评价分子种类的前列腺特异性抗原与免疫球蛋白M在前列腺癌和良性前列腺增生

文摘

本研究旨在定义分子种类的前列腺特异性抗原(PSA)与免疫球蛋白M (IgM)免疫复合物。有记住的oligoreactivity IgM及其对碳水化合物抗原的偏好,有可能,它可以选择性地识别已知的PSA glycoisoforms。PSA-IgM复合物和游离PSA分数与血清分离的主题与前列腺癌(PCa)和良性前列腺增生(BPH)通过凝胶过滤和片上immunoaffinity和离子交换色谱法。PSA-immunoreactive物种被发现应用表面增强激光解析及电离飞行时间质谱分析。获得的蛋白质和多糖成分的光谱进行了分析。分子种类的PCa PSA的一般模式和良性前列腺增生前列腺特异性抗原复合物与IgM相似。它由主要的山峰在17 kDa,小峰28 kDa,对应于整个糖化PSA成熟。主要的区别是不完全的存在糖化26.8 kDa的物种,在假定的paucimannosidic结构,在PCa PSA-IgM观察,但不是在BPH PSA-IgM。PCa特征PSA-IgM改变姿势糖基化的问题可能的作用作为一个框架,用于免疫监测和可能感兴趣的根据最近的数据表明mannose-containing聚糖作为癌症生物标志物。

1。介绍

工作领域的生物标志物研究指出循环免疫复合物的存在作为一个小说类的肿瘤标志物诊断潜在可比或大于相应的免费的生物标志物。它们包括biomarker-immunoglobulin米(IgM)复合物,被发现在一些肿瘤疾病,如结肠癌、肝、和前列腺癌1- - - - - -3]。尽管他们应该是一个有价值的辅助鉴别诊断,这种复合物的生物意义尚未阐明;也就是说,它不知道是否有什么生理作用。此外,从生物化学的角度来讲,没有深入了解其组成的结构性能的分子被IgM。

前列腺特异性抗原(PSA),一个著名的肿瘤标志物前列腺癌(PCa),发现包裹着IgM在良性前列腺增生(BPH)和癌症3]。一般来说,PSA包括异构分子不同的一级结构和多糖成分。结构性变化在血清PSA形式存在,精浆,增生性或癌组织(4- - - - - -6]。因此,使用不同的实验方法,30多个免疫反应性的glycoisoforms分子质量从6 - 35不等kD分离血清,精浆,或前列腺组织7- - - - - -12]。调查的结构异质性PSA透露,一些不同的形式更频繁地与PCa与良性前列腺增生(13- - - - - -15]。例如,一些亚型的前兆或pro-PSA特定癌症,而其他内部裂解或擦痕(多链)PSA亚型特点对良性前列腺增生(16,17]。

本研究旨在补充现有数据在PSA-IgM定义分子种类的PSA在循环免疫复合物。有记住的oligoreactivity和多价IgM及其对碳水化合物抗原的偏好,有可能,它可以选择性地识别已知的PSA glycoisoforms [18,19]。除了癌症检测的临床意义,这可能是基本的重要性,因为肿瘤相关抗原,免疫监视的目标(20.,21]。

循环PSA-IgM复合物凝胶过滤分离的主题与BPH和PCa受到芯片上使用单克隆抗体anti-PSA immunoaffinity剖析。发现分子物种随后分析蛋白质和多糖成分和相对于建立PSA形式。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

单克隆抗前列腺特异性抗原抗体,克隆8 a6(识别抗原决定基I),从沪元购买测试(芬兰图尔库)。单克隆抗体anti-PSA,克隆8311(认识到自由和PSA复合体形式),是从Medix加压(Kauniainen、芬兰)。Sephacryl s - 300是来自法玛西亚生物技术(乌普萨拉,瑞典)。碱性phosphatase-conjugated反IgM病毒研究所和对硝基苯磷酸盐(PNPP) \ Serion GmbH德国维尔茨堡。广泛sds - page分子质量标准和银染色设备买来Bio-Rad(美国大力神,CA)。ProteinChip: PS20 (preactivated表面),Q10(强阴离子交换剂),CM10(弱阳离子交换剂),sinapinic酸,ProteinChip一体化的蛋白质标准II来自Bio-Rad(美国大力神,CA)。Microwell盘子来自NUNC(鲁开德、丹麦)和star-bottom管来自Spektar(Čačak,塞尔维亚)。IgM浓度决定使用一个IgM掉装备(INEP,塞尔维亚)。总PSA (tPSA)和自由PSA (fPSA)量化使用适当的商用厄玛PSA检测(INEP,塞尔维亚)根据制造商的指示。

