文摘
客观的。长非编码RNA neuroblastoma-associated成绩单1 (NBAT1)是涉及各种癌症的恶化。然而,其在子宫内膜癌的生物功能(EC)仍然是未知的。方法。miR-21-5p NBAT1的水平,在EC细胞中PTEN和EC组织被RT-qPCR检查。免疫印迹进行评估的PTEN蛋白表达。dual-luciferase记者进行了试验探索NBAT1之间的交互,miR-21-5p, PTEN。NBAT1对电子商务的影响扩散转移,和细胞凋亡被CCK-8评估,transwell化验,伤口愈合,流式细胞术。miR-21-5p模仿或NBAT1 + miR-21-5p转染到HEC-1A和石川细胞调查是否NBAT1监管电子商务通过擦拭miR-21-5p肿瘤发生。结果。NBAT1表达下调,miR-21-5p是EC细胞和肿瘤组织的调节。超表达NBAT1抑制增殖、迁移和入侵EC细胞和促进细胞凋亡的能力。NBAT1直接结合和负调节miR-21-5p EC。miR-21-5p模仿逆转的影响lncRNA NBAT1过度EC细胞的增殖和迁移。PTEN是miR-21-5p的下游基因。通过擦拭miR-21-5p lncRNA NBTA1提升PTEN的表达。结论。在EC lncRNA NBAT1作为一个肿瘤抑制通过调节PTEN骗取miR-21-5p。
1。介绍
子宫内膜癌(EC)是目前最常见的女性生殖系统癌症,仍是最致命的妇科恶性肿瘤(1,2]。EC的发病率提高了全球增长的结果老年人和上升的肥胖率3]。EC的死亡率呈上升趋势,严重威胁女性健康的在中国4]。值得注意的是,它已经表明,复发和转移的形成和发展是至关重要的阶段EC (5,6]。创新的诊断和治疗近年来电子商务发展。然而,各种限制发生阻碍EC疗法的有效性在实践中(7]。此外,EC有一整套的治疗副作用,包括不孕症、下肢淋巴水肿,和痛苦8]。证据表明,肿瘤细胞迅速增殖和血管生成通常导致子宫内膜癌复发(9]。肿瘤转移是一个关键的阻碍电子商务的有效治疗。然而,EC转移的机制在很大程度上仍难以捉摸。因此,它是至关重要的执行实验研究探讨EC转移的分子机制暴露治疗目标改善电子商务的有效治疗。
长非编码是一组 核苷酸长度,调节基因表达的转录后的水平(10]。lncRNAs起着至关重要的作用在许多生物功能和有强烈参与肿瘤发生。魏et al。11暴露,lncRNA-u50535促进肺癌发展通过控制CCL20 / ERK通路。裴et al。12)透露,lnc-SNHG1经营的龙头、mir - 216 b - 5 - p,关键在缓和的紫杉醇敏感性卵巢癌细胞。同样,lnc-NEAT1已经观察到作为protumorigenic特性在结肠直肠癌13]。Ku et al。14)透露,lnc-LINC00240抑制非小细胞肺癌发展骗取miR-7-5p。最近,越来越多的证据表明,lnc-RNAs都涉及电子商务的形成与发展。例如,李et al。15]表明lnc-MONC抑制子宫内膜癌干细胞的恶性程度(煤钢共同体)和子宫内膜癌细胞(ECCs)下令mir - 636 / GLCE轴。同样,lncRNA HOXB-AS3在子宫内膜癌组织和细胞系调节,增强细胞增殖和抑制细胞凋亡在EC细胞(16]。因此,lncRNAs展览EC的小说潜在的治疗目标。
lncRNA NBAT1功能lncRNA,首次发现在神经母细胞瘤(17,18]。NBAT1可以通过抑制癌细胞增殖和促进神经母细胞瘤的抑制肿瘤细胞入侵,这可能被认为是神经母细胞瘤预后的预测(19]。胡锦涛et al。(20.)透露,NBAT1约束乳腺癌转移通过与EZH2相互关连。到目前为止,只有一项研究表明NEAT1的高表达在子宫内膜癌组织和细胞系和NEAT1超表达促进HEC-59细胞生长和侵袭性和迁移能力21]。然而,NBAT1对EC凋亡的影响还不清楚,及其调节EC生物学行为的分子机制仍需进一步探讨。
小分子核糖核酸(microrna)是内源性非编码rna长度约18 - 24 nt和控制基因表达在转录后的镇压(22]。lncRNAs可能作为microrna的海绵,导致调制microrna的目标(23]。例如,戴秉国等人建议,lnc-STYK1-2压抑膀胱癌发展绑定mir - 146 b - 5 - p调节ITGA2。杨et al。17]表明NBAT1通过配合miR-21-5p压抑的骨肉瘤发展和转移。然而,是否NBAT1函数作为一个龙头、规范电子商务的发展还没有探索。然而,是否针对miR-21-5p NBAT1监管的ECs仍不清楚。NBAT1能否调节EC细胞的生物学行为基于龙头、机制值得进一步研究。
