肾上腺嗜酸细胞肿瘤伴重要线粒体类固醇激素生成蛋白异常丢失:18kda Translocator蛋白

抽象的

肾上腺产生各种激素，在调节血压，电解质稳态，代谢，免疫系统抑制和身体对压力的情况下发挥关键作用。肾上腺肿瘤可以是无症状的，或者可以过度产生导致不同临床表现的某些激素。多胞肾上腺肾上腺瘤是肾上腺皮质中的细胞中产生的不常见的肿瘤，并显示细胞质线粒体数量的特征增加。由于甾体制率的速率限制步骤包括通过18-KDA易偶蛋白（TSPO）进行穿过线粒体膜的胆固醇的运输，我们评估了使用残留肾上腺肾上腺素瘤的情况下TSPO的表达患者作为内部控制。与相邻的正常肾上腺组织相比，我们观察到肾上腺细胞肿瘤细胞中TSPO免疫荧光表达的显着损失。我们进一步通过使用Western印迹分析来进行肿瘤和正常肾上腺细胞中的TSPO表达来证实该发现。我们的研究结果可以提出TSPO在肾上腺皮质瘤的这种情况下的TSPO潜在作用。

1.介绍

肾上腺嗜酸细胞瘤(AON)是罕见的，通常良性，无功能的肿瘤发生在肾上腺皮质，偶尔显示边界或恶性临床病程。组织学分类系统(即Weiss系统)通常可以预测常规(非嗜酸细胞性)肾上腺皮质肿瘤的侵袭性行为;然而，AON的组织形态学特征并不总是与临床结果相关[1- - - - - -3.]．

AON由嗜酸性细胞组成，其定义为约为正常肾上腺皮质细胞两倍大小的大嗜酸性细胞，中央核大，核仁突出，具有丰富的、颗粒状嗜酸性胞浆，继发于线粒体显著增加[4]．超微结构的含量，用肿胀的线粒体包装。最近的报告强烈支持异常的类化事件在AON发病机制中的重要作用[5]．

18-KDA译备器蛋白（TSPO）是一种普遍存在的线粒体核编码蛋白，其在肾上腺和性腺等类别腺体器官中上调[6，7]．其主要功能包括促进胆固醇从内部线粒体膜的迁移，以通过胆固醇侧链切割酶（CYP11A1）转化为孕苯胺[8，9]．因此，通过线粒体膜运输胆固醇被认为是甾体制度的速率限制步骤[8]．由于胞质内线粒体明显增加是AON的必要条件，我们决定用免疫荧光方法研究1例AON的TSPO表达。有趣的是，我们在AON细胞中发现了TPSO表达的反常缺失，并通过Western blot半定量证实了TPSO表达的缺失。

2.案例介绍

49岁女性患者，除偶发性偏头痛外，无明显既往病史或手术史，就诊于杰克逊纪念医院急诊室，主诉2周腹胀和腰痛。初步检查发现一名正常女性，生命体征在正常范围内，右侧腹部不适，怀疑为肾结石。作为初始检查的一部分，患者腹部CT扫描显示右侧肾上腺15cm肿块(图)1(一))．未发现肾结石或肾盂肾炎征象。实验室检查包括血清皮质醇(5.7 mcg/dL，正常范围:8:00 - 4.3-22.4 mcg/dL)、醛固酮(<4.0 ng/dL，参考文献:≤21 ng/dL)、促肾上腺皮质激素(12 pg/mL，参考文献:<47 pg/mL)检测无显著差异。病人接受了手术切除肿块。切除的标本由一个包覆良好的椭圆形肿块和明亮的金黄色实质组成。右侧肾上腺靠近肿块(图1 (b))．福尔马林固定后肿瘤的显微镜检查证明了由大型生物细胞组成的肿瘤（图1（c））核粘膜局部区域（图1（c）， 插）。通过电子显微镜确认增加血小杂体粒细胞粒细胞的存在（图1（d）)．没有观察到核分裂象。根据Bisceglia等人提出的分类[1[肿瘤大小和没有动力学，坏死，囊肿和正弦侵袭表明，这是AON可以覆邻边缘恶性潜力。患者的后勤课程不起眼，不需要进一步治疗。目前，手术后四年，患者活着，无肿瘤，以及她正常的健康状况。

