EphB4酪氨酸激酶抑制刺激增长的乳腺癌mda - mb - 231细胞以时间和剂量依赖的方式

文摘

背景。EphB4受体酪氨酸激酶的诊断和治疗价值由于其过度在乳腺肿瘤。双重功能的肿瘤促进和抑制已报告基于存在与否的这种受体的配体。阐明这些差异,我们旨在确定的影响时间和剂量依赖性刺激EphB4可行性并通过重组ephrinB2-Fc入侵乳腺癌细胞。方法。细胞被播种到多井盘子和刺激了各种浓度的preclustered ephrinB2-Fc。细胞生存能力是衡量天治疗后3 - 6使用alamar-blue当细胞在不同的融合状态。结果。刺激细胞ephrinB2并不构成任何显著的影响在达到融合细胞的生存能力,同时抑制细胞生长6天后发现当细胞在postconfluent状态后剂量依赖性的方式。EphrinB2治疗并不影响肾小管基底膜基质形成和入侵。结论。这个研究表明,EphB4不同抑制细胞汇合的状态后,配体的存在体现growth-inhibitory EphB4受体的性质。得出增长抑制发生可能是因为长期治疗与配体,一个过程。差别导致受体对这些

1。介绍

肿瘤细胞表达多种因素,使他们能够克服监管障碍对持续发展和生存在异常情况下正常细胞不会1]。在这些因素中,酪氨酸激酶扮演关键的角色。弗(红细胞生成素产生肝癌)受体组成最大的酪氨酸激酶家族和分为两类EphAs EphBs基于序列同源性。通过膜结合配体受体激活发生ephrinAs ephrinBs,分别为(2]。这个家庭的一个特点是他们的繁殖能力双向信号在细胞表达受体和配体;换句话说,弗受体和ephrin配体能够诱导下游信号的正向和反向信号(3]。由于这样的空间定位,弗受体和ephrin配体构建一个细胞表达的受体和配体之间的通信系统,它允许他们参与许多生理过程,如增殖,形态和运动,在神经元正常器官增长路径发现,和血管生成4- - - - - -7]。

最近,他们参与异常如癌症也被记录下来(8]。EphB4和EphA2癌症中研究最多的是这个家庭的成员。不像其他酪氨酸激酶是致癌的,大多是双重功能的肿瘤促进和抑制已经报道了这个家族(8]。

EphB4表示癌症细胞与ephrinB2出现在内皮细胞和诱导血管生成9]。持续、可溶性受体EphB4无法刺激内皮ephrinB2配体已被证明具有治疗潜力减少肿瘤的生长通过抑制血管生成10,11]。此外,EphB4过度已被证明是与肿瘤分级和阶段(增加12)和overexpressing EphB4受体在乳腺癌和前列腺良性的细胞会导致他们的转换和恶性行为的表现13]。EphB4减少乳腺癌细胞的差别,对这些基因的可行性,表明EphB4表达式作为一个生存因素[14]。

除了EphB4超表达在肿瘤细胞,肿瘤细胞受体磷酸化是非常低的,它已经表明,ephrinB2 EphB4首选的配体,与受体表达下调是过表达15]。这导致了一个假设,ephrinB2 EphB4激活和平衡表达介导的受体和配体导致的肿瘤抑制(16]。这个假设进一步支持诺尔et al .,他们报道的肿瘤抑制信号通路的激活,Abl-Crk,下游ephrinB2 / EphB4信号在乳腺癌细胞17]。

除了小说研究致力于弗受体在癌症的描述功能,与他们的角色相关联的复杂性需要更复杂的肿瘤生物学的理解他们的贡献为了正确目标,充分利用他们在癌症治疗肿瘤抑制行为。我们相信致命ephrinB2治疗对乳腺癌细胞的影响也可能是时间和剂量依赖性。,我们检查的影响短期和长期治疗各种ephrinB2-Fc浓度对乳腺癌mda - mb - 231细胞在不同状态的融合,我们测试的这种治疗方法对攻击行为的影响肿瘤细胞在三维文化与基底膜基质。

2。材料和方法

2.1。试剂

从研发系统EphrinB2-Fc购买。Fc片段和山羊反人类的免疫球蛋白为集群ephrinB2-Fc从杰克逊ImmunoResearch获得。从AbdSerotec Alamar-blue得到,基底膜基质从英杰公司购买。

2.2。细胞培养

乳腺癌mda - mb - 231细胞系是来自伊朗的巴斯德研究所。细胞在DMEM补充10%的边后卫+ 1%青霉素、链霉素和保持湿润5%股份有限公司₂孵化器与介质每2 - 3天更新。使用0细胞亚文化之前达到融合。trypsin-EDTA 25%。