所有其他化学试剂级。

2.2。血清样本

血清样本对象与良性前列腺增生(BPH)和前列腺癌(PCa)在INEP,泽蒙,PSA测定作为跟踪的一部分,据当地获得道德标准(文档GSP / 05和PR030/09 INEP机构委员会批准)。诊断被证实使用临床建立协议基于PSA水平,身体检查,超声检查和活检。PCa血清样本来自病人诊断为局部晚期和先进的癌症。

个体的血清样本18 PCa和BPH患者被随机使用(反映内在异质性)形成三池(每个)。PSA浓度范围的PCa池15.6 -776μg / L;35.4 - -987.2μ-3063.3 g / L和20.7μg / L。BPH池的PSA浓度范围是0.8 - -5.1μg / L;0.4 - -2.5μ-5.1 g / L和0.3μg / L。

2.3。通过凝胶过滤分离PSA-IgM复合物

PSA-IgM复合物分离与轻微的修改(如前所述3]。血清样本(400μL)应用于Sephacryl s - 300列(1.3×25厘米)平衡与0.05 PBS, pH值7.2,筛选了相同的缓冲和1毫升收集分数。PSA-IgM或PSA检测的预期分数,用固相分析固定化单克隆anti-PSA抗体。Antibody-coated管(1.2μ每管g)是由物理吸附,一夜之间在4°C。洗后用0.05 PBS, pH值7.2,与0.5%的酪蛋白3 h管被封锁37°C和冲洗一次。

(一)凝胶过滤分数(分数1 - 20)被添加(100μL)涂层管和孵化4 h在室温下(RT)。与0.05 PBS洗涤三次后,pH值7.2,碱性phosphatase-conjugated反IgM (100μL)添加和孵化2 h RT。

的共轭洗,100μL (pNPP衬底的解决方案是补充道。与100年的反应就熄了μ30分钟后L 1 M氢氧化钠。吸收是1420年以405海里使用Wallac multilabel计数器(珀金埃尔默,蒙扎,意大利)。分数包含PSA-IgM集中,用于进一步分析。

并行,总发现IgM在空白凝胶过滤体积分数直接固定在聚苯乙烯microwell盘子,使用碱性phosphatase-conjugated反IgM,如上所述。

(b)探索了PSA添加相应的凝胶过滤分数(100μL分数外墙面)anti-PSA涂层管与碘化anti-PSA同时孵化后抗体(300000 cpm /管),一夜之间在rt,洗涤步骤之后,结合放射性检测在1470自动Wallac向导γ计数器(美国沃尔瑟姆珀金埃尔默)。fPSA最高分数集中,用于进一步分析。

2.4。免疫电泳

IgM的样本或PSA-IgM制剂(10μL)受到免疫电泳1%琼脂凝胶为1.5 h在4°C。提纯羊反IgM (INEP,泽蒙,塞尔维亚)是用于检测。

2.5。分析片上Immunoaffinity PSA-IgM复合物的色谱法

PSA分数(PSA-IgM或fPSA)凝胶过滤分离的异形使用片上固定单克隆anti-PSA抗体,所述[12]。

相应的抗体(5μL)应用到每个点的preactivated在潮湿的表面蛋白芯片阵列和孵化室一夜之间在4°C。点与5洗了三次μL (0.05 PBS, pH值为1分钟7.2 RT然后阻塞0.05 Tris-HCl, pH值8.0缓冲区1 h RT,洗后在潮湿的房间三次使用相同的程序,5μL(检查样本添加到每个点和孵化在潮湿的室2 h rt,斑点的再次冲洗三次0.05 PBS, pH值7.2,与去离子水的两倍。所有程序包含摇(150 rpm)。干燥后,1μL 50% sinapinic酸乙腈/ dH₂O /三氟乙酸(50% / 49.9% / 0.1%)被添加到每个地方,晒干,然后重新应用。非特异性结合使用IgM(图监控1,分数10)控制样本。

分析了蛋白质芯片表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF / MS)使用ProteinChip读者,4000系列,个人版(Bio-Rad)。光谱都是在25 kV正离子收购模式,-300年质量范围2.5 kDa,每点8815激光枪。激光的能量是6000新泽西。ProteinChip一体化蛋白II用于校准标准。所有的光谱进行了分析使用Ciphergen表达软件3.0(美国Bio-Rad大力神,CA)。

2.6。芯片上的离子交换色谱分析自由PSA的形式

注册的地方分成四份铵组(Q10、强阴离子交换剂)或羧甲基组(10厘米,弱阳离子交换剂)prewetted 5的两倍μL 0.05 Tris-HCl, pH值8,在rt, 5分钟后删除预湿缓冲区,5μ检查样品的L (BPH fPSA或PCa fPSA)被添加到每个点和孵化为1.5 h在rt,斑点的潮湿室与0.05 Tris-HCl冲洗三次,pH值8,与去离子水的两倍。所有步骤包括摇(300 rpm)。干燥后,1μL 50% sinapinic酸乙腈/ dH₂O /三氟乙酸(50% / 49.9% / 0.1%)被添加到每个地方,晒干,然后重新应用。分析了蛋白质芯片如上所述。

