两例Lacaziosis宽吻海豚(语truncatus在日本)

文摘

Lacaziosis,以前叫做lobomycosis所致Lacazia loboi,是一种人畜共患真菌病中发现人类和海豚和流行的国家在大西洋。尽管日本海岸不是视为一种流行区,摄影记录lacaziosis-like皮肤损伤被发现宽吻海豚(语truncatus)迁移的Goto群岛(日本长崎县)。我们诊断2例lacaziosis宽吻海豚在同一海岸捕获的同时在日本领土临床特点的基础上,细胞学、组织病理学、免疫测试,检测43 kDa糖蛋白编码基因的部分序列(gp43nested-PCR系统)。从本例肉芽肿性皮肤损伤类似发现在动物从流行地区,包含多个出芽和链immune-staining圆酵母细胞和积极的反Paracoccidioides取代巴西橡胶树血清是一种真菌物种有关l . loboi;然而,gp43基因序列来自当前情况下显示94.1%的同源性p .取代巴西橡胶树和84.1%,l . loboi。我们确认了病原体目前情况下不同基因型的l . loboi从亚马逊地区。

1。介绍

Lacaziosis是肉芽肿慢性真菌引起的皮肤感染Lacazia loboi大西洋沿海水域和流行的拉丁美洲国家(1- - - - - -3]。有趣的是,l . loboi是一个姐姐分类与系统发育关系密切Paracoccidioides取代巴西橡胶树,这是一种高致病性真菌物种也在拉丁美洲国家流行4]。lacaziosis疾病引起,原名Jorge Lobo病(5,6]或lobomycosis直到2005年(7]。

疾病的特点是慢性keloidal皮肤损伤伴有瘙痒,燃烧的感觉,疼痛(2]。主机包括人类和3种海豚:宽吻海豚(语truncatus)、印度洋宽吻海豚(语aduncus),河口海豚,“costero”(Sotalia guianensis)[8]。只有一个dolphin-to-human感染一直在报道一个海豚训练师在荷兰人接触受感染的动物,建议lacaziosis应该被认为是一种人畜共患真菌感染(9,10]。

Lacaziosis通常是发现在热带的海拔200米以上,潮湿,或亚热带森林平均温度24°C和2000毫米以上的年降雨量(1- - - - - -3,8]。的自然宿主l . loboi是未知的;然而,它的栖息地可能在农村环境的基础上,观察到分布的疾病,和土壤和植被似乎可能的感染源。Lacaziosis海豚表明一些水生水库也存在(2,3]。

人类病例在巴西、哥斯达黎加、巴拿马,委内瑞拉、哥伦比亚、圭亚那、苏里南、法属圭亚那、厄瓜多尔、秘鲁、玻利维亚、洪都拉斯和墨西哥。某些情况下也被报道在美国,但这些患者认为是感染在委内瑞拉,加拿大,荷兰,苏里南,法国,南非1- - - - - -3,8,10),和希腊(11)接壤国家大西洋。有趣的是,一个未经证实的案例被报道从孟加拉国12)这不是一个流行区。

另一方面,鲸类的病例在巴西13],苏里南[14),佛罗里达州和北卡罗来纳州(美国)15- - - - - -18)、墨西哥(19),比斯开湾的(西班牙)9),西班牙的海豚起源于古巴(20.),从佛罗里达和夏威夷的宽吻海豚运输(21]。此外,lacaziosis-like病例中观察到印度洋-太平洋地区宽吻海豚在马约特岛海域靠近马达加斯加,在印度洋(22)、委内瑞拉、哥伦比亚、厄瓜多尔、秘鲁、智利、巴西(23),转到岛屿,长崎县在日本九州地区的海24]。因此,lacaziosis lacaziosis-like疾病流行在大西洋,太平洋和印度洋(23]。根据Kiszka et al。22),这种lacaziosis-like疾病非常类似于lobomycosis但缺乏组织学诊断(24]。除了来自西班牙的一个案例中,大多数情况下被摄影和宏观没有病理,诊断血清学的或分子生物学数据(20.]。

致病真菌的物种l . loboi,很难文化除了动物通道(2,3,8,10]。因此,lacaziosis的诊断是根据临床症状,病理观察,免疫交叉反应的测试Paracoccidioides取代巴西橡胶树一种真菌密切相关Onygenales(1- - - - - -4,7,8,10]。此外,诊断似乎很难证实流行地区以外,没有医生或兽医会考虑lacaziosis当他们遇到慢性肉芽肿keloidal皮肤损伤在人类或海豚。

