两种不同细菌裂解物的明显抗病毒性质

抽象的

口服细菌裂解物(OBLs)可降低儿童呼吸道病毒和细菌源反复感染的频率和严重程度。白血病诱导的早期先天性免疫反应已经出现，但尚未对不同白血病的特异性特征进行研究和比较。本研究采用体外实验的方法，研究了OM-85和Pulmonarom对鼻病毒(RV)感染的人支气管上皮细胞(BECs)的保护作用。此外，由于免疫细胞是抗病毒防御的关键环节，我们还评估了这些OBLs诱导小鼠骨髓源性DCs (BMDCs)产生特定细胞因子的能力。虽然不同的OBLs可能具有相同的保护宿主细胞免受病毒感染的机制，但在rv感染的人BECs和小鼠bmdc上观察到一些产品特异性的抗菌活性。这些结果与可能由OBLs中包含的不同病原体相关分子模式(PAMPs)触发的产物特异性反应一致。

1.介绍

上、下呼吸道的病毒感染在儿童中非常普遍[1- - - - - -3.是儿童早期发生持续性支气管高反应性的主要危险因素。病毒感染是所有年龄层复发性喘息和哮喘加重的主要原因[4，5］．最近的两项研究提供了证据，证明在有严重下呼吸道感染风险的儿童中使用细菌裂解液(OM-85)进行预防性治疗可显著降低病毒感染的频率[6，7］．然而，om-85的这种保护作用的细胞生物学机制仍然不完全理解。

气道上皮细胞是病毒感染的主要入口部位，控制炎症和免疫反应[8］．气道上皮细胞表达模式识别受体(PRRs)，可检测环境刺激，如病毒或细菌颗粒，并促进内源性危险信号、防御细胞因子和抗病毒分子的释放[8］．rhinovirus（RV）是经常性喘息的最常见原因，患儿童哮喘的发展[9］．与哮喘的儿童相比，来自喘息和哮喘的儿童的支气管上皮细胞（BECS）对RV感染的免疫反应降低了[10］．哮喘儿童支气管涂刷获得的上皮细胞IFN-降低β与抑制宿主细胞凋亡、增加炎症细胞因子的产生、增加病毒复制和受损的伤口修复能力相关的生成[11］．

对常见病毒感染的免疫反应的缺乏与过敏性敏化无关，因为无论其特应地位如何，都可以在支气管活组织检查中检测到缺乏抗病毒免疫应答。12］．在这些儿童中，低IFN-β水平与RV负荷、气道Th2免疫病理特征(嗜酸性粒细胞增多和IL-4阳性)和上皮损伤呈负相关[12］．流行病学的观察表明，生命早期接触微生物可能通过“非特异性免疫调节”提高免疫反应的效率，并防止喘息和哮喘的发作，这表明细菌裂解物可能增强人类的自然防御系统[13］．

一项系统综述显示，细菌裂解物可有效预防反复呼吸道感染，降低症状的发生率、严重性和持续时间[14］．被认为通过与宿主细胞表达的Toll样受体（TLR）相互作用来激活免疫效应细胞的免疫效应细胞激活免疫效应细胞[15］．TLR2在介导和调节抗呼吸道上皮RV感染的抗病毒活性中起主要作用，但TLR7/8也参与其中[16，17］．另一项研究表明，口服细菌裂解液(OBL) OM-85通过调节细胞表面分子的表达和刺激相互作用的病毒C1q-R的表达，促进了BEC对RV-16感染的防御[18]和抗微生物肽β-defensin [19］．然而，在不同弓形中，这些抗病毒性质常见的程度是不知道的。

因此，我们设计了一项体外研究，评估和比较来自相同菌属但菌株组成和制造工艺略有不同的两种OBLs对rv -16感染BEC的保护作用。首先用OM-85或Pulmonarom预处理一个已建立的不朽的人支气管上皮细胞系(hBEAS-2B)和三个原代BEC培养物，然后用市售的RV-16菌株感染3天。本研究通过检测两种胚囊细胞对BEC的影响，包括感染率、BEC存活率、ICAM-1的表达和BEC分泌β-1-1和IFN-β．