本研究措施的水平NBAT1子宫内膜癌细胞和肿瘤组织。此外,监管NBAT1在子宫内膜癌的增殖和转移细胞株和潜在的分子机制探索。NBAT1抑制的机制EC细胞的生物学行为,分析了针对miR-21-5p / PTEN轴细胞实验。这项研究可能提供了一个新颖的诊断和治疗子宫内膜癌的目标。
2。方法
2.1。组织样本
EC样品和相邻的子宫内膜组织获得20 EC接受手术切除的患者在医院2016年至2020年期间, 。配对邻近正常组织当选> 4厘米远离肿瘤样本。三个病理学家评估肿瘤组织和邻近正常样本。所有的标本被收集在液氮和保存在-80̊C为进一步使用。所有患者签署了同意,研究伦理委员会批准的宁夏回族自治区人民医院(没有。:2020 - ky - 049)。
2.2。细胞培养
人类子宫内膜癌细胞系(HEC-1A和石川)获得从写明ATCC(罗克维尔市,医学博士,美国),和hESC获得Wicell(麦迪逊,WI)。HEC-1A和石川细胞生长在rpmi - 1640中补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco)和100 U /毫升penicillin-streptomycin解决方案(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 37°C公司为5%2在湿润孵化器。
2.3。细胞转染
miR-21模仿,lncRNA-NBAT1 (OE-lncRNA-NBAT1), siRNA针对lnc-NBAT1,数控从GenePharma购买(上海,中国)。细胞转染进行使用Lipofectamine™2000(表达载体;热费希尔科学,Inc .)。使用RT-qPCR转染效率验证。
2.4。细胞增殖实验
子宫内膜细胞系,HEC-1A,石川被播种在96孔板( 每)和细胞培养在37°C公司为5%2。第二天,细胞被感染了向量如下:控制、OE-lncRNA-NBAT1, OE-NC miR-21模仿,OE-lncRNA-NBAT1 + miR-21模仿48 h。接下来,CCK-8试剂(美国APExBio,休斯顿,德克萨斯州)添加到相应的井和维护4 h。吸光度(450海里)的评估是一个微型板块读者(Bio-Tek Winooski,美国)。
2.5。基底膜基质试验
细胞迁移是衡量使用24-well transwell过滤器(BD生物科学)。HEC-1A和石川细胞被添加到上院transwell室,和20%的边后卫是添加到众议院。随后,下议院细胞被固定和甲醇,然后沾0.1%结晶紫,统计使用光学显微镜(德国徕卡)。与基底膜基质细胞入侵检测进行了在37°C(康宁)30分钟和迁移试验是常数。
2.6。Dual-Luciferase记者分析
NBAT1的完整长度的结扎成pmirGLO Dual-Luciferase microrna的目标表达载体(Ribobio,中国)构建野生型(WT) pmirGLO-lncRNA。此外,pmirGLO-lncRNA突变(傻瓜)开发的结合位点miR-21-5p突变。3UTR PTEN信使RNA是放大的cDNA源自HEC1A和石川细胞总RNA,与细胞转染pmirGLO向量(Ribobio,中国),pmirGLO-PTEN-3UTR-wild类型(WT)。记者矢量突变,突变的3UTR miR-21-5p的种子序列互补,是由PCR。HEC1A细胞cotransfected与记者向量结合miR-21-5p或消极控制模拟。转染48 h后,细胞聚集,与Dual-Luciferase和荧光素酶化验报告基因分析工具(Beyotime,中国)。荧光强度f - 4500检测到的荧光分光光度计(日立、日本)。
2.7。流式细胞术
细胞转染后,HEC-1A和石川溅了磷酸盐(PBS)和聚集到离心管。离心后,细胞染色使用细胞凋亡分析工具包(Beyotime生物科技、上海、中国)。流式细胞仪进行使用流式细胞分析仪(BD生物科学、底特律、MI、美国),和细胞凋亡估计。
2.8。伤口愈合实验
细胞迁移是确定的分析。HEC-1A和石川细胞被播种在6-well微型板块,融合增长到95%。贴壁细胞被10刮μL提示生成伤口,然后用PBS被刊登三次,和无血清培养基中被替换下场。照片拍摄后立即伤害,划痕的大小进行评估。
2.9。定量逆转录聚合酶链反应
