血清甲胎蛋白与mage - a3特异性细胞毒T淋巴细胞联合检测对肝癌的诊断价值

摘要

我们研究了联合检测HLA-A2/MAGE-A3表位特异性细胞毒T淋巴细胞(CTLs)和血清甲胎蛋白(AFP)对肝癌(HCC)特异性诊断的可行性。我们采用HLA-A2/多肽复合物(五聚体)检测技术检测HCC患者、肝硬化患者和健康受试者外周血中自发ctl中MAGE-A3表位(p112-120, KVAELVHFL)的频率。从175例HCC患者、80例肝硬化患者和105例健康志愿者中，分别选择85例HCC患者、38例肝硬化患者和50例hla - a2阳性健康患者。hla - a2特异性MAGE-A3的发生频率⁺HCC组的ctl明显高于其他组。MAGE-A3联合检测⁺CTL频率和血清AFP值比单独两项指标具有更高的特异性。五聚体技术有助于区分肝脏良恶性病变。结合血清AFP，可提高肝癌的诊断水平，特别是AFP阴性的肝癌。

1.介绍

根据美国癌症协会2012年的报告，肝癌(HCC)在全球男性发病率中排名第五，在女性发病率中排名第九[1]它已成为美国癌症相关死亡增长最快的原因，也是中国第二大死亡原因。目前推荐的治疗方法包括手术切除、射频消融和肝移植。然而，在最晚期的病例中，肝脏储备不足或其他肝脏疾病和并发症的组合使这些患者不适合手术[2]．即使手术切除，术后5年内复发率也超过50%，5年生存率低于20%。近年来肝移植患者的5年生存率有所提高，但总体预后仍不佳[3.，表明目前的治疗方案并不令人满意。肝癌患者的低生存率与肿瘤大小密切相关[4，5，肿瘤分期[6，血管侵入[7和微转移[8，是肿瘤生长和侵袭的可靠和重要的指标。HCC细胞累及血管，引起血行播散，可能导致高复发率和转移率，预后不良[9，10]．

为了更早的治疗干预，迫切需要更好的早期诊断技术。目前HCC的诊断主要采用b超、CT、MRI及血清甲胎蛋白(AFP)水平等影像学检查。血清AFP是一种简便有效的肝癌筛查方法。然而，如果影像学表现不典型，大约三分之一的低AFP水平HCC患者很难准确诊断[11]．近年来，肿瘤特异性抗原的筛选取得了很大的进展，这导致了多种候选蛋白和基因的鉴定。Simpson等人首次报道了恶性黑色素瘤患者的癌睾丸抗原[12，属于鉴定出的最大的特异性肿瘤抗原群。癌-睾丸抗原，包括黑色素瘤抗原(MAGE)家族、SSX家族、LAGE、GAGE、CTp11、NY-ESO-l等，除睾丸外，一般在正常组织中不表达，但在HCC、恶性黑色素瘤、肺癌、肉瘤、膀胱癌等肿瘤类型中有一定程度的表达。这些抗原被发现是最有希望用于免疫治疗的一类抗原。自1998年以来，本课组对癌睾丸抗原和HCC进行了研究，发现MAGE-1、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-10、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-C1、MAGE-C2、NY-ESO-1等CT抗原在中国HCC患者肿瘤组织中高表达[13- - - - - -15]．MAGE-3不仅在HCC中高表达，而且通过四聚体技术鉴定，具有较强的免疫原性，具有多个hla限制性表位。例如，MAGE-3作为一种特定的细胞免疫反应，可在胃肠道癌症、黑色素瘤或肺癌患者的外周血中检测到[12，16- - - - - -19]．因此，我们假设五聚体技术可以在常规检查的基础上作为HCC的诊断方法。肝癌患者外周血中检测到mage - a3特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原。结合血清AFP，我们假设该参数可能为AFP阴性的HCC患者提供更可靠的诊断。

在本研究中，我们采用五聚体染色和流式细胞术检测HLA-A2阳性HCC患者、肝硬化患者和健康志愿者外周血中HLA-A2/MAGE-A3112-120表位特异性ctl的频率。肝硬化患者中ctl的发生率明显低于HCC患者()，而健康对照组CD8/MAGE-A3双阳性细胞较少。因此，该方法可能有助于区分良性和恶性肝病，并可与血清AFP检测相结合，形成一种新的HCC诊断方法。