2.1。免疫荧光检测肿瘤细胞中TSPO表达明显降低

为了评估TSPO的表达，我们从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中获得了额外的未染色的切片，包括患者的肿瘤和邻近正常肾上腺(内对照)的代表性切片。2个载玻片在室温(RT, 24℃)二甲苯中孵育(2次10分钟)后脱除。将脱去的组织切片用一系列乙醇(100%、100%、70%、70%和50%)重新水合，在rt条件下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)孵育15分钟。孵育后，如前所述，用免疫荧光对切片进行TSPO染色[10]．根据制造商的说明，使用探测TSPO（FL-169，Santa Cruz Biotechnology，Inc。，达拉斯，德克萨斯州，猫＃20120）使用，达到1：75稀释。荧光HRP缀合的二抗（Alexa粉-488山羊抗兔IgG（H + L））以1：200稀释使用。用Zeiss LSM510 / UV Axiovert 200 M共聚焦显微镜（Carl Zeiss，Peabody，Ma，USA）审查了幻灯片。从肿瘤细胞和正常肾上腺捕获的多个图像在正常相邻的肾上腺腺体中显示出强烈的免疫荧光阳性（图2（a）)，肿瘤细胞中TSPO的表达明显减少(图2 (b))．

2.2。Western Blot检测TSPO半定量证实肿瘤细胞中部分表达缺失

更精确地评​​估肿瘤细胞中核和细胞质TSPO表达的丧失并确认免疫荧光结果，从FFPE未染色的载玻片中解剖映射肿瘤和正常肾上腺组织并进行免疫印迹。简而言之，通过在二甲苯中温育（两次10分钟）通过在室温下孵育FFPE组织切片。然后用梯级系列的乙醇（100％，100％，70％，70％和50％）再水化脱碱化的组织切片，并在PBS中在室温下温育15分钟。将孵育后，将肿瘤和正常的肾上腺组织分离出载玻片并置于两个单独的塑料管中。将管以16,000×g沉淀5分钟，重复孵育/离心步骤两次。组织样品在通风橱中短暂地风干。将细胞颗粒重新悬浮于200 μ.l冷缓冲液A，由10 mM HEPES (pH 7.9)， 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1μ.M Dithiothreitol（DTT）和完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche，Mannheim，德国）。然后将沉淀物在冰上温育15分钟以使细胞膨胀，之后15 μ.加入10%的NP-40，彻底旋转40秒，4℃，3000rpm离心3分钟。将得到的上清液用于细胞质TSPO测定(等量蛋白，12.4μ.g在sds -聚丙烯酰胺凝胶上装载，用TSPO抗体进行Western blot分析，如前所述[11)，球团(核馏分)在30分钟内重悬μ.L冷缓冲液B由20mM Hepes（pH7.9），0.4M NaCl，1mM EDTA，1mm EGTA，1组成 μ.M DTT和蛋白酶抑制剂。然后将小球放在冰上，每2分钟旋转15秒，持续15分钟。然后将核提取物在4℃下以13000 rpm离心5分钟。等量的蛋白质(21.6μ.G）从上清液（含有核提取物），如上所述进行加载蛋白质印迹分析，与TSPO抗体进行。通过碘化钛染色分析核提取物的质量，其表示纯度为92-96％。主要TSPO抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc。，达拉斯，德克萨斯州，猫＃20120）用于1：1000稀释。Beta Actin（ACTBD11B7，SC-81178，Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，USA）和Lamin A / C（Cell Signaling Technology，Beverly，Ma，USA）抗体分别为1：5000和1：750。用抗兔和抗小鼠次级抗体（矢量实验室，Burlingame，CA，USA）用于1：3000稀释。用Chemi-imager（Alpha Innotech，San Leandro，CA，USA）测定带的光密度，数字成像系统和结果用Sigma Scan Pro（Jandell Scientific，San Jose，CA，USA）定量为A.管家蛋白乐队信号的比例（Lamin A / C和β-肌动蛋白，核和胞质标记物等)。实验采用同一样本的4个不同组织切片，Western blot条带的平均强度采用Tukey多重比较试验。统计学意义为值= 0.05。如图所示2（a）和2 (b)(胞质部分)和图2 (c)和2 (d)（核级分），来自两种不同肿瘤切片的代表性半定量免疫印迹显示出在72.4的肿瘤样品中的TSPO表达的显着降低，与各自的对照相比，核零下的77.1％和77.1％的72.8％和76.8％降低（ )．

3.讨论

Weiss肾上腺皮质肿瘤分类系统已被广泛采用，主要依据(有丝分裂率高、不典型有丝分裂、淋巴血管浸润)和次要标准(体积大、重量增加、坏死、包膜浸润、窦状浸润)来区分良恶性肿瘤[3.]．存在一个主要标准表示恶性，1至4个次要标准表示潜在恶性不确定(边缘性)，没有所有主要和次要标准则表明临床行为良性[3.]．虽然这种分类系统在准确预测常规(非嗜酸细胞性)肾上腺皮质肿瘤的生物学行为方面是有用的，但它在AON的应用是值得怀疑的。在一系列10例AON中，我们回顾并修改了Weiss系统标准，以评估其在嗜酸细胞肿瘤变异中的可能应用。使用这种新的分级系统，10例中有1例必须在肿瘤复发后进行修订，以最终判定为恶性[1]．就成像研究而言，肿瘤大小低于4-5厘米的截止值来表明良性行为[12]．然而，在鼻细胞瘤形成的情况下，肿块的大小尚未证明可靠地预测肿瘤行为。一些非特异性的结果如脂肪浓度（几乎所有恶性病变是脂质差），并且在CT扫描上的衰减（10 Hounsfield单位或更少）已被证明有助于使这种差异化[12，13]．