本研究的目的是建立一个诊断的两例lacaziosis宽吻海豚同时捕获相同的日本海岸和照顾个人水族馆,临床特点的基础上,细胞学、组织病理学、免疫测试和检测43 kDa糖蛋白编码基因的部分序列(gp43相应的)p .取代巴西橡胶树(4,7]。

2。情况下

2.1。案例1

雄性宽吻海豚(语truncatus),约为17岁,被在2007年日本沿海地区和照顾在户外条件下在一个水族馆。当时的体重和体长的死亡是280公斤和303厘米,分别。

海豚的睾酮水平下降到小于1 ng / mL 2010年3月开始。后面的海豚的皮肤肿了起来在2010年7月。2010年8月,皮肤湿疹共同作用大约20×25厘米大小(数字1(一)和1 (b))。动物收到抗生素没有效果。血液β葡聚糖水平22.4 pg / mL (> 6 pg / mL被认为是真菌感染阳性根据商业实验室)。检查皮肤损伤包含类酵母菌结构,由一个商业病理学实验室。海豚的病情被诊断为真菌感染,和盐酸terbinafine管理口服剂量的2毫克/公斤SID。但是,没有改善。

2010年10月,病变扩大,痛苦被触诊发现。管理氟康唑口服800毫克的剂量(2.7毫克/公斤)开始;然而,没有看到效果。动物的体温升高略在37°C或更多。根据汉普顿et al .,深体温通常范围从37°C到37.5°C在活动期间;然而,温度降低后睡觉和喂养时期(25]。

2010年11月,体温下降(35°C),和血液白细胞的数量增加到33000个细胞/μL,而正常数量的变化从5000年到9000年μL在圈养海豚26]。病变的大小大约是30×35厘米。有丰富的小管状器官病变的边缘(图2)。活检也完成了。病变的局部温度大约40°C,检测到的温度记录(图3(一个))。的回波图像病变显示入侵仅限于皮下结缔组织,没有扩展到肌肉(图3 (b))。圆形或多个出芽酵母细胞组成的球形梨状母细胞(4 ~ 12μ米直径)与一些较小的子细胞(小于0.5 ~ 6μ毫米直径)连接通过一个狭窄的基础(小于0.5μ0.5米宽度和μ米长)被发现的涂片检查皮肤真皮沾染了染色样本,周期性acid-Schiff反应(PAS),和Gomori乌洛托品(GMS)(数据的方法4(一)- - - - - -4 (c))。

2010年12月19日,动物表现出自发的增加呼吸比率表明较低的生命体征。我们推测,海豚是患有败血症,并试图管理流体替换;然而,没有反应。第二天,动物已经死了。

化脓性肺炎和肝衰竭时发现尸体解剖。金黄色葡萄球菌和摩根氏菌属morganii被孤立的肺和血液。我们的结论是,死亡是脓毒症的原因。此外,解剖皮肤样品培养在马铃薯葡萄糖琼脂(Difco马铃薯葡萄糖琼脂,Becton,迪金森和公司的日本,东京,日本)补充100 mg / L的氯霉素和Mycosel琼脂(洗液Mycosel琼脂,Becton,迪金森和公司日本)板块在25岁和35°C 4周结果呈阴性。

丰富的类酵母菌细胞在皮肤损伤检测与苏木精和伊红染色,不是和GMS(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。大部分的酵母细胞出现为链,而多个出芽酵母细胞连接通过狭窄的基地母细胞也被检测到。

免疫组织化学,部分从皮肤损伤兔多克隆抗体对孵化p .取代巴西橡胶树这是一个有关物种l . loboi16小时在4°C。有界抗体检测与辣根过氧化物酶共轭anti-rabbit二级抗体(Histofine简单染色MAXPO;Nichirei、东京、日本)和3、3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride(民建联、向量实验室Inc .,伯林盖姆,CA,美国)发色体。酵母细胞反应积极immune-staining反p .取代巴西橡胶树兔血清(图5 (d))。

获得的血清在死亡略有沉淀线对真菌细胞抗原免疫扩散试验p .取代巴西橡胶树检测到宏观观察缝隙照明系统。

检测43 kDa的糖蛋白编码基因(gp43)与参考序列的p .取代巴西橡胶树lutzii页,l . loboi尝试,因为足够的基因库中数据序列数据库和其高同源性(7]。

