遗传演化脓肿分枝杆菌长期抗生素治疗过程中，赋予克拉霉素耐药

摘要

目标．克拉霉素建议作为治疗的核心剂M.横坐标感染，通常要求疗程至少一年，便利性的发展。本研究旨在确定的基本机制在活的有机体内克拉霉素耐药的发展M.横坐标临床分离株。方法．M.横坐标纵向收集来自长期抗生素治疗期间肺部感染患者的分离菌并进行测序。采用PFGE DNA指纹鉴定分离菌株的亲缘关系。进行全基因组比较分析，以确定决定克拉霉素耐药的遗传决定因素。结果．三对最初对克拉霉素敏感，后来对克拉霉素耐药M.横坐标获得分离物。我们发现，在4-16个月的抗生素治疗后，克拉的霉素抗性分离物相对迅速地出现。PFGE DNA指纹纹理表明，克拉的霉素抗性分离物与初始克拉霉素易感素相同。全基因组测序和生物信息学分析确定了含韵霉素抗性分离株的几种基因交替，包括编码Efflux泵/运输器，膜的整体组分的基因，以及tetR和lysR家庭转录调节。结论．我们鉴定了可能编码含有克拉霉素抵抗表型的新因素的基因M.横坐标，这对于预测克拉霉素抗性的预测M.横坐标．

1.介绍

非结核分枝杆菌(NTM)是指非结核分枝杆菌种类结核分枝杆菌复杂和麻风分枝杆菌[1］.越来越认识到，NTM是重要的人群，导致与临床表现不同的临床表现，类似于结核病，如慢性肺病，皮肤病，淋巴腺炎和散发疾病[1］.其中，慢性肺病是临床最常见的综合征[2］.脓肿分枝杆菌已被报道为第二常见的病原体，仅次于分枝杆菌复杂的，在NTM肺病，并且在发生率增加[3.］.肺病引起的M.横坐标与大量发病率和死亡率相关[4.］.

作为M.横坐标是多种抗生素类本质抗性，治疗感染引起的M.横坐标是出了名的困难[5.］.到目前为止，还没有可靠的抗生素治疗方案M.横坐标肺病。当前指南推荐的口服大环内酯类（主要是克拉霉素）的抗生素治疗，与头孢西丁或亚胺培南静脉阿米卡星组合的基础上，药物敏感性测试的结果[1］.然而，治愈率M.横坐标肺部疾病低(约30-50%)，复发率高，即使在成功治疗完成后[6.那7.］.

治疗效果不佳M.横坐标肺部疾病可归因于克拉霉素耐药M.横坐标包括获得性抗性(第3天产生抗性)和诱导抗性(第3天敏感，第14天产生抗性)。目前报道的克拉霉素耐药机制主要涉及药物靶位点的改变，包括23S rRNA基因的突变(rrl.)，赋予获得性抵抗力[8.通过官能甲基转移酶改性rRNA的修饰ERM.(41)具有诱导抗性的基因[9.］.然而，大多数的数据显示之前来自单个时间点的研究病人的治疗过程中。由于在治疗过程M.横坐标肺部疾病需要持续至少12个月的抗生素治疗，在长期治疗期间可能产生克拉霉素耐药性[10.］.理解背后的机制德诺维在治疗过程中慢性霉素抗性的开发对于优化感染治疗同时避免出现抗性的治疗非常重要。在这方面，纵向监测在整个抗生素治疗之前和整个抗生素治疗的敏感性至关重要。

在本研究中，同源配对分离M.横坐标展示最初易感和随后在抗生素治疗期间抗生素抗生素，从同一患者获得，使我们能够比较易感和抗性的菌株并探索潜在的分子机制在活的有机体内对克拉霉素的获得性抗性的发展。我们发现，在4-16个月的抗生素治疗后，对克拉霉素的抗性分离物相对迅速地出现。通过串行的全基因组的生物信息分析M.横坐标分离物，在随后的抗性分离株中鉴定出几种重要的遗传变体，包括编码Efflux泵/输送器，膜的整体组分的基因，以及tetR和lysR家族转录调节因子，在其他细菌中作为抗生素耐药性相关因子被提出。这项工作提供了如何做到这一点的见解M.横坐标产生耐药性在活的有机体内以应对抗生素治疗的选择性压力。