从细胞总RNA分离试剂盒试剂(美国英杰公司)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸合成使用M-MLV逆转录酶(GeneCopoeia, Inc .)。使用SYBR RT-qPCR进行绿色(Bio-Rad实验室,Inc .)实时PCR系统(热费希尔科学,Inc .)。GAPDH和U6作为NBAT1内生控制,PTEN和miR-21-5p表达式,分别。以下引物被使用:PTEN向前,5 - - - - - -TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3 ;PTEN反向,5 - - - - - -GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG-3 ;NBAT1向前,5 - - - - - -GCAGCTCAGATGAAGAAACTG-3 ,NBAT1反向,5 - - - - - -GCAATATCCAAATCCTGCCTC-3 ;miR-21-5p向前,5 - - - - - -GCACCTAGCTTATCAGACTGA-3 ,miR-21-5p反向,5 - - - - - -GTGCAGGGTCCGAGGT-3 ;和GAPDH向前,5 - - - - - -CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3 ,GAPDH反向,5 - - - - - -ATCCGTTGACTC CGACCTTCAC-3 。相对表达是通过δCT评估方法。
2.10。免疫印迹
如前所述进行免疫印迹(24用下面的抗体:anti-PTEN (138 g6,中科9559 1:1000)和anti-GAPDH(σ1:10000年,圣路易斯,密苏里州)。总蛋白提取使用里帕裂解缓冲(Beyotime生物技术研究所)补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。蛋白质测定用BCA分析工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL)根据标准协议。
2.11。统计分析
结果评估使用SPSS软件20(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)和表达为 。成对的学生的 - - - - - -测试统计分析和方差分析。 被认为是展示的意义。
3所示。结果
3.1。lncRNA NBAT1是子宫内膜癌的细胞和肿瘤组织中表达下调
评估协会lncRNA NBAT1表达式与电子商务发展,我们首先检查NBAT1的表达在子宫内膜癌细胞和肿瘤组织。NBAT1表达式在20配对EC和相邻的子宫内膜组织测量中存在。结果表明,NBAT1 EC组织中表达明显下降的参考,在成对相邻子宫内膜组织(图1(一), )。为了进一步确认NBAT1在EC的失调,我们也决定人类石川NBAT1和HEC-1A细胞的表达。我们发现更低的表达在人类石川lnc-NBAT1 HEC-1A细胞比为(图1 (b), )。这些发现暗示NBAT1是子宫内膜癌的细胞和肿瘤组织中表达下调。
(一)
(b)
3.2。超表达lnc-NBAT1抑制EC细胞的生存能力,迁移和入侵并促进细胞凋亡
随后,我们阐明NBAT1是否涉及电子商务发展的调制。首先,我们构造石川和HEC-1A细胞株坚定表达NBAT1超表达。通过RT-qPCR NBAT1的转染效率验证。正如所料,超表达结构有效地调节NBAT1表达式在石川和HEC-1A细胞(图2(一个), )。CCK-8分析暴露的超表达NBAT1显著减少石川和HEC-1A细胞(图的可行性2 (b), )。此外,伤口愈合分析验证,人类石川和HEC-1A细胞的迁移能力明显下降时NBAT1过表达(图2 (c), 和 )。Transwell化验显示,过度的NBAT1显著减毒石川和HEC-1A细胞入侵和迁移(图2 (d), )。此外,过度NBAT1增加细胞凋亡在石川和HEC-1A细胞(图2 (e), )。这些发现暗示超表达的lncRNA NBAT1阻碍细胞生存能力,迁移和入侵在EC和促进细胞凋亡。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。lncRNA NBAT1直接结合和负调节miR-21-5p在EC的表达