考虑到免疫细胞和牙龈轴在屈服肺保护中的重要性免受病毒感染的[13，14，20.]，还决定研究免疫细胞介导的细胞因子诱导。为此，我们测量了重要的免疫介质IFN-的产生β肿瘤坏死因子-α， IL-6由小鼠bmdc介导，bmdc是一种常用的天然免疫细胞体外模型[21，22］．

2.材料和方法

２.１.人类细胞

一种稳定的、病毒转化的人支气管上皮细胞系BEAS-2B (ATCC, Cat# CRL-9609, Manassas, USA)，在1:1 RPMI1640和CnT-PR-A中生长，添加10%胎牛血清、20 mM HEPES和10 mM丙酮酸钠BRL (Thermo Fisher Scientific, Reinach, Switzerland)。

2.2。原发性人支气管上皮细胞（BECS）

从癌症控制患者的支气管组织标本中分离出三个初级BEC系。BECs在CnT-PR-A培养基(CellnTec，伯尔尼，瑞士)中生长。所有的实验在BEC原代培养中进行一次，在BEAS-2B细胞中重复四次。

２.３.细胞的描述

初级BECs的特征是E-Cadherin (Abcam 15148, Abcam, Cambridge, UK)、pan-cytokeratin (sc-8018, Santa Cruz Bio technology, Santa Cruz, CA, USA)或cytokeratin-14 (Abcam 9220)阳性染色和纤维连接蛋白(Abcam 23751)阴性染色，如前面所述[[19］．简而言之，细胞在8孔腔载玻片(Sarstedt, Sevelen, Switzerland)上生长，直到80%合流，并在4%福尔马林中固定2 × 5分钟。细胞在含有0.1% TWEEN-20和0.05% Triton-X100的PBS中渗透5分钟，然后用PBS- t (PBS + 0.1% TWEEN-20)冲洗3x，然后用2%脱脂牛奶PBS- t孵育30分钟，并用一种一抗孵育过夜，阻断非特异性结合。然后用PBS洗涤3次，用一抗的荧光标记抗体(抗鼠猫# R37114，抗兔猫# R37119, Thermo Fisher)在室温下孵育30分钟。PBS冲洗3倍，然后在EVOS活细胞成像站(Thermo Fisher)上监测荧光。

2.4。小鼠骨髓衍生的树突细胞（BMDC）的产生和刺激

取6 - 10周龄野生型C57/BL6小鼠股骨和胫骨，用冷PBS冲洗骨，提取骨髓细胞。然后将BM细胞以1 × 106细胞/mL的密度置于培养皿中，在Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)中培养，IMDM中加入添加了10%胎牛血清(FBS)的GlutaMax、1%的猪链球菌抗生素、2-巯基乙醇和HEPES(均来自Gibco)，20ng /mL重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (Peprotech)。3天后用5 mL新鲜培养基补充培养物，在第7天，通过温和搅拌收获漂浮的细胞，向下跨悬，在培养基中重悬以备进一步应用。BMDCs以1.5 × 105细胞/孔的密度在96孔的组织培养板中，用适当稀释的OM-85或Pulmonarom刺激16小时。实验进行了三次。

2．5．om - 85和Pulmonarom

OM-85(药物中间体)的液体形式由OM Pharma SA (1217 Meyrin 1, Switzerland)提供。liquid form of Pulmonarom (drug product)作为商业产品购买。由于Pulmonarom不知道API(活性主成分)的浓度，因此使用连续体积稀释法来评估oblo诱导的细胞因子释放的差异。如图所示，这两种化合物都由一系列类似细菌的裂解物组成1．

2.6。RV-16蛋白免疫荧光

所使用的RV-16菌株已在前面描述过，并且使用了相同的RV-16种群[19］．基于初步实验，将上皮细胞感染RV-16的0.1,0.5或1mOi（多重感染），最多3天。通过使用抗RV-16抗体（猫＃18758，QED-Bioscience Inc.San Diego，USA）的免疫荧光染色如前所述，通过免疫荧光染色来确定感染率[19］．简单地说，上皮细胞被播种到8孔腔载玻片(Sarstedt)中，并使其粘附过夜。然后用OM-85或Pulmonarom处理细胞24小时，然后用0.1、0.5和1.0 MOI的RV-16感染细胞长达72小时。细胞在4%福尔马林(PBS, 5分钟)中固定，用PBS洗涤2x，用0.05% Triton X-100在PBS中渗透(15分钟)。用2%牛血清白蛋白阻断后(30分钟)，用抗rv -16抗体(1:10 0稀释)孵育过夜(4°C)。PBS冲洗3x次后，玻片用第二种FITC标记的抗鼠抗体孵育(室温1小时)，然后用PBS冲洗3x次。免疫荧光显微镜(EVOS FLoid cell imaging station, Thermo Fisher Scientific)计数RV16阳性细胞数。