2.3。的标准化Alamar-Blue可行性分析

Alamar-blue是刃天青盐的商用解决方案开发测量可行性和各种培养细胞的增殖。与四唑盐(MTT)等,alamar-blue染料水溶性排除进一步添加DMSO晶体溶解。此外,alamar-blue不是细胞毒性,并允许重复测量细胞的生存能力在很长一段时间使动力学研究。Alamar-blue转换为形式减少了线粒体酶,和过程是伴随着颜色的变化从靛蓝色粉色,可以通过比色测量或荧光阅读。

由于细胞代谢能力的差异减少alamar-blue染料,最佳长度的孵化和电镀的细胞数量是两个关键变量之前确定执行可行性/每个细胞株细胞增殖试验使用(18]。

日志中细胞生长阶段的增长被trypsin-EDTA收获,和一个初始浓度和稀释和播种到井的96孔板(200μL为每个)。中没有细胞作为消极的控制,和板4 h,允许细胞孵化附件。20毫升alamar-blue被添加到每个。立即的吸光度测定,每2小时第一6小时使用570和600海里PowerwaveXS板读者。以下的板也孵化24小时测量最大减少染料。pH值是严格控制在7 - 7.4通过保持板有限公司₂测试期间的孵化器。

比例减少alamar-blue通常是计算使用方程(1) 和记录吸光度测试井在570和600海里,分别和和吸光度的负面观察控制。

另外,在线计算器建议通过提供公司用于测量比例降低(http://www.abdserotec.com/)。

2.4。Alamar-Blue测定细胞生存能力

二聚ephrinB2-Fc配体是必要的为了充分激活EphB4受体;因此ephrinB2-Fc和Fc和山羊preclustered反人类的免疫球蛋白在1:3浓度实验前1小时在室温下。

细胞浓度被播种到每个24-well板。二十四小时后,细胞培养介质包含1,3 - 10所示μg / mL pre-clustered ephrinB2-Fc或控制Fc。

细胞生存能力是衡量天3和6,当细胞在子任务和postconfluent状态,分别。新鲜培养基含有ephrinB2-Fc取代日试验3天。

细胞被冲洗与PBS表示时间和新鲜媒介所取代。Alamar-blue是添加到每个包含新鲜培养基有10%的边后卫在相当于10%的体积在每个孵化了3个小时。200年整除μL是分发96 -孔板和吸光度测量使用板读者在570和600海里。细胞+ alamar-blue不含测试代理被用作控制正增长。差异百分比减少ephrinB2-Fc和Fc组治疗然后计算基于方程(2)或在线计算器。 和观察吸光度测试井在570和600海里,在吗和观察正增长控制的吸光度,由细胞+ alamar-blue但没有测试代理。

2.5。基底膜基质细胞行为

人工基底膜是在冰上融化,100年μL的解决方案是均匀地添加到每个的冰冷24-well板,并保存在孵化器30分钟。一个暂停细胞+解决方案3和10μg / mL preclustered ephrinB2-Fc或PBS负控制被添加到每个在总量400μL,板是孵化24小时。管状的细胞行为的形成是通过倒置光学显微镜观察和拍摄的。

2.6。统计分析

ephrinB2-Fc区别对待和分析了摘要组学生,t以及。方差分析之后,其事后测试进行比较不同剂量之间的生存。数据被表示为平均±S.E.M和被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。最优条件Alarmar-Blue可行性分析

比例减少alamar-blue孵化后mda - mb - 231细胞系测量在不同细胞密度和潜伏期,和数据绘制各种细胞浓度为每一个时间点。之间的曲线是线性的和细胞/毫升(图1)。基于这些结果和初步试验来确定最佳的细胞为种子细胞密度24-well盘子,cell /毫升浓度被选为细胞达到融合不早于4天。培养时间的3小时alamar-blue被发现最优的计算百分比减少。这些值与alamar-blue选择未来的实验。

3.2。EphB4刺激减少癌细胞生存时间和剂量依赖的方式

通过集群分析受体磷酸化后刺激ephrinB2表明EphB4受体是活跃在乳腺癌mda - mb - 231细胞系(数据没有显示)。确定受体激活细胞生存和增长的影响,细胞暴露于不同剂量的集群ephrinB2-Fc在不同时间点(如前所述)。没有观察到显著减少细胞生存能力与ephrinB2-Fc或Fc控制细胞孵化时3天,无论是细胞汇合的60%左右时,生长在单层状态(图2(一个))。6天的孵化后明显降低检测当细胞达到了融合和持续增长作为第二层;减少细胞的生存能力在高剂量(图更加突出2 (b))。这些结果表明,抑制细胞生长由EphB4刺激通过ephrinB2更长的潜伏期时间后才发生。