然后,我们的内在的分子机制进行了探讨lncRNA NBAT1调节EC转移和细胞凋亡。珍贵的研究(25)发现了假定的结合位点之间miR-21-5p NBAT1,如图3(一个)。进一步验证NBAT1之间的关系和miR-21 EC细胞,WT-NBAT1和MUT-NBAT1 dual-luciferase向量构造。展示图3 (b)相对荧光素酶活性显著降低,HEC-1A细胞cotransfected miR-21-5p模仿和荧光素酶向量包含WT-NBAT1在与细胞转染miR-NC ( )。相比之下,没有发现明显的荧光素酶活性差异之间的MUT-NBAT1-transfected细胞miR-NC和miR-21-5p模仿组。此外,相对miR-21-5p表达式在EC更高的组织比邻近的正常组织(图3 (c), ),在人类石川和HEC-1A显著增加细胞的价格相比为(图3 (d), 和 )。同时,我们发现HEC-1A miR-21-5p和NBAT1表达和石川细胞lnc-NBAT1击倒。结果表明,击倒NBAT1明显调节miR-21-5p水平( )和表达下调NBAT1 HEC-1A和石川细胞(图3 (e), 和 )。简单地说,这些发现表明NBAT1直接绑定和消极监管miR-21-5p在EC细胞系的表达。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。miR-21-5p逆转的影响lncRNA NBAT1 EC细胞系的增殖和迁移
调查是否NBAT1监管电子商务通过miR-21-5p肿瘤发生,miR-21-5p模仿或NBAT1 + miR-21-5p转染成HEC-1A和石川细胞。RT-qPCR暴露的表达减少NBAT1恢复了miR-21-5p模仿HEC-1A和石川细胞(图4(一), )。CCK-8试验暴露NBAT1限制EC细胞生存能力( ),虽然miR-21-5p模仿倒的抑制作用NBAT1过度HEC-1A和石川细胞生存能力( ,图4 (b))。流式细胞仪分析表明NBAT1超表达与EC细胞凋亡明显增加( , ),但miR-21-5p模仿明显恢复的增加引起的凋亡率NBAT1过度HEC-1A和石川细胞( 和 ,图4 (c))。同时,我们发现一个明显的减少迁徙能力NBAT1石川和HEC1A细胞诱导的超表达恢复miR-21-5p模仿( 和 ,图4 (d))。Transwell化验显示,减少入侵和迁移引起NBAT1过度被miR-21-5p模仿恢复,( 和 ,图4 (e))。总的来说,上述研究结果暗示NBAT1监管的扩散,EC细胞系的入侵,和迁移骗取miR-21-5p。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.5。NBTA1提升PTEN表达通过骗取miR-21 EC
之前的研究已经暴露,PTEN的潜在目标miR-21-5p [26]。本研究证明miR-21-5p和PTEN(图之间的结合位点5(一个))。Dual-luciferase记者试验表明,miR-21-5p模仿明显压抑WT-PTEN的荧光素酶活性( ),尽管没有差异MUT-PTEN(图5 (b)),这表明PTEN可能海绵miR-21-5p EC细胞。RT-qPCR进行评估PTEN表达在子宫内膜癌组织和邻近的子宫内膜组织。明显减少PTEN表达在子宫内膜癌组织(图确定5 (c), )。此外,免疫印迹结果表现出的蛋白表达PTEN在HEC-1A低得多,比hESC石川细胞(图5 (d))。此外,NBAT1增强的PTEN蛋白表达HEC-1A和石川细胞系(数字5 (e)和5 (f))。相反,miR-21-5p模仿明显抑制的PTEN蛋白表达HEC-1A和石川细胞(数字5 (e)和5 (f)),这表明PTEN miR-21-5p的下游是一个至关重要的目标。因此,这些发现暗示NBTA1高架PTEN表达通过骗取miR-21 EC。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
子宫内膜癌(EC)是最常见的妇科恶性肿瘤之一,在全球范围内(27]。EC的发病率提高了全球增长的结果老年人和上升的肥胖率28]。电子商务是基于组织学特性分为两种类型,estrogen-dependent (I型)子宫内膜癌,和estrogen-independent II型nonestrogen-dependent复发的一种倾向(29日]。EC的预后受着多种因素的影响,包括肿瘤分期、组织学类型、分化程度,和程度的子宫肌层的入侵30.]。尽管EC经常被诊断出患有初期由于异常阴道出血,转移的预后因素和存活率EC仍然是当前研究的重点。因此,潜在的分子机制,促使电子商务需要接触理解电子商务的潜在机制转移。