2.对象和方法

2.1.主题

我们回顾性分析了2007年6月至2012年12月在我院接受手术的175例HCC患者的临床病理资料。他们包括117名男性和58名女性，平均年龄为(28至84岁)。60例感染乙型肝炎病毒(HBV)， 2例感染丙型肝炎病毒(HCV)。另外，80例无癌肝硬化患者作为对照组。术中切除肝细胞癌组织及癌旁正常组织标本，行液氮快速冷冻，病理分型。HCC的诊断是基于术前检查，其中包括血清AFP浓度、肝脏超声、CT和肝脏血管造影。肝癌患者的临床病理资料汇总见表1．患者术前未接受任何干预。肝功能采用Child-Pugh分级。两名病理学家对组织标本进行组织病理学检查，确定诊断为HCC。肿瘤分期基于美国癌症联合委员会(AJCC)的分期系统(2010年)。肝硬化的诊断是基于肝脏组织学以及肝脏失代偿或门脉高压的实验室和影像学证据。此外，研究还纳入了105名健康志愿者，他们所有人的A、B、C、D、E型肝炎病毒标志物和艾滋病毒抗体均为阴性，没有肝脏、胆囊或肾脏疾病。

该研究方案由作者所属机构的当地机构审查委员会批准，由于本研究的回顾性性质，不需要患者的同意。

2.2.HLA表型分析

从每个受试者收集2毫升外周静脉血，并使用HLA-A2异硫氰酸荧光素（FITC）结合的小鼠抗人单克隆抗体（BB7.2 ATCC；新泽西州富兰克林湖贝顿·迪金森）和FACS Calibur流式细胞仪（贝顿·迪金森）进行HLA分型.使用CellQuest软件分析数据。总共获得10000个有核细胞，如果超过80%的细胞被标记，则样本被视为阳性。HLA-A2阳性HCC患者被称为HCC组，HLA-A2阳性肝硬化患者和健康志愿者被称为非HCC对照组。

2．3.Taq男人Q-PCR

使用RNAeasy提取试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从组织标本中提取总RNA，根据制造商说明，使用Superscript II逆转录酶试剂盒(Promega, Madison, WI)用寡核苷酸引物合成cDNA。的MAGE-A3基因引物和探针采用ABI PRISM Primer Express 3 (Applied Biosystems, Foster City, CA)设计。使用荧光染料FAM作为报告信号GAPDH用于内部控制。MAGE-A3:正向引物:5 ' -GGAGCACTGAAGGAGAAGATCTG-3 '，反向引物:5 ' -TGACTCTGGTCAGGGCAACA-3 '，探针:5 ' -FAM-TGGGTCTCCATTGCCCAGCTCC-TAMRA-3 ';GAPDH：正向引物：5′-GAAGTGAGTCGGAGTC-3′，反向引物：5′-GAAGATGGTGATTTC-3′，探针：5′-FAM-CAAGCTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3′。PCR在50℃下运行2小时 最低温度和95°C，持续10分钟 在92°C下进行40次循环15分钟 1秒和60°C 所有反应至少进行两次，三次独立进行。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行解析，并使用ABI Prism7000检测系统（应用生物系统）进行分析。A（阈值周期）小于30的值被视为正值。

２.４.外周血mage - a3特异性ctl的检测

hla - a2阳性的研究对象外周血10ml。肝素抗凝后，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞PBMCs与anti-CD8 MicroBeads (MiltenyiBiotec, BergischGladbach, Germany)在4°C孵育30分钟。约CD8⁺T淋巴细胞采用MS柱(MiltenyiBiotec)分离。5个包含多肽的mhc -二聚体(pentamer) MAGE-A3表位(p112-120, KVAELVHFL)复合物被藻红蛋白(phycoythrin, PE)标记，从而能够识别并结合CD8的T细胞受体⁺T细胞对抗抗原肽。五聚体染色如前所述[20，21]．采用FACSCalibur流式细胞术进行检测，采用CellQuest软件进行数据采集和分析。淋巴细胞门设置为20,000 CD8⁺T细胞和20000个双阳性CD8-FITC⁺pentamer-PE⁺细胞(MAGE-A3-specific CD8⁺T细胞)，频率以双阳性细胞百分比表示。

2．5．血清甲胎蛋白水平检测

采用Roche E170仪器和商品化试剂盒(Roche, Basel, Switzerland)，电化学发光法检测血清AFP水平。AFP > 200 ng/mL被认为是HCC阳性。

2.6。跟进

随访前3年、后6个月，每3、4个月随访1次，包括体格检查、血常规、血清甲胎蛋白、胸片、腹部超声。如超声发现可疑病变或AFP增高，则进一步检查(超声造影、CT或MRI)，确认或排除复发。生存期被定义为从手术日期到任何原因死亡之间的时间。