3所示。结果

3.1。通过凝胶过滤分离PSA-IgM复合物

代表PSA-immunogram,揭示典型的微分洗脱职位的主要血清分数,如图1。PSA-IgM (b)是筛选了总数的后缘IgM峰值(a),推导出其洗脱位置和immunoelectrophoretic外观(数据未显示),PSA-immunoreactivity IgM的复合物似乎部分与低分子质量IgM有关。凝胶过滤的几个人的汇集PCa和BPH血清PSA-IgM山峰没有显著差异,但PSA-ACT (c)和fPSA (d)的峰值在良性前列腺增生要低得多,如预期。

3.2。片上Immunoaffinity PSA-IgM复合物的色谱法

PSA-IgM准备进一步汇集PCa和BPH血清芯片上immunoaffinity色谱法,来确定PSA形成免疫复合物。fPSA并行分析了分数作为参考。

典型的质谱PSA-IgM准备从良性前列腺增生和PCa血清,异形使用anti-fPSA抗体,在图所示2和表1。一般的模式相似,包括主要山峰17岁kDa和28 kDa。的主要区别是26889.27的Da物种在PCa PSA-IgM缺席BPH PSA-IgM。这是双重带电离子,可能与它的结构属性。26.8 kDa的物种相比,观察小峰在15.8 kDa或16.0 kDa分子质量并不认为是密切相关的差异。除了anti-fPSA抗体,anti-PSA抗体,包括免费的和复杂的形式,也用于片上色谱法。类似的光谱得到但特定峰的强度和频率略有不同。然而,这并没有另外有助于分离和个人特征的PSA(数据没有显示)。

包裹着IgM PSA-immunoreactive形式,在BPH和PCa、重叠的分子物种fPSA分数的质谱(图中观察到3)。集群在28 kDa PCa PSA-IgM(图都很常见2(一个))和PCa fPSA(图3(一个)),而15.8 kDa物种在PCa相比fPSA PCa PSA-IgM更加丰富。

至于BPH, fPSA分数显示更受限制的模式与主要形式Da(图28244.95 27595.81 Da和3 (b))与良性前列腺增生PSA-IgM(图2 (b))。

的质谱PSA-IgM准备一起从不同的血清池,细微的差别(偶尔有些山峰存在)是明显的但他们都显示PSA分离成几个山峰;也就是说,他们建议在免疫复合物的存在不同的PSA glycoisoforms IgM。

3.3。糖基化的评估包裹着IgM PSA分子物种

考虑的理论质量PSA肽及其碳水化合物一部分,观察到PSA-IgM物种被匹配的氨基酸序列和多糖成分建立了PSA亚型(表2)。推断多糖质量的主要山峰在BPH 17 kDa PSA-IgM和PCa PSA-IgM介于1121和1259之间哒。他们可能归因于oligomannosidic结构(男4或Man5)。

不同的PCa PSA物种在26889.27应该包含trimannosyl核心/ paucimannosidic结构(毫米),基于推导出聚糖质量800.16哒。

PSA物种在28 kDa评估包含fucosylated或nonfucosylated monosialylated biantennary链与终端N-acetylglucosamine (GnNaF / NaGnF)或半乳糖(乙酰天冬氨酸/安娜;ANaF / NaAF)。此外,修改通过平分glucosaminylation (NaGnFbi / GnNaFbi)也建议。

28.9 kDa的山峰在BPH和PCa估计2817 Da的多糖的质量。这是高于质量完成PSA多糖(2352 Da),它可能会分配给triantennary寡糖链。

由于数量有限的特定PSA物种进行直接分析,预测验证使用离子交换色谱法非复杂PSA作为参考。考虑,等电点数据的PSA glycoisoforms(π6.9 - -7.7),相应的样本分离阴离子和阳离子交换剂在pH值8.0。获得的结果表明,不完全糖化PSA (kDa 17日)显示弱结合离子交换剂与sialylated形式(kDa 28日)绑定强阴离子交换器(图4)。因此,观察到的电荷异质性PSA分子物种是在协议与预测不同程度的糖基化。

4所示。讨论

根据观察到的分子质量,PSA已经分为两或多或少的异构组糖化(gp28, gp22、gp18 gp12)或nonglycosylated (p20 p26-full长度nonglycosylated PSA, p16, p10,和p6)肽(8]。低分子质量PSA结果蛋白质乳沟在几个不同的网站,其中主要形式包括那些削减Lys182 / Ser183或Lys145 / Ser146或在残留(4,16]。