最近,许多研究提出了lncRNAs函数调制的一个关键的角色在转录和转录后的基因表达水平(31日]。越来越多的证据支持,lncRNAs涉及各种癌症,包括电子商务发展(32]。例如,lnc-PICSAR影响REV3L表达式和改善皮肤鳞状细胞癌(DDP耐药性24]。此外,lnc-HSD17B11-1:1发现提高MACC1的表达,促进CRC进展(33]。证据支持的肿瘤抑制作用lncRNA NBTA1在各种人类的肿瘤,包括肾脏癌和胃癌。高和陈34)认为NBAT-1的低表达可能促进GC发展通过下调PTEN的表达。雪et al。35]暗示NBAT-1可以抑制RCC细胞增殖和入侵。进一步明确的表达特点lncRNA NBTA1 EC, 20临床EC和正常组织也收集样品,这是显示的NBTA1 EC组织明显低于正常组织。EC和lncRNA NBTA1水平在人类细胞系(HEC-1A和石川)也显著低于正常hESC。在这项研究中,HEC-1A和石川细胞模型overexpressing NBTA1构造。结果表明,过度的NBTA1显著抑制能力的迁移和入侵和提升HEC-1A和石川细胞的凋亡。这些结果与先前的结果是一致的,lncRNA NBTA1可能作为肿瘤抑制的EC和有价值的预后指标。
一般来说,lncRNAs显示函数取决于电抗器限制microrna并lncRNAs绑定microrna的(36]。大量研究证实在sponging-specific lncRNAs microrna的至关重要的作用,一种小的,非编码rna组成的核苷酸,年龄在18岁至25岁之间会抑制基因表达在转录后的级别(37]。此外,越来越多的发现暗示电抗器,在子宫内膜癌病理变化的影响。周et al。38)表明,长非编码RNA段H19促进了子宫内膜癌的肿瘤发生通过调节miR-20b-5p /妳/ HIF-1α轴。锅等。39)建议LINC01016加速子宫内膜癌发展中介mir - 302 - a - 3 - p / SATB1通路。基于以上,有必要进行研究,电抗器的理解由lncRNAs和microrna与EC转移。因此,推测lncRNA NBTA1可能扮演的角色,电抗器和参与电子商务的发展。
在这项研究中,生物信息学分析预测miR-21-5p NBTA1和验证的潜在目标记者测定荧光素酶的活动。此前报道,miR-21-5p抑制非小细胞肺癌进展,结肠腺癌和甲状腺乳头状癌(26,40,41]。在这项研究中,通过细胞实验证实,NBTA1是针对绑定到miR-21-5p和超表达miR-21-5p不仅促进了电子商务的扩散和入侵和抑制细胞凋亡也明显阻塞NBTA1在EC细胞的影响。这些观察表明,NBAT1能发挥抑制肿瘤作用EC细胞通过连接miR-21-5p调节目标基因负。
此外,microrna的龙头、网络的目标是至关重要的部分(42]。PTEN是一个著名的PI3K和二级信使是一个肿瘤抑制基因与抑制肿瘤细胞的生长和分化43,44]。最近的证据表明,PTEN作为肿瘤抑制在EC (45,46]。此外,新兴证据表明PTEN是目标mRNA miR-21-5p miR-21-5p加速癌症发展的抑制PTEN [47,48]。确定miR-21-5p / PTEN针对关系存在于ECs和监管轴是否NBAT1的目标,进一步的实验。我们发现miR-21-5p绑定到3 - - - - - -UTR PTEN的mRNA。此外,过度NBAT1 EC细胞中PTEN蛋白的表达,而过度miR-21-5p抑制PTEN蛋白水平和超表达miR-21-5p阻塞NBAT1 PTEN的推广。这表明的机制NBAT1提升PTEN与针对miR-21-5p是分不开的。
5。结论
总之,本研究表明,lncRNA NBAT1高架PTEN表达通过骗取miR-21-5p促进EC扩散和转移。NBAT1功能miR-21-5p海绵提高PTEN水平,从而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡在EC细胞系。我们的研究表明,抑制NBAT1可能作为电子商务的新分子基因治疗的目标。
数据可用性
仿真实验数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
本研究经伦理委员会批准的宁夏回族自治区人民医院(2020 - ky - 049号)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Chunhua田,据说马,静苏进行实验;据说马、Chunhua田和赵马作出了显著贡献分析和手稿准备;Chunhua田,据说马,杨武进行数据分析和写的手稿;Chunhua田,杨武,静苏帮助执行分析建设性的讨论。作者声明,所有的数据都是内部生成的,没有造纸厂使用。Chunhua田和苏京同样这个工作和co-first作者。
确认
本研究支持宁夏省自然科学基金(2020号aac03336)。