2.材料和方法

2.1。M.横坐标株和临床数据采集

2014年1月至2017年12月，三对临床分离菌株M.横坐标最初是克拉霉素易感，然后变成克拉霉素抗性，从上海肺医院的肺部感染患者的痰中收集抑制速率。患者的临床资料通过图表审查收集。

２.２.细菌鉴定和药敏试验

采用MGIT960培养基培养和对硝基苯甲酸试验对NTM菌株进行初步筛选，并进行分子鉴定M.横坐标通过测序RPOB.和ERM.（41）基因并最后通过全基因组测序确认。然后所有菌株储存于-80℃直至使用。克拉霉素药敏通过微量肉汤稀释法按照CLSI指导原则来确定和以一式三份重复。The breakpoints were interpreted according to (CLSI)-M24-A2 as follows: susceptible, minimal inhibitory concentration (MIC) ≤ 2 mg/L; intermediate, MIC = 4 mg/L; resistant, MIC ≥ 8 mg/L. Antimicrobial susceptibility for other antibiotics, including amikacin, sulfonamides, moxifloxacin, cefoxitin, doxycycline, tigecycline, linezolid, imipenem, and tobramycin, was determined by the Sensititre RAPMYCO panel.分枝杆菌peregrinum(写明ATCC 700686;美国类型文化收藏，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)和金黄色葡萄球菌(写明ATCC 29213;(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)作为对照参考菌株。

2.3。进化距离分析采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）

系统发育距离M.横坐标分离物通过PFGE分析用的方法修改之前的描述[11.］.简而言之,M.横坐标将分离物在7H9培养基中在37℃下培养到对数相，并在细胞悬浮缓冲液（CSB）中收集并重新悬浮至OD600的1.6。将细胞悬浮液混合在1：1的比例中，用1％斑米金琼脂糖（含有1％SDS）混合并将其移液到一次性塞子模具（Bio-rad）中。将塞子在37℃下用20mg / ml溶菌酶裂解3小时。用细胞裂解缓冲液（CLB）替代裂解溶液[50mM Tris / HCl（pH8.0），50mM EDTA和0.1mg / ml蛋白酶K]，并在56℃下用振荡温育（每分钟160轮）．用DDH2O在56℃下用DDH2O洗涤一次塞子15分钟，然后用TRIS（10mm）/ EDTA（1mM）缓冲液（pH8.0）进行五次，每次15分钟。

含基因组DNA的插头用DraI在37°C下消化4小时。在0.5°×°TBE缓冲液[1 M Tris/HCl (pH 8.0)， 0.9 M硼酸和10 mM Na]中，使用CHEF-DRIII系统(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)在1%琼脂糖凝胶上分离酶切DNA₂EDTA]有200 μ2M硫脲。Pulse time was ramped from 5 to 35 s for 19 h at 14°C and a constant voltage of 6 V/cm. Similarity between PFGE patterns was analyzed by computerized band analysis with Bionumerics software version 3.3.

2.4。检测突变rrl.和ERM.（41）

6的全部基因组M.横坐标在这项研究中分离已通过我们以前测序（NCBI bioproject PRJNA488058）12.］.序列rrl.和ERM.(41)从测序数据中提取。突变的存在rrl.和ERM.（41）通过与参考分枝杆菌菌株的同源序列进行序列比对检测基因M.横坐标AATCC 19977通过爆炸。

2．5．全基因组测序数据的生物信息学分析

测序序列最初被绘制到参考基因组上M.横坐标(GenBank accession no. ATCC19977)NC_010397.1使用Snippy v4.3.0/BWA-MEM v0.7.11 (https://github.com/tseemann/snppy.)．变体使用Snippy V4.3.0 / Freebayes v1.1.0-60调用。在随后的获取耐药株对克拉霉素的独特变体通过在随后克拉霉素耐药株比较检测变体和使用bcftools v1.7-17最初克拉霉素敏感株鉴定。