我们的研究结果表明,PCa PSA和良性前列腺增生的主要分子物种PSA发现包裹着IgM对应gp18,糖化PSA氨基酸残基1 - 145。此外,次要形式对应于整个成熟糖化PSA的物种,也就是说,gp28,也观察到。

PSA是定义为一个28.430 Da糖蛋白含有8%的碳水化合物主要是biantennary N-linked N-acetyllactosamine类型的低聚糖与唾液酸组在每个的两个分支22]。然而,数据表明,有在正常和病理条件下明显的异质性。PSA亚型不同,一般来说,在唾液酸含量以及外链功能(23- - - - - -25]。除了biantennary链,monoantennary糖链和外围结构仅由N-acetylhexosamine残留也发生。

这一研究获得的结果表明PSA物种包裹着IgM主要包含不完整的多糖链缺乏唾液酸。因此,主要的PSA物种包裹着IgM评估有oligomannosidic结构在BPH和PCa。此外,分配给PCa PSA-IgM paucimannosidic结构。

改变PSA糖基化被报道在BPH和PCa (26- - - - - -30.]。具体来说,PSA与减少sialylation形式,fucosylation变化,增加了PCa的π被发现。

至于不寻常的在PSA-IgM mannosidic结构发现,他们可以与聚糖PSA同种型指定为PSA-A′(24]。它代表了一个小比例,也就是说,只有0.6%的总PSA亚型,和由四个PSA物种从26808.9到27295.8哒。

看来,新发现IgM-bound亚型诊断可能区分PCa和良性前列腺增生,但没有优势相比其他建立参数(总PSA-IgM或fPSA / PSA)。由于内在PSA-IgM总额的异质性和复杂性方法的应用,其可能的相关性应该确认测试不同类型的样本,使用不同的实验设计适合临床使用。然而,寻找不同的IgM-bound PSA形式可能感兴趣的根据最近的数据表明paucimannose作为人类癌症的标志(31日,32]。

相比这些糟糕的糖化PSA物种与IgM复杂,主要fPSA物种主要包含单链不饱和脂肪或是disialylated biantennary链。fPSA分数作为参考,因为它应该包括一个丰富的物种可以被IgM。PSA包裹着法没有考虑相关的交互,主要因为它包含PSA共价结合保持酶的活性。

PSA糖基化是非常重要的潜在生物标志物,这是调查的研究在不同的生理和病理条件下(26]。一般来说,考试的PSA糖基化,尤其是众多物种PSA /改变,面对少量的问题,防止隔离多糖在足够的数量分析。此外,限制有关的已知影响多糖和多肽PSA在电泳和色谱分离行为。

使用标准数据PSA准备通过质谱分析,评估通过计算PSA糖基化多糖质量已被证明是相关的24]。在这项研究中,这是结合片上immunoaffinity色谱和离子交换色谱法,使同时敏感的PSA检测各种改变。因此,尽管不同的方法和检测系统用于分析和参考文献中报道的,概括对PSA亚型的组成、基于一致性模式的蛋白质和多糖,半个。质量差异计算和理论扩展到0.1 kDa,这可能是由于常见离子加合物在质谱分析。然而,对于PSA物种在28.9哒,区别是很有意义的。PSA物种有质量高于28.4 kDa也报道在精浆和血清,但他们没有详细描述(6,8,11,12]。他们与PSA形式包含multiantennary链或pro-PSA,一些作者建议,无法证实或否认。

众所周知,PSA明显影响其生物活性的结构完整性和不同分子相互作用的能力。作为第一道防线,IgM有着特殊地位PSA-IgM复合物的免疫系统和发现生物标志物可能打开了一个有趣的观点。修改的绑定是碳水化合物,如PSA的情况下,一般的原则,不仅是基本的,但也的临床利益,例如,与癌症免疫疗法?不同的主动和被动的疫苗,包括基质疫苗异常glycostructures,正在临床试验,但成功原则和有效性的证据有限阶段(33]。PSA改变绑定到IgM特点,从这项研究中,直接进一步调查结构比较不同的肿瘤标志物免疫复合物和他们的自由形式,承诺的进步作为癌症检测和治疗的目标。

5。结论

获得的结果显示明显的差异immuno-complexed PCa PSA与BPH PSA相比,虽然两人都是主要由nonsialylated不完全糖化分子物种。带来的问题可能的作用作为一个框架,用于免疫反应性和immunoediting糖基化,代表早期机制消除或异常的癌症分子和细胞失活。

承认

这项工作由教育部的支持,科学和技术发展的塞尔维亚项目代码173010。

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