2.7。统计分析

所有数据以均数±标准差(SD)表示，并使用SPSS 19.0 (SPSS Inc.， Chicago, IL)和GraphPad Prism5.0进行分析。采用非参数Pearson相关分析检测hla - a2阳性HCC患者MAGE-A3肽特异性ctl频率与MAGE-A3 mRNA表达的相关性。mage - a3特异性CD8的频率差异⁺通过单因素方差分析比较三组患者外周血中的T细胞t采用-检验分析HCC组与非HCC组的差异。采用受试者工作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)描述血清AFP或mage - a3特异性ctl频率，作为HCC诊断的效率指标。在约登指数最高的地方定义了可能的最佳截断点．对mage - a3特异性CTL频率与血清AFP联合检测，在进行ROC曲线分析前进行logistic回归分析。为了研究mage - a3特异性CTL流行对预后的影响，我们采用Kaplan-Meier方法和log-rank检验。小于0.05的值被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.HCC患者mage - a3特异性ctl频率升高

我们的HLA-A2抗原表型分析显示，175例HCC患者中有85例(48.6%)HLA-A2阳性，80例肝硬化患者中有38例(47.5%)，105例健康志愿者中有50例(47.6%)HLA-A2阳性。我们检测了CD8的频率⁺-特异性ctl结合MAGE-A3表位的五聚体染色和流式细胞术。我们发现85例hla - a2阳性HCC患者外周血MAGE-A3结合CTLs的频率为%，明显高于肝硬化患者(%，)(图1(一)）.少量或没有CD8⁺/健康受试者MAGE-A3双阳性细胞(%)此外，CD8的频率也有显著差异⁺HCC组与非HCC组之间MAGE-A3表位结合的特异性ctl ()(图1 (b)）.

我们进一步通过qPCR检测MAGE-A3 mRNA的表达。我们发现54.6%（24/44）的HLA-A2阳性肿瘤组织标本表达MAGE-A3 mRNA，但在邻近正常组织中未检测到（图1 (c)）.Pearson相关分析显示HCC组织中MAGE-A3 mRNA表达与HCC患者MAGE-A3阳性CTLs频率无相关性(Pearson相关系数= 0.131，）.

3．2.血清AFP和mage - a3特异性ctl对HCC的诊断价值

截止值为200时 AFP为ng/mL时，27例（31.8%，27/85）被诊断为肝癌≥0.67%的MAGE-A3表位特异性CTL频率，63.5%（54/85）的HLA-A2阳性HCC患者被诊断为HCC（表1）2）.当这两个参数结合时，76.5%(65/85)的患者诊断为HCC。早期肝癌患者(TNM I和II), 83.1%(54/65)确诊的结合使用两个参数,而只有29.2%(19/65)患者早期诊断单独使用法新社和72.3%(47/65)患者早期诊断使用的频率MAGE-A3-epitope-specific ctl。

ROC曲线分析显示，血清AFP的AUC为0.613(图2(一个)）.当临界值为200 ng/mL时，血清AFP诊断HCC的敏感性为31.8%，特异性为98.9%，约登指数为0.307。mage - a3阳性ctl发生频率的AUC为0.873(图2 (b)）.在0.67%的临界值下，63.5%(54/85)的HCC患者对hla - a2限制性表位表现出特异性MAGE-A3 CTL反应。相比之下，38例(100%)肝硬化患者和50例(100%)健康志愿者对此反应为阴性。mage - a3阳性CTLs频率为0.67%，诊断敏感性为68.6%，特异度为100%，约登指数为0.686。

而血清AFP与mage - a3特异性ctl的频率无相关性(Pearson相关系数= 0.093，)，这两个指标是互补的。我们根据HCC诊断的判定边界，对这两个指标的组合进行分析。AFP的截断值为200 ng/mL, mage - a3特异性ctl的截断值为0.67%，联合AFP和mage - a3特异性ctl的AUC ROC曲线为0.916，敏感性为72.9%，特异性为100%(图)2 (c)）.约登指数为0.729。结果表明，联合AFP和mage - a3特异性ctl对hla - a2阳性HCC的诊断效果显著提高。

3．3.MAGE-A3特异性ctl的频率与患者临床病理参数无关

接下来，我们分析了MAGE-A3特异性CTL的频率与患者临床病理参数（如年龄、性别、术前AFP水平）之间的相关性（20 ng/mL和200 ng/mL），肿瘤大小，肿瘤数量，HBsAg表达，Child-Pugh分级，TNM分期和分化（表1）1）.mage - a3特异性ctl的频率与这些参数没有统计学意义的关联(）.