3.结果

3．1.人口学和临床特征

M.横坐标在研究期间，从三名患者中分离出最初克拉霉素易感，然后从同一患者中获取克拉霉素抵抗的分离物。桌子1显示这三种情况的人口和临床特征。患者的BMI是比较低的，这意味着患者体重不足。所有患者支气管扩张。患者2与合并感染结核分枝杆菌，让治疗变得非常复杂。最常见的临床症状是咳嗽和痰。计算机断层扫描表明，所有患者都有多边形支气管切除型，这是多个蛀牙，这与另一份报告一致[13.］.由于3例患者最初AFB涂片阳性，均在确诊前接受多药联合抗结核治疗M.横坐标肺病（详细的抗生素使用情况显示在图中1)．虽然患者均给予长期multitherapy的延续，他们的症状和影像学结果没有改善。其中两个治疗后仍进展并未能转化为痰涂片阴性。

3.2。临床分离株的微生物特征M.横坐标

六的特点M.横坐标分离物示于表2．除阿米卡星和替加环素外，菌株对几乎所有所检测的抗生素都具有高度耐药性。所有菌株均属于基因型A，且具有功能ERM.（41）介导诱导型克拉霉素抵抗力。因此，所有分离物在第14天对克拉霉素的高麦克风，并且随后的分离物中的MIC高于初始分离物。在第3天，初始菌株G142，A38和G139易患克拉霉素。然而，在一段时间的抗生素处理后，相应的后续分离物G179，A243和A137对克拉霉素（开发到获得的克拉霉素抵抗表型）的情况下变得抵抗，而没有药物靶基因的任何突变rrl.，表明存在其他因素，有助于抵抗。

3.3。体内克拉霉素抗性的演变M.横坐标

分析了整个治疗过程中的抗菌药物的使用（图1)．患者1、3痰涂片阳性，培养阴性，确诊前接受异烟肼、利福喷丁、乙胺丁醇抗结核经验治疗约4个月M.横坐标肺部疾病。直到M.横坐标从痰进行培养，治疗方案被切换到克拉霉素，丁胺卡那霉素，替加环素，亚胺培南，利奈唑胺，和左氧氟沙星的基础上，抗生素敏感的结果。由于患者2有一个事先耐药结核病和有严重的药物性肝损伤，治疗对他来说是非常困难的。他一共有7种抗生素，其中包括二线抗结核药物与那些具有抗菌活性收到M.横坐标．在各种抗生素的长期选择性压力下，获得的抗性隔离物M.横坐标对抗克拉霉素，G179，A243和A317在治疗4-16个月后出现。

为了评估随后的耐克拉霉素菌株G179、A243和A317是否来源于相应的最初的克拉霉素敏感菌株G142、A38和G139，我们分析了这些菌株的系统发育距离。PFGE DNA指纹图谱显示，3例患者中耐克拉霉素株与最初的克拉霉素易感株完全相同(图)2)．由此，作为从初始菌株的遗传变异的结果认为随后的菌株中的克拉霉素抗性表型。

3．4．克拉霉素耐药基因决定因素的鉴定

已普遍认为获得的克拉霉素抵抗力M.横坐标是由于rrl.基因(14.那15.］.然而，G179、A243和A317的耐药表型不能用该机制解释，因为G179和A243均未发现突变，而A317仅发现C3042T点突变，该突变在敏感品系G139中也存在。这些结果表明，在这些随后获得的克拉霉素耐药菌株中存在其他尚未确定的机制。为了确定决定这些菌株对克拉霉素耐药的遗传决定因素，将最初对克拉霉素敏感的菌株的全基因组与随后相应的克拉霉素耐药菌株的全基因组进行了比较。

突变概况如图所示3.．共鉴定出35个优质变异，其中8个在G179, 17个在A243, 10个在A317，分布在5个基因间区域和28个开放阅读框(排除ORF中的同义突变)。其中,显著的突变被包含在几个射流泵/转运蛋白基因(Mab_2302 Mab_1006c)、膜的整体组件(Mab_0803 Mab_1555)tetR家族转录调控因子(Mab_1881c)lysR家族的转录调节器（Mab_4409）。其他重要的突变分布在基因间区域，包括孔蛋白的间隔的MspA-的MspA（Mab_1080-Mab_1081）和ESX-1分泌相关调节器ESPR（Mab_0115c）的上游。有趣的是，两种变体（Mab_2074，Mab_0650-Mab_0651）在随后的两个分离株获取克拉霉素耐药同时被识别。