3.3。EphrinB2-Fc治疗不影响细胞基底膜基质上的行为

基底膜基质混合是一个商业的胶原蛋白、层粘连蛋白等细胞外基质的主要成分。转换和是非细胞显示人工基底膜上的不同形态和可以利用这个属性,研究抗肿瘤药物对可逆转换的影响细胞行为。正常细胞如MCF-10A人工基底膜形成球形的身体,而转换和侵入性细胞,如乳腺癌mda - md - 231细胞系侵袭基底膜基质,形成管状网络。

我们测试了如果ephrinB2-Fc治疗可以抑制mda - mb - 231管网络的形成于基底膜基质。在基底膜基质细胞孵化24小时的preclustered ephrinB2-Fc(研究3μg / mL和10μ克/毫升浓度)。mda - mb - 231细胞入侵到基底膜基质,形成管状网络。EphrinB2,任何测试剂量;不改变细胞的入侵行为,如图3。如果ephrinB2治疗基底膜基质影响入侵行为,地铁将废除完全形成,和聚合殖民地而不是小管,如图所示,Carles-Kinch et al。19]。这些结果表明,观察到的细胞生存能力下降介导通过EphB4刺激后6天不可能是由于特定的抑制多层生长阶段命名锚独立成长。

4所示。讨论

弗家族的受体是有趣的目标分子在肿瘤和癌症治疗,因为他们大多是过表达似乎参与肿瘤细胞生存和增殖,入侵、转移和血管生成。因此,设计人员正确的目标可以通过多种机制导致肿瘤生长停滞。然而,理性药物设计彻底利用他们的能力来抑制肿瘤的生长需要更准确的理解机制弗/ ephrin系统信号在癌症细胞及其微环境。

在这项研究中,我们表明,长期潜伏的乳腺癌细胞mda - mb - 231 ephrinB2-Fc抑制其增长细胞增长postconfluent状态时,在高剂量和生长抑制作用更突出。类似Carles-Kinch等人的研究显示,使用激活抗体EphA2弗的另一个家人在mda - mb - 231细胞系,导致细胞生长抑制后达到融合以及抑制肾小管基底膜基质上形成(19]。

6天后抑制细胞生长和删除从差别可能是因为受体对这些细胞表面而不是抑制锚地独立成长。这种机制被认为类似Kumar等人,他们的研究表明,长期治疗与ephrinB2 MCF-7细胞生长抑制,差别导致受体对这些类似的结果击倒EphB4 [14]。另一方面,在这项研究中,使用的条件ephrinB2-Fc治疗没有减少小管的形成和入侵。因此推测ephrinB2-Fc更有可能抑制肿瘤细胞的生存能力和减少肿瘤入侵可能需要更高的剂量或在活的有机体内条件,抑制血管生成抑制入侵和转移。

最近的研究发现了有趣的弗受体在乳腺癌方面的确切角色弗/ ephrin促进或抑制肿瘤仍不清楚。肿瘤促进和抑制的双重角色(图4)已被分配给这个家庭,可能是基于存在与否的同源配体(13]。因此,EphB4超表达与提高了肿瘤阶段和贫穷的生存20.]。因此,EphB4可以作为乳腺癌细胞的生存因素可能由于本构激活或串扰与其他致癌等生长因子受体EGFR家族(14]。相比之下,EphB4激活配体,ephrinB2,乳腺癌细胞可以抑制肿瘤通过激活Abl-Crk促销和入侵途径与我们的结果(可17]。

然而似乎更加复杂的场景描述的相反效应EphB4刺激仅仅ephrinB2的存在与否。在这方面,细胞背景似乎也扮演关键的角色在决定对肿瘤促进或抑制的影响。这种假设已经支持最近在肖等人的研究中表明,ephrinB2-Fc治疗导致HUVEC细胞的生长抑制作用,而同样的刺激会导致经济增长促进MCF-7细胞(21]。矛盾的角色EphB4受体在乳腺癌更进一步在信号机制分配很明显。Kumar等人曾表明,通过ephrinB2 EphB4刺激导致PI3 K / Akt通路的激活,为期四天的治疗MCF-7细胞与配体由于受体下调导致细胞死亡(14]。另一方面,肖等人报道的增加增长MCF-7细胞后ephrinB2治疗由于Ras / Erk通路的激活后6天(21]。这种差异在同一上下文可能是由于实验条件的变化,如配体的受体刺激的剂量和时间证明是有效的在我们的研究中,配体的程度集群anti-Fc抗体或使用的可行性分析的灵敏度。依赖反应增长的抑制作用进一步促进在不同刺激条件下老于世故的智能药物设计针对EphB4乳腺癌,因此需要进一步的研究来更准确地解决EphB4激活的优势在EphB4抑制各种癌症。

利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

莫娜Moshayedi和Farnaz Barneh这项研究同样起到了推波助澜的作用。

金融支持

这项研究是由研究委员会的支持,伊斯法罕大学医学科学。

承认

作者感谢Nasim达纳(应用生理学研究中心)请提供人工基底膜。

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