已经广泛记录了这些关节细胞肿瘤显示次级嗜酸性染色的特征嗜酸性染色，其占线的积累，这可能占据高达60％的细胞质[4]．线粒体浓度的增加伴随着逐渐压迫，有时是其他细胞质细胞器的消失[14]．由于这类肾上腺皮质肿瘤罕见，而且免疫组化研究在大多数报道的病例中并不一致，因此它们的免疫表型特征尚未完全确定[4，15]．然而，所研究的病例表明了用于平节，Melan-A，突触蛋白和抑制蛋白的弥漫性积极性，​​而S-100和Chromogranin已经一致为负[15]．在一些情况下，使用具有抗线粒体抗体的免疫阳性已被用于证实肿瘤真正的牛毒细胞[16]．

TSPO存在于体内几乎所有组织的外线粒体膜中[17]．It is part of a complex of proteins (i.e., StAR, PKA, ACBD3, and VDAC1) that function together by forming a tansduceosome that facilitates cholesterol transport from the outer to the inner mitochondrial membrane for its conversion into pregnenolone by cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450 enzyme CYP11A1 [8，9]．最近，关于TSPO在细胞内稳态和类固醇生成中的关键作用一直存在争议。虽然一些作者最初提出，这一关键作用是基于对TSPO敲除小鼠的实验，这些小鼠的胚胎没有存活，但其他人重复了类似的实验，得到了不同的结果[18- - - - - -23]．然而，在癌症领域，一些研究发现在癌细胞系和结肠、乳房和前列腺的肿瘤活组织检查中TSPO蛋白表达增加[19- - - - - -21]．此外，在前列腺腺癌的特定情况下，TSPO蛋白表达是转移前列腺癌样品中最高的，其中增加的表达也与疾病进展相关[19]．最近，TSPO被证明是调节核基因表达的线粒体到核信号通路的一部分，TSPO水平与肿瘤致瘤性和/或恶性肿瘤的增加直接相关，可能是一种促进细胞凋亡和降低肿瘤致瘤性的机制。从而提示良性肿瘤没有TSPO水平升高[6，24- - - - - -26]．然而，我们观察到传统的肾上腺皮质癌有广泛的TSPO表达，从无表达到TSPO表达明显增加[27]．Batarseh和papadopoulos [17)考虑TSPO.作为一种高度保守的管家基因，预计将永久激活。最近,TSPO.基因被认为是癌症化疗的新靶点[22]．有可能改变与线粒体和胆固醇转运相关的多种细胞过程的调节可能部分是通过仍然未知的机制的无限制生长[17，19，23，28- - - - - -33]．

而以往的研究[32我们的研究表明了肾上腺皮质和其他肿瘤中的可变TSPO表达，代表了一个AON中TSPO表达的第一个描述。当前案例是不寻常的，有趣的是，当通过免疫荧光评估时，TSPO表达在肿瘤细胞的线粒体中矛盾，与患者的正常肾上腺腺体相比。当通过蛋白质印迹直接半分解蛋白质的存在进一步探索这些发现，在肿瘤和患者的正常肾上腺细胞中确认表达的高达77％的表达降低。While our findings in this one particular case could represent a coincidence, we believe that the fact that a tissue section including the patient’s normal adrenal gland adjacent to the tumor used to perform all tests argues otherwise, particularly, because deparaffinization, immunofluorescence, and Western blotting were performed on tumor and normal cells at the same time on the same slide in several occasions. Furthermore, preliminary results on the expression of TSPO in adrenocortical neoplasms in a study performed by our group employing immunohistochemistry demonstrated variable TSPO expression in tumors arising in the adrenal cortex, particularly adrenocortical carcinomas [27]．

也有可能，线粒体的增加可能是一种代偿现象，可能与肿瘤生长部分相关。虽然我们的研究结果可能表明，TSPO表达缺失可能在这例肾上腺皮质嗜酸细胞瘤的肿瘤发生中发挥作用，这可能与类固醇生物合成缺陷有关，需要更多的研究，包括大量AON的病例来验证这些发现，并确定TSPO在包括AON在内的肾上腺皮质肿瘤的发病机制中的作用。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

Arumugam R. Jayakumar由Stanley J. Glaser Research Grant和Aasld / American Liver Foundation Grants支持。Roberto Ruiz-Cordero是由迈阿密/杰克逊纪念医院大学病理部的内部研究资助的内部研究资助。

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