4.讨论

在这项研究中，三个配对的同基因分离物M.横坐标在抗生素治疗过程中，从三名肺部感染患者中纵向收集，让我们监测和研究克拉霉素抵抗的发展在活的有机体内．克拉霉素获得性耐药在多药抗生素治疗4-16个月后出现相对较快。这一发现强调了在临床实践中合理使用抗生素以及在治疗过程中监测病原菌对克拉霉素的敏感性的重要性。与以前报道的获得性克拉霉素耐药菌株不同M.横坐标在这rrl.是突变体，并导致改变的药物靶部位，我们在随后的克拉霉素获得性耐药株发现了其它几个重要的变体，潜在地表示有助于所获取的克拉霉素抗性表型的新因素m .脓肿。

NTM肺部感染由于与肺结核相似的非特异性症状而难以诊断[16.那17.］.因此，额外的微生物学诊断是必要的。涂片镜检和分枝杆菌培养是常用的分枝杆菌鉴定方法。然而，涂片显微镜无法区分NTM结核分枝杆菌，文化需要在获得结果之前几周[18.那19.］.因此，患有阳性涂片的患者将是经验规定的抗亚伯氏抗疗法。在本研究中，患者1和患者3诊断前约4个月内接受异烟肼，二兆内，和乙胺丁醇M.横坐标肺病。在整个治疗过程中，没有观察到症状和放射学结果的改善，这表明迫切需要进行进一步的研究，以发展能够迅速检测和确定分枝杆菌精确种类的方法。

治疗M.横坐标由于该细菌具有高水平的耐药性，肺部疾病比其他NTM引起的疾病更困难[20.那21.］.功效与当前指南缺乏数据支持的安全性。在我们的研究中，治疗方案，患者1和患者3被切换到反M.横坐标根据后诊断方针和药敏试验结果抗生素M.横坐标肺病。但由于药物不良反应、给患者带来不便、费用高，两例患者均未完成亚胺培南、阿米卡星、替加环素、利奈唑胺的疗程。2例合并耐药感染结核分枝杆菌并患有药物诱导的肝损伤。他用二线抗结核剂治疗，结合药物加工抗微生物活性M.横坐标[22.］.虽然被用于这些患者相对标准治疗方案，临床疗效进行了劝阻。有一个研究的缺乏，包括动物研究或临床试验，探索新的治疗方案，提高临床疗效M.横坐标感染。

据报道，长期使用大环内酯类抗生素的过程中，M.横坐标由于相应的突变，出现了获得性克拉霉素耐药菌株rrl.基因(10.］.在本研究中，后续获得性克拉霉素耐药菌株均无突变rrl.，建议涉及克拉霉素抵抗的新机制。通过全基因组测序和比较分析，我们确定了几种可能导致抵抗力的遗传决定簇。其中，在MAB_1006C中发现了两个帧突变突变基质金属蛋白酶(Mab_2302)。Mab_1006c编码MCE(哺乳动物细胞进入)家族蛋白，许多证据表明它是脂质ABC转运体的组成部分。据报道结核分枝杆菌当变得更加耐药时，菌株会减少其毒力[23.那24.］.MCE家族蛋白的突变可能是选择压力的结果，如抗生素治疗。基质金属蛋白酶/ MMPL是外排泵分枝杆菌物种和突变基质金属蛋白酶是导致A317株克拉霉素耐药的原因。TetR是一个庞大的转录调节家族。TetR蛋白最常见的功能是调节外排泵和转运体。Richard等发现TetR家族转录调节因子(MAB_4384)的突变M.横坐标导致MMPS5 / MMPL5流出泵的上调，从而将MIC增加到硫脲唑酮衍生物[25.］.在我们的研究中，Mab_1881c (TetR家族转录调控因子)的移码突变是功能缺失突变，这可能与A243菌株的克拉霉素耐药有关。

我们的研究的一个限制是，在克拉霉素获得性抗性中的变体基因的作用尚未遗传地测试。我们目前正在进行基于基于遗传的任务来阐明这些基因在克拉霉素抵抗中的功能。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者没有利益冲突需要声明。