检查或石蜡包埋标本检查。新鲜的样本与70%乙醇固定至少一夜之间,切成大约5×5×5厘米³大小的块,放入1.5毫升大小无菌超小型电子管。样本用无菌水冲洗3次在13201 g离心5分钟,0.5毫升DEXPAT(豆类,大津,日本)解决方案DNA洗脱是补充说,他们在100°C加热10分钟。然后包含组织样本和DNA的超小型电子管洗脱溶液冷却在冰和离心10分钟的13201克。浮在表面的被收集和存储为原油DNA的解决方案。石蜡包埋组织标本,10的3部分μ米厚的石蜡包埋组织被放置到微管(1.5毫升)和0.5毫升DEXPAT解决方案是补充道。后煮10分钟。,the tubes were centrifuged at 13,201 g for 10 min, and the supernatants were stored as crude DNA solutions. After being purified by an ethanol precipitation method, the DNA solutions were processed to amplifygp43通过一组引物gp43的p .取代巴西橡胶树(27]。那是因为这两个p .取代巴西橡胶树和l . loboi是密切相关的真菌物种(7和显示更高的同源基因序列4]。

我们把2.5μ2.5 L的样本μL 20点引物美(5′TGC TGC GGC GGG GTT AAA CCA TGT颈- 3′)和ATO (5′GTT GTG GTA TGT GTC手枪GTA广汽三大′)(27),17.5μL 0.2毫升蒸馏水的PCR管与一个准备好珠(Amersham法玛西亚,东京,日本)。变性的反应混合物受到1周期在95°C 4分钟,40周期放大在94°C 1分钟,50°C 1.5分钟,72°C 2分钟,然后最后一个扩展在72°C 10分钟步PCR热循环议员(豆类,大津,日本)。在第二轮PCR扩增,第一个PCR产品是由乙醇沉淀处理方法,和相同的PCR反应是重复。

PCR产品约550碱基对大小乐队放大新鲜和石蜡包埋组织样本。序列是由一个直接测序法使用ABI棱镜3100测序仪(应用生物系统公司)标记引物的美和ATO (28]。与GENETEX-MAC DNA序列是一致的遗传信息处理软件(软件开发有限公司,东京,日本)。可靠的由471个碱基序列经石蜡包埋组织样本;然而,活检样本未能确认序列。这个序列的加入数字注册为AB811031基因库的数据库。序列在集群包含本地化p .取代巴西橡胶树,p . lutzii,l . loboi通过爆炸搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

471个碱基对序列显示94.9%的同源性p .取代巴西橡胶树(PBU26160) [29日),87.7%p . lutzii(XM00279244), 84.1%l . loboi(EU109947) [4)(表1)。相关真菌物种的同源性Paracoccidioidesspp,等Ajellomyces皮炎(XM_002624715)和答:capsulatus(XM_001540694)从基因库中检索数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/),分别为63.6%和66.3(表1)。

的基础上我们诊断海豚lacaziosis皮肤损伤的临床特点,细胞学和组织病理发现免疫染色和免疫扩散试验,和分子生物学研究。

2.2。案例2

一只雌性宽吻海豚(语truncatus),估计是5岁,于2007年被日本沿海地区与例1同时海豚和照顾在户外条件下在一个水族馆在同一机构的案例1 2年。然后在场的动物被送往水族馆在哪里照顾直到死亡。当时的体重和体长的死亡是175公斤和240厘米。

海豚有两个在上眼睑的皮肤肉芽肿病变(2011年2月数据6(一)和6 (b))。2011年3月的损伤扩展。我们假设动物可能遭受lacaziosis并进行活检。有一些类酵母菌组件的病灶染色涂片染色方案(数据未显示);然而,酵母细胞没有被组织病理学gp43没有放大。此外,假丝酵母glabrata检测到的呼吸。

2011年5月,我们在病变活检和烧灼。c . glabrata和黑曲霉被发现在呼吸。酮康唑霜的动物收到局部应用和伊曲康唑口服1000毫克/身体其次是抗生素和氢化可的松。此外,肉芽肿在口腔出现(图质量7(一))。

我们开始测量血液β葡聚糖水平在2011年6月,发现8-41 pg / mL在2011年7月和8月,这表明真菌感染。

2011年9月,一个新的皮肤病变出现在鳍(数据未显示)。一些鲨鱼咬造成的疤痕也成了肉芽肿(图7 (b))。我们这些病变做了活检,发现多个出芽类酵母菌细胞的细胞学的观察样本染色染色(图8(一个)),安装有5% KOH(图8 (c)),并添加乳酚棉蓝色(图8 (c))和GMS(图8 (d))。皮肤活检样本5月,6月,2011年9月在马铃薯葡萄糖琼脂培养补充100 mg / L的氯霉素和Mycosel琼脂板在25岁和35°C 4周是负的。

dna来自案例2没有放大通过PCR条件用于案例1。因此,我们设计了一套内部引物:和F1 (5′gtc ATC手枪CTC猫GGT GTT AAG-3′)和和R2 (5′ggc AGA RAA GCA苑棉酚a - 3′)的引用gp43序列从p .取代巴西橡胶树(PBU26160 AY005408和AB304681)l . loboi(AY697436和EU109947);决定在1-derived DNA序列被GENETYX-MAC版本一致。12.0遗传信息处理软件(GENETYX公司(日本东京)。PCR条件第一PCR是一样的。