2.7。宿主细胞的生存

免疫荧光显微镜(EVOS Floid细胞成像站，Thermo Fisher Scientific)使用双色双参数细胞活力检测试剂(cat# L3224, Thermo Fisher Scientific)检测rv -16感染的BEC在80%亚融合细胞中48小时内的存活率。培养细胞(104个/cm)²）并且允许在生长培养基中粘附过夜。然后将细胞与OM-85或润甘草一起温育24小时，然后在RV-16的0.1,0.5和1.0 MOI感染至最高48小时。将活细胞试剂在37℃下加入30分钟，通过EVOS显微镜监测细胞。细胞数量计数在100×100的面积中 μm，它定义为100％。在相同的区域中计数绿色细胞的数量，表示死细胞。如前所述，在相同载玻片的三个不同区域中测定死细胞的百分比[19］．

2.8。elisa

采用特异性ELISA检测细胞培养上清中分泌的细胞因子，收集细胞培养上清:(i)加入OM-85或Pulmonarom 24小时后，(ii) RV-16感染前(对照)，或(iii) RV-16感染后24小时。获得以下商品化ELISA试剂盒β-defensin-1(抗体在线:beta- defense in 1 CLIA Kit: ABIN6202097)、IFN-β(研发系统:人IFN- β Quantikine ELISA试剂盒:DIFNB0)、IFN-γ（研发系统：DY285）。在小鼠BMDC培养上清液中，通过ELISA试剂盒根据制造商的指示测量细胞因子释放。IL-6和TNF-α试剂盒来自Biolegend和IFN-β来自PBL分析科学。细胞因子的浓度用平均值+/−SEM表示n= 3个技术复制。采用检测细胞提取物中ICAM-1的ELISA试剂盒(ICAM-1 Kit: ABIN414384, antibody Online, Aachen, Germany)检测ICAM-1的表达。细胞裂解，用BCA (BCA蛋白定量试剂盒:ABIN593356, antibody Online)测定蛋白含量。等量的总蛋白质(50μg)对每个样品使用ICAM-1酶联免疫吸附试验(ICAM-1酶联免疫吸附试验)，根据分配说明书进行ICAM-1酶联免疫吸附试验，采用ELISA阅读器(BioRad, Basel, Switzerland)测定ICAM浓度。

2.9。统计数据

无效假设是OM-85或肺源性RV-16感染或细胞反应或细胞因子释放均无影响。在上皮细胞实验中，通过方差分析计算稀释依赖效应的统计量，然后是学生效应t-检验(成对，双侧)，以及后续的Wilcoxon检验(如适用)。值<0.05被认为是显著的。

3.结果

３.１.RV感染与RV-16感染BEC存活

受RV-16感染的细胞的比例（≈100％）不受暴露于增加的RV-16 MOI的影响。在预处理OM-85的最高稀释度的细胞中，RV-16感染显着降低（ ）(图2(一个)）.相反，肺预处理细胞中的RV-16感染未显着降低（图2 (b)）.RV-16感染后的细胞存活率依赖于MOI，并随着RV-16 MOI的增加而下降(未显示)。两种OBLs均能以稀释依赖性的方式提高rv -16感染BECs的细胞存活率。这种保护作用对于两种最高浓度的OM-85稀释剂非常显著(见图)2 (c)； 和0.023分别）和最高的润甘甘油稀释度（ ）(图2 (d)）.原代BEC与BEAS-2B细胞无显著差异。

RV-16感染以moi依赖的方式上调ICAM-1的表达(图)3(一个)）.在所有稀释试验中，这一效应在OM-85和Pulmonarom预孵育的细胞中显著降低(图)3 (b)和3 (c)）.