作者的贡献

李冰、郭琦、毛彦华等对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 81672063, no . 81971973, no . 81800003);上海市科委自然科学基金项目(no . 18ZR1431600, no . 19ZR1442800);上海市科委医学指导计划项目(no .18411970600, no . 19411969600);上海市申康医院发展中心市立医院新前沿技术联合项目上海市卫生和计划生育委员会优秀人才培养计划项目(编号:SHDC12017113);2018YQ55)、上海市重点临床医学中心和重点学科建设项目(2018YQ55);2017 zz02012)。

参考

1. D. E. Griffith，T.Aksamit，B. A.Brown-Elliott等，“官方ATS / IDSA声明：诊断，治疗和预防不泛滥的分枝疾病”美国呼吸和重症监护医学杂志，卷。175，没有。4，第367-416，2007。查看在：出版商网站|谷歌学者
2. D. R. Prevots和T. K. Marras，《人类肺部非结核分枝杆菌感染的流行病学》，胸部医学的诊所，卷。36，不。1，第13-34，2015年。查看在：出版商网站|谷歌学者
3. C. L. Daley和D. Griffith，“由快速生长的分枝杆菌引起的肺病”，“胸部医学的诊所，卷。23，不。3，第623-632，2002。查看在：出版商网站|谷歌学者
4. R. A. Floto，K. N.奥利维尔，L Saiman等人，“美国囊性纤维化基金会和欧洲囊性纤维化协会非结核分枝杆菌的囊性纤维化的个体经营协商一致的建议：执行摘要，”胸腔，卷。71，没有。1，pp。88-90,2016。查看在：出版商网站|谷歌学者
5. S. Luthra，A. Rominski和P.桑德，“抗生素靶修饰和抗生素修饰酶的作用脓肿分枝杆菌耐药性，”微生物学前沿， 2018年第9卷，第2179页。查看在：出版商网站|谷歌学者
6. J. Jarand, A. Levin, L. Zhang, G. Huitt, J. D. Mitchell，和C. L. Daley，“接受治疗的患者的临床和微生物结果脓肿分枝杆菌肺病，”临床感染疾病号，第52卷。5, pp. 565-571, 2011。查看在：出版商网站|谷歌学者
7. 斯托特(J. E. Stout)Koh和W. W. Yew， "非结核分枝杆菌引起的肺部疾病的最新进展"国际传染病杂志，卷。45，pp。123-134,2016。查看在：出版商网站|谷歌学者
8. R. J.Warlace Jr.，A.Meier，B. A.Brown等人，“分离株中的克拉霉素抗性的”遗传基础分枝杆菌chelonae和脓肿分枝杆菌，“抗菌药物和化疗，卷。40，不。7，PP。1676-1681,996。查看在：出版商网站|谷歌学者
9. k·A·纳什，b·A·布朗-艾略特，小r·j·华莱士，《一个新基因，ERM.(41)，可诱导大环内酯耐药的临床分离脓肿分枝杆菌但却没有分枝杆菌chelonae，“抗菌药物和化疗，第53卷，第53期4, pp. 1367-1376, 2009。查看在：出版商网站|谷歌学者
10. F. P. Maurer, V. Ruegger, C. Ritter, G. V. Bloemberg和E. C. Bottger，“获得23S rRNA基因的克拉霉素耐药突变脓肿分枝杆菌在诱导物的存在下ERM.(41),“抗菌化疗杂志，第67卷，第5期11, pp. 2606-2611, 2012。查看在：出版商网站|谷歌学者
11. R. J. Wallace Jr.， Y. Zhang, B. A. Brown, V. Fraser, G. H. Mazurek, S. Maloney，“散发和流行医院菌株的DNA大限制性片段模式分枝杆菌chelonae和脓肿分枝杆菌，“临床微生物学杂志，卷。31，不。10，pp。2697-2701,1993。查看在：出版商网站|谷歌学者
12. B. Li，M. Ye，Q. Guo等，“临床分离株中麦克风分布的测定和对床奎石的易感性的测定脓肿分枝杆菌，“抗菌药物和化疗第62期7日,2018年。查看在：出版商网站|谷歌学者