我们发现382个碱基对的部分序列gp43显示身份的100%来自由nested-PCR系统案例1的活检样本收集在上面的时间。

血清还显示略有沉淀线对真菌细胞抗原的免疫扩散试验p .取代巴西橡胶树(数据没有显示)。

基于这些临床特点及细胞学和分子生物学观察,我们做了一个lacaziosis的诊断。

2012年12月海豚突然去世。动物表现出更高的呼吸率每分钟7倍自2012年夏天。宏观发现肠道阻塞引起的心脏疾病,肺部慢性炎症,脓性囊肿疤痕从腐蚀的动物没有类酵母菌细胞病变。

3所示。讨论

目前2海豚显示慢性肉芽肿性皮肤损伤的代表第一个例子lacaziosis从太平洋临床诊断的基础上,细胞学,组织学,血清学和分子生物学数据。虽然很多情况下lacaziosis-like疾病海豚从厄瓜多尔,哥伦比亚,秘鲁和智利太平洋沿岸的记录,他们被肉眼检查诊断和摄影没有病理和分子生物学数据(23]。此外,一些lacaziosis-like疾病已被记录在海豚在日本海域24];然而,这些病例诊断的照片。因此,目前的情况下是第一个从太平洋lacaziosis推荐的诊断根据定义Kiszka et al。22)如下:lacaziosis-like疾病非常类似于lobomycosis但缺乏组织学诊断。

血清交叉反应的免疫扩散试验p .取代巴西橡胶树抗原和积极immune-stainingp .取代巴西橡胶树抗血清lacaziosis(曾被报道为特征30.]。略在免疫扩散试验阳性反应p .取代巴西橡胶树抗原和积极的结果在immune-staining匹配人类lacaziosis巴西。

建立一个诊断lacaziosis需要临床数据,细胞学的观察、病理技术、免疫学方法,检测特异性的基因,因为文化的困难(2,3,8,10]。此外,似乎不太可能,皮肤病变的菜花样湿疹海豚会被视为lacaziosis流行地区之外。在这种情况下,分子生物技术是有用的。

一般来说,真菌物种的识别是基于内部转录间隔区(ITS) 1 - 5.8 - s - - 2区域的核糖体RNA(其rRNA)基因序列有超过99%到98之间的多样性物种或至少95%甚至与更高的种内的真菌物种多样性(31日]。不过,我们未能发现其核糖体rna基因从海豚的样品目前的研究并不能与那些从大西洋(20.]。

有趣的是,Esperon等人报告说,该地区的核糖体RNA序列来自海豚生活在大西洋更相关p .取代巴西橡胶树比l . loboi(20.]。预设情况下还显示密切关系的基因型gp43来p .取代巴西橡胶树。进一步的研究可以证实lacaziosis亚马逊地区的基因型。

lacaziosis流行在日本海域的毒性仍然未知;然而,海豚之间的疾病似乎是致命的动物,花了一段时间以来在同一个部落遭受lacaziosis造成相同的基因型。他们可能同时感染或接收病原体接触,和/或流行的部落。

Lacaziosis有时导致海豚(免疫失调32]。虽然我们不能评估免疫标记,目前动物遭受了致命的结果造成系统性细菌感染或心脏和呼吸问题,表明他们患有严重的免疫紊乱。

日本是一个海洋国家。许多人在日本接触大海和海洋产品:不仅渔民,而且公众通过游泳,钓鱼,划船,参观海洋水族馆。因此,我们推测可能存在一些潜在的人类lacaziosis病例。

4所示。结论

我们诊断2例lacaziosis宽吻海豚的基础上临床,细胞学,组织学,血清学和分子生物学数据,证实了病原体在目前的情况下是一个不同基因型的l . loboi从亚马逊地区。

利益冲突

相应的作者,若佐野宣称没有利益冲突向琉球大学的没有。h24 - 763。

确认

本研究支持部分的特殊研究基金会对新出现和重新出现感染卫生部、福利和劳动(批准号h - 21 shinkou - 004)。作者表达自己的感谢女士美智子Murata (Azabu大学)的初步测序技术支持gp43。

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