪士,和活性氧物种已被建议作为最重要的一个机制涉及的病理生理过程ED (36]。
对于没有生产一个新的视图提供的最近的观察,许多胞质及核蛋白质携带单残留O-GlcNAc并接受功能修改根据存在或切除氨基糖(17]。特别是,以挪士是被磷酸化激活在ser - 1177,通过phosphatidylinositol-3-kinase / Akt /以挪士[37),灭活磷酸盐的去除和成瘾的O-GlcNAc油气痕迹残留在同一网站(38]。通过交谈,O-GlcNAc残留物,催化了O-GlcNAcase,允许磷酸化ser - 1177和以挪士的激活。已经证明,人类红细胞表面表达积极和功能endothelial-type以挪士,本地化的质膜和细胞质19]。
此外,有越来越多的证据表明,活性氧的产量增加导致的增加O-GlcNAcylation水平(39];因此,它是合理的假设一个新兴的角色失调O-GlcNAcylation /蛋白质磷酸化在ED。
因此,我们决定进行一个研究一群ED患者旨在确定可能的膜结合关系和胞质glycohydrolases内容和早熟改变由于氧化应激。
评估操作系统我们用经典方法(等离子体氢过氧化物含量和膜流动性测定)和抗氧化防御系统的总滞后时间测量方法(33]。这种分析方法是有用的预后指数原生质的过氧化反应风险的患者中氧化病态(如糖尿病、癌症、高血压、唐氏综合症、慢性肾功能衰竭)(13,40),是一种有效的工具来监控抗氧化剂治疗的影响(25]。
我们发现一些有趣的问题。首先,评估等离子体氢过氧化物和滞后时间(图1)确认以前的观测显示,ED患者氧化应激的条件(26)重叠著名的操作系统状态患者的其他疾病(40]。关于过氧化反应参数,一个有趣的问题是教育学科红细胞膜流动性的观察病人和控制(图之间没有显著差异2)。
此外,化验的活动在红细胞glycohydrolases等离子体膜确证的证据产生的等离子过氧化反应参数。事实上,更高层次的这些膜酶ED患者遵循一个非常类似的模式已经观察到在唐氏综合症患者(13),特点是高水平的氧化应激,并对酶的模式出现在空军特技飞行员,已知在一篇出色的氧化状态(14]。这个场景中,也考虑到类似的流动性水平ED患者和对照组之间的膜,可以提供进一步支持这些膜的作用glycohydrolases膜早期信号改变之前,他们变得明显在跨膜整体水平和使用荧光探针检测,显示在图2。
最后,两个化验的行为glycohydrolases红细胞胞质,己糖胺酶和O-GlcNAcase经历显著减少ED患者相比控制(图3)。这种模式非常类似于观察唐氏综合症患者(13),相反,在空军特技飞行员(14),它刺激我们进行进一步的调查研究在深度和澄清的关系(据我们所知,尚未被理解)胞质十六进制和氧化应激之间的关系。
特别感兴趣的是O-GlcNAcase的行为。正如前面提到的,O-GlcNAcylation复杂的信号网络中扮演着关键角色参与调节细胞生理和病理的反应压力刺激(41]。我们可以合理地假设观察到显著减少胞质O-GlcNAcase ED患者导致更持久O1177年以挪士Ser -GlcNAcylation残留,因此执行关键的假设RBC-NOS /以挪士参与阴茎勃起的机制。
5。结论
我们的数据提供进一步支持ED患者的氧化应激所扮演的角色,强调诊断的潜力研究红细胞glycohydrolases,氧化应激的早期生物标志物。我们的数据也提供分析支持监测抗氧化剂治疗的疗效,旨在纠正氧化应激(42]。
此外,考虑到,虽然间接地增加了糖基化的数据显示一个场景,也需要额外的研究来证实和更好的定义所扮演的角色的抑制红细胞O-GlcNAcase RBC-NOS活动以及随后未能增加体内海绵体的血液流量。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。