13. Y. K.Kim，S. Hahn，Y.Uh等，“结核性和非结核病分枝杆菌肺病的可比特征”，国际结核病和肺病杂志，卷。18，不。6，pp。725-729,2014。查看在：出版商网站|谷歌学者
14. R.F. Luo，C.咖喱，N.Taylor，I. Budvytiene和N. Banaei，“迅速检测获得和诱导的克罗米霉素抵抗力脓肿分枝杆菌通过简单的实时PCR测定，“临床微生物学杂志，第53卷，第53期7，pp。2337-2339,2015。查看在：出版商网站|谷歌学者
15. N. F. G. Carvalho, F. Pavan, d. N. Sato, C. Q. F. Leite, R. d. Arbeit，和E. Chimara，“克拉霉素敏感性在分离株中的遗传相关性脓肿分枝杆菌组和基于PCR的分析的潜在临床适用性ERM.(41),“抗菌化疗杂志，第73卷，第2期4, pp. 862-866, 2018。查看在：出版商网站|谷歌学者
16. Y.-S.kwon和w.-j.KOH，“不泛滥的分枝杆菌病的诊断和治疗，”韩国医学杂志，卷。31，不。5，pp。649-659,2016。查看在：出版商网站|谷歌学者
17. W.J.KOH，C. M. Yu，G. Y. Suh等，“肺结核和NTM肺病：AFB涂片阳性痰患者的特征比较”国际结核病和肺病杂志:国际防治结核病和肺病联盟的官方刊物，第10卷，第5期。10，页1001-1007,2006。查看在：谷歌学者
18. K. Jeon, W. J. Koh, O. J. Kwon等，“韩国一家医疗中心AFB涂片阳性痰标本中NTM的回收率”，国际结核病和肺病杂志:国际防治结核病和肺病联盟的官方刊物，第9卷，第5期。9，pp。1046-1051,2005。查看在：谷歌学者
19. D. Griffith，J.Ademian，B. A.Brown-Elliott等，“治疗途径途径肺病中的半定量培养分析”美国呼吸和重症监护医学杂志，卷。192年，没有。6，PP。754-760,2015。查看在：出版商网站|谷歌学者
20. B. A. Brown-Elliott, K. A. Nash, R. J. Wallace Jr.，“非结核分枝杆菌感染的抗菌药物敏感性测试、耐药机制和治疗”，临床微生物学评价，第25卷，第2期3, pp. 545-582, 2012。查看在：出版商网站|谷歌学者
21. R. nesar, E. Cambau, J. M. Reyrat, A. Murray和B. Gicquel，脓肿分枝杆菌:新的抗生素噩梦，”抗菌化疗杂志，第67卷，第5期4, pp. 810-818, 2012。查看在：出版商网站|谷歌学者
22. M. Pryjma，J.布里安和C. J.汤普森，“利福布丁作用于协同作用和杀菌是与前线脓肿分枝杆菌克拉霉素和替加环素是一种有效的治疗组合，”抗菌药物和化疗第62期2018年8日。查看在：出版商网站|谷歌学者
23. K. L. Smith, D. Saini, S. Bardarov等人，“广泛耐药暴发菌株的毒性降低结核分枝杆菌在鼠模型中，“普罗斯一体，第9卷，第5期。4、Article ID e94953, 2014。查看在：出版商网站|谷歌学者
24. P.P.Salvatore，M.C.CoCerra，P.Beel Zur Wiesch等人。，“多药抗性结核分枝杆菌中的耐药性突变的健身成本：一个基于家庭的案例对照研究”中国传染病杂志，第213卷，第213号1, pp. 149-155, 2016。查看在：出版商网站|谷歌学者
25. M. Richard, a . V. Gutierrez, a . J. Viljoen, E. Ghigo, M. Blaise，和L. Kremer，“对药物外排泵独特的四元依赖性调节的机械和结构洞察脓肿分枝杆菌，“微生物学前沿， 2018年第9卷，第649页。查看在：出版商网站|谷歌学者

版权

版权所有©2020李冰等。这是一篇发布在创意公共归因许可证如果正确引用了原始工作，则允许在任何媒体中的不受限制使用，分发和再现。