的分泌β- 以稀释依赖性的方式由OM-85和上皮细胞中的肺细胞中的副85和肺部上调（图4(一)和4（b））.OM-85的刺激效果在稀释度<1：200时变得显着（图4(一))，而Pulmonarom的刺激作用只有在稀释< 1:50时才有意义(图4（b））.BEAS-2B细胞与BEC细胞无明显差异。只有OM-85增加了IFN-的分泌β在BEAS-2B细胞和初级BEC细胞之间没有显著差异(图4（c））.OM-85的刺激作用在稀释<1:200/ml时变得显著，而Pulmonarom在任何稀释试验中都没有达到显著的效果(图4（d））.

3.2。BMDCS的细胞因子

用OM-85治疗小鼠BMDCs，而不是用Pulmonarom，可触发TNF-的释放α和IL-6，且呈剂量依赖性(图)5（a）和5（b））.此外，OM-85可诱导I型抗病毒IFN-的分泌β通过BMDCs，证实了早期人类上皮细胞的结果(图)5 (c)）.

4.讨论

本研究比较了两种相似的OBLs的体外抗病毒作用和免疫诱导。为了比较两种液体OBLs诱导的抗病毒活性，我们决定不使用OM-85商业产品作为胶囊。相反，我们使用它在冻干前的相应的可溶性形式，OM-85液体形式。它是最终药品的药物中间体，含有纯活性成分(原料药)，如Pulmonarom。因此，两种OBLs都含有表面衍生的可溶膜微生物含量，即所谓的病原体相关分子模式(PAMPs)，都来自5个细菌属，包括肺炎链球菌肺炎料，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯菌，moraxella catarrhalis.，金黄色葡萄球菌，链球菌Pyogenes，viridcoccus viridans.， 和Klebsiella ozaenae.如图所示1(a). Pulmonarom是一种商业活性液体，与OM-85仅在3个菌株上有所不同，如图所示1(b)抗病毒防御方面，RV-16感染被用于两种支气管上皮细胞类型(原代和不朽细胞系)。

结果表明，OM-85更有效地减少RV-16-感染和ICAM表达以及诱导释放β- 森林和IFN-β．OM-85对提高宿主细胞存活率也更有效。在rv -16诱导的ICAM-1表达变化中，BEAS-2B细胞与BEC之间的显著差异表明，不朽细胞系可能不能完全反映正常BEC的反应。小鼠bmdc的数据证实OM-85可诱导细胞因子应答，包括抗病毒IFN-β生产，虽然没有可衡量的IFN-β，IL-6和TNF-α用肺泡处理细胞后检测。

流行病学和临床研究提供了证据表明RV感染是呼吸发病率的主要原因，以及气道损伤和重塑的重要原因，这可能导致持续的支气管多动，喘息加剧，并且可能是哮喘[23，24］．

在哮喘和呼吸道感染的范围内，人们普遍认为预防措施是基于加强宿主的免疫系统，从而增加对病原体的自然反应。在此背景下，有报道称OM-85正向影响呼吸上皮细胞的生理和功能，并改善其宿主防御机制[25］．在两项临床研究中，OM-85预防了儿童呼吸道药物感染的复发[7］．尽管存在这些抗病毒性质，但临床研究没有解决OM-85的有益效果的基础。大多数研究侧重于监管免疫细胞，包括T淋巴细胞和天然杀伤T细胞，以及免疫球蛋白的合成[6］．鉴于当前SARS-CoV-2大流行，评估免疫调节剂作为预防性治疗是非常重要的。本研究结果提示免疫调节剂的抗病毒作用可能是多种机制的结合而不是单一机制的结果。

细菌裂解物如OM-85和Pulmonarom都来自5个不同的细菌属，是细菌蛋白、脂质多糖和短链脂肪酸的混合物。然而，由于制造过程的不同，部件的性质可能有所不同。因此，两种细菌裂解液都将包含不同的微生物相关分子模式(MAMPs)， MAMPs将针对不同的模式识别受体(PRRs)。这可能解释了观察到的不同抗病毒效果和先天免疫反应。对于OM-85，其抗菌免疫反应可能在某种程度上与哮喘患者暴露于各种农场微生物成分的“农场效应”相似[26］．