3．4．mage - a3特异性CTL频率与预后的关系

所有85例HCC患者术后平均随访34个月(4 ~ 68个月)。最后一次随访时，24例患者死亡，54例患者存活。中位生存期为个月;1年、3年和5年生存率分别为80.8%、41.3%和27.5%。生存曲线如图3(一个)．MAGE-A3特异性CTL频率高于0.67%的组中位生存期为个月。此外，1年、3年和5年生存率分别为91.3%、43.0%和21.5%。另一组MAGE-A3特异性CTL发生率低于0.67%，中位生存期为1年、3年和5年生存率分别为63.8%、45.7%和38.1%3.）.Kaplan-Meier生存曲线显示，MAGE-A3细胞频率低(<0.67%)的患者与MAGE-A3细胞频率升高(≥0.67%)的患者生存率无显著差异()(图3 (b)）.

4.讨论

在中国，血清AFP水平被作为原发性肝癌诊断的常规指标之一。然而，高分化和低分化的HCC细胞通常产生很少的AFP，而中分化的HCC细胞合成的AFP水平较高[22]．因此，AFP在HCC诊断中的阳性率一般仅为60-70% [23]．此外，肝硬化患者的血清AFP水平可能非常高，提示AFP在原发性肝癌诊断中存在假阳性。

本研究采用五聚体染色和流式细胞术检测HCC患者外周血中HLA-A2/MAGE-A3112-120表位特异性ctl的频率。当mage - a3阳性ctl临界值为0.67%时，63.5% (54/85)HCC患者出现阳性结果。然而，在38名肝硬化患者和50名健康志愿者中未检测到相应的CTL反应。因此，五聚体技术可能具有足够的灵敏度，可以检测到MAGE-A3特异性表位的自发CTL反应，并可作为提高HCC诊断率的重要辅助方法。我们采用ROC曲线法评价血清AFP检测在HCC诊断中的有效性。根据临床诊断HCC常用的判定边界，当AFP阳性截断值为200 ng/mL时，AFP的敏感性和特异性分别为42.86%和98.9%，AUC为0.613。联合检测血清AFP水平和mage - a3特异性ctl(临界值为0.67%)，ROC曲线下面积(AUC)为0.916，明显提高了HCC的诊断敏感性，达到72.9%。但特异度仍为100%，约登指数为0.729。因此，该联合检测方法明显提高了诊断性能。我们的结果表明，使用HLA-A2/MAGE-A3多肽五聚体技术，可以定量地确定HCC患者外周血中对肿瘤特异性抗原的特异性自发CTL反应。 The MAGE-A3-specific CTL frequency and its diagnostic significance in a large cohort have not been previously investigated. In addition, we found that in the 44 HLA-A2-positive HCC cases expressing theMAGE-A3MAGE-A3 mRNA表达与MAGE-A3特异性CTL反应无相关性。另一项研究表明，许多CT基因，包括MAGE-A3，表现出聚类表达现象[24]．多种CT抗原在肿瘤中自发表达，但在某些病例中，CT抗原不表达。因此，虽然在实体肿瘤中不一定能检测到抗原表达，但外周血中可以检测到对抗原的CTL反应。对于特异性CTL检测的可靠评估，qPCR数据可以作为重要的参考。今后，如果应用HCC诊断指标，应考虑这些灵活的检查方法。

本研究发现患者的性别、年龄、术前AFP水平等参数（20 ng/mL和200 肿瘤大小、肿瘤数量、TNM分期和分化与MAGE-A3的频率无显著相关性⁺ctl (）.此外，在其他研究中没有观察到显著的相关性[25，26]．

此外，由于中国汉族患者HLA-A2抗原的表达频率达到51.9%[27]，我们选择了HLA-A2阳性患者和一种HLA-A2型五聚体。由于我们只选择了HLA-A2型五聚体，我们无法在我们的评估中涵盖所有HCC患者。随着技术的进步和数据的逐渐积累，我们最终将拥有多种HLA型五聚体供我们使用，并将能够选择抗原w具有更强的免疫原性，涵盖更多患者。

本研究应用经典免疫学理论和先进的技术，分析ctl对特定肿瘤抗原的反应，试图找到诊断HCC的“镜像”标志物。本研究表明，在相对成熟和灵敏的五聚体技术下，结合血清AFP水平联合检测肿瘤特异性抗原肽CTL反应频率对HCC，特别是血清AFP阴性的HCC具有一定的诊断价值。建立这种新型的辅助诊断模式，可以提高肝癌经典筛查的敏感性和特异性，提高肝癌的诊断率[28]此外，MAGE-A3特异性TCR已被识别并准备好进行免疫治疗[29，30]．MAGE-A3的进一步研究将使我们能够将这种肿瘤特异性抗原CTL标记应用于HCC的诊断。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

承认

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no。30772119)。崔祝青青和余欣是平等的第一作者。

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