MAMPs通过tlr等模式识别受体诱导宿主防御。据报道，OM-85通过TLR4和TLR2发挥作用，从而激活NFκB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) [27］．此外，有报道称OM-85激活Erk1/2 MAPK，导致Erk1/2 MAPK上调β-防御素与ICAM1下调[19］．后一种效果将通过通过病毒增加主体防御β-防御素，同时减少特定病毒对宿主上皮细胞的结合。在同一研究中，OM-85上调了IFN-的表达β分泌人支气管上皮细胞。在这里，我们表明，在BMDC，OM-85，但不是肺组合，上调类型I IFN-β是针对病毒感染的宿主防御的关键因素。需要未来的调查来评估IF-85抗病毒作用中IFNS免疫调节和IFN的重要性的细节。我们的研究结果表明，在呼吸道感染或体外研究中阻断OM-85诱导的IFN分泌物，将需要在这种细菌裂解物的抗病毒效果中证明其作用。

人类致病性RV的主要类群包括约90%的100个血清型菌株，并以ICAM-1为主要受体结合并感染宿主细胞[28，29］．ICAM-1是一种表达于支气管上皮细胞表面的分子[30.，31］．体外，ICAM-1还介导多晶核白细胞跨气道内皮和上皮单层的迁移及其活化[32，33］．观察到两种OBLs都降低了rv -16诱导的ICAM-1表达，这可能解释为对病毒感染的保护功能。OM-85增加rv -16感染BEC存活的能力支持了这一观点。BECs通过包括tlr在内的模式识别受体(PRRs)识别病毒蛋白，从而激活固有免疫反应。TLR2识别病毒衣壳蛋白，TLR7/8识别存在于核内体室的病毒核酸[17，34，35］．

PRRs对RV的识别导致炎性细胞因子的分泌，包括IFN-α和干扰素-β，抵御病毒的第一道防线[17，34- - - - - -36］．响应病毒感染，BEC也产生和释放微生物β-在调节先天免疫和适应性免疫方面具有广泛功能的防御素[37］．在本研究中，与Pulmonarom相比，OM-85增加了IFN-的表达β在BECs和DCs中提示IFN-增加β释放可能是OM-85诱导的一种重要的抗病毒介质。

增加易复发性病毒感染患者支气管上皮细胞抗病毒防御的可能性是一个有吸引力的治疗目标[13，14，38，39］．在此背景下，有报道称OM-85可以通过激活Erk1/2 MAPK通路，促进BEC防御功能响应RV-16，从而减少ICAM-1表面分子表达，刺激释放β-防御素和病毒相互作用蛋白C1q-R [19］．重要的是，在RV感染前24小时用OM-85预处理可以改善来自对照组和哮喘或COPD患者的BEC的细胞生存;因此，对OM-85没有疾病特异性反应[19］．

因此，OM-85的有益作用可能是不同呼吸相关微生物免疫活性成分特异性混合的结果。因此，可能不可能明确定义一个单一的机制来负责OM-85对病毒感染的有益效果。然而，这并不会降低它对有呼吸道感染复发风险的患者的预防效果。

结论

肺组合和OM-85液体形式是具有相同细菌属的两个类似的替代，具有较小的应变差异。为了研究这种微小的变化如何可能影响抗病毒反应，我们设计了使用两种液体形式的对比研究，比较其诱导的细胞响应和上皮细胞上的抗病毒性质的一些特征，并且最终评估了树突细胞上的选定方面。

考虑到对抑制抑制的研究的限制（肺组），我们使用大量的串行体积稀释度来使我们能够解释结果。该研究表明，两者均不仅引发抗病毒效果，而且还对研究中使用的模型中的OM-85具有较强的抗病毒性能，对人BEC和小鼠BMDC进行了施加不同的产品特异性抗病毒反应。考虑到相同的细菌属性用于产生屈样产物，保护细胞反应的这种重要差异可能不仅可以源于每个屈样产品的泵含量，而且来自用于制造这些产品的过程。目前正在进行进一步的实验以确认这一假设。

数据可用性

原始数据可根据通讯作者的要求提供。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项研究由瑞士CH-1217 Meyrin的OM Pharma SA的M. Roth和G. Rossi两项不受限制的研究资助。

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