文摘

背景。变应性接触性皮炎(ACD)是一种慢性皮肤炎症疾病的免疫学起源不利影响病人的生活质量,强调需要开发安全有效的药物来治疗影响的个人。据说非瑟酮是一种中药制剂,具有抗肿瘤,抗氧化,抗菌,anticoagulatory,抗疟活性。在当前的报告中,非瑟酮的免疫调节活动被评估它对平衡的影响评价调节性T (Treg)和Th17细胞在ACD模型。方法。BALB / c小鼠( )随机分为控制、ACD模型、CTX积极控制(20毫克/公斤),和非瑟酮治疗组(三个剂量水平:2、4或8毫克/公斤)。ACD感应是通过敏化小鼠剃腹侧腹部通过应用5% DNFB (50μ1和2 L)天,紧随其后的是重新在右耳DNFB 5% (20μL) 5天。从第一天开始,免疫小鼠腹腔注射相应的非瑟酮剂量(生理盐水)每天一次7天。7天,耳肿胀、转录因子表达式,Th17 / Treg细胞数量和细胞因子生产评估体内。结果。非瑟酮治疗显著抑制耳肿胀和炎症细胞浸润有关,除了减少Th17细胞因子的生产(IL-17, TNF -α和il - 6)和Th17家族转录因子的表达RORγt同时加强Treg-specific生产(TGF -细胞因子β和il - 10)和Treg家族转录因子Foxp3的表达,从而恢复Th17细胞/ Treg在ACD老鼠。结论。这些数据表明,非瑟酮展品免疫调节活动,可以改变/ Treg Th17细胞平衡,突出其潜在价值作为ACD的治疗药物。

1。介绍

变应性接触性皮炎(ACD)是一种T细胞介导炎性皮肤病,激活的T细胞反应特定抗原和释放炎性细胞因子,从而促进局部炎症细胞浸润,组织变性、坏死(1- - - - - -3]。许多报道已经证明了ACD发病率之间的联系和Th1、Th2 CD4之间的不平衡+T细胞的子集。最近的研究进一步表明,Th17和调节性T (Treg)细胞还可以调节免疫内稳态4- - - - - -6]。

ACD患者经常出现瘙痒等症状,水肿、红斑,合并水肿性丘疹(7,8]。世界卫生组织估计,全球15%的人口受到澳洲牧牛犬。局部治疗ACD包括非甾体类抗炎药、H1受体拮抗剂和糖皮质激素。这些药物表现出广泛的副作用在高剂量使用时,然而[9- - - - - -11),突显出小说ACD疗法的发展需要更少的副作用。

草药一直用于治疗疾病。鉴于中药资源的广泛分布,他们廉价的自然,和低水平的毒性与草药medicine-based疗法,它们蕴含着巨大的希望有利的治疗疾病的手段。非瑟酮(3、7、3、4-tetrahydroxyflavone)是类黄酮礼物在一系列的水果和蔬菜包括苹果、洋葱、葡萄、草莓、和黄瓜在剂量的2 - 160μg / g (12,13]。非瑟酮曾被证明能抑制单胺氧化酶活性与去甲肾上腺素和5 -羟色胺系统,从而发挥抗抑郁活性(14- - - - - -16]。也被报道以刺激细胞信号,从而提高长期记忆(17]。此外,非瑟酮可以改变信号传导,抑制肿瘤细胞增殖,迁移和入侵,并促进凋亡的肿瘤细胞死亡(18- - - - - -22]。它还展品王亚南和修复功效的上下文中hepatitis-related肝损伤(23,24),同时也减轻黄曲霉素细胞毒性(25]。非瑟酮的化学结构表示。

我们之前已经发现非瑟酮可以抑制Th1 / Th2细胞体外和体内平衡除了抑制IL-17生产,表明这种化合物有可能调节Th17细胞功能。更全面地探索非瑟酮immunopharmacological活动,我们在此评估其能力调节Th17 / Treg平衡,从而减弱疾病严重性DNFB-induced ACD的小鼠模型。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

非瑟酮(> 98%的纯产品目录号:528483,图1)是获得Sigma-Aldrich稀释培养基中含0.1% DMSO,无菌过滤,储存在4°C之前利用率。一个等价的DMSO浓度用于所有控制动物。环磷酰胺(CTX)和2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB)采购从σ(美国密苏里州)。从HyClone rpmi - 1640(洛根,UT)。此外,BioLegend(美国CA)提供的il - 6, IL-17, TGF -β肿瘤坏死因子-α及il - 10 ELISA板。PE-anti-IL-17A、FITC-anti-CD4 APC-anti-CD25, PE-anti-Foxp3来自BD Pharmingen。


图1
非瑟酮的化学结构。
2.2。动物

BALB / c小鼠(16 g, 6 - 8周大,男性50%,女性50%)收购了吉林大学实验动物中心,安置在microisolator笼子里有免费的水和食物可访问性。动物福利和研究伦理委员会批准黑龙江佰益农业大学动物实验。

2.3。ACD模型建立

诱导ACD、腹侧腹部的老鼠剃和敏化5% DNFB (50μL; )天第一和第二。五天后,老鼠然后挑战通过绘画外和内表面的右耳10μL 5% DNFB ( ),而左耳涂上的等效体积控制丙酮和橄榄油(4:1)混合物。耳肿胀在48 h后第二个挑战当时评估重耳朵补丁从耳朵准备与一个8毫米穿孔和比较这些相对权重。

2.4。药物治疗

BALB / c小鼠( )被随机分为六组(10 /组)包括一个对照组,ACD模型组,积极控制CTX组(20毫克/公斤),和三个非瑟酮组(2、4、8毫克/公斤)。处理腹腔内注射到老鼠每天一次7天,对照组是管理一个等价的0.1% DMSO溶液的体积。

2.5。耳肿胀分析

在24 h post-DNFB刺激,两只耳朵穿孔,移除组织重的量化这些动物耳肿胀的读出ACD的大小反应如下:24 h后,老鼠终于与DNFB刺激过敏,老鼠的左和右耳朵穿孔,重计算小鼠耳肿胀,这反映了ACD的反应强度。公式: ,水肿率对应耳肿胀, 耳朵对应右耳重量(毫克),和 耳朵对应于左耳重量(毫克)。

2.6。组织学观察

在24 h post-DNFB刺激,左和右心耳收集用干净的剪刀从每组小鼠和固定24小时10%福尔马林。这些组织被脱水,石蜡插入,切成段。deparaffinization后,执行hematoxylin-eosin染色和组织通过显微镜成像来确定适当的代表区域进行分析。

2.7。流式细胞术

在研究期间的7天, 脾细胞与PBS冲洗,之后血红细胞细胞溶解用人ACK裂解缓冲和左侧淋巴细胞悬浮在rpmi - 1640包括10%的边后卫。Th17 Treg细胞进行了分析通过孵化这些细胞4 h与PE-anti-IL-17A ConA然后染色,FITC-anti-CD4, APC-anti-CD25, PE-anti-Foxp3后续流cytometry-based量化紧随其后。

2.8。分析Foxp3和RORγt mRNA水平表达

试剂盒采用从脾细胞总RNA的提取,后一个RevertAid合成第一链cDNA工具包和随机引物被用来合成互补。然后,SYBR®预混料交货Taq™II是用来放大Foxp3, RORγt,β肌动蛋白在25μL反应体积β肌动蛋白作为标准化控制。引物序列用于这个研究编译表1。

表1
引物用于PCR。
2.9。elisa

一夜之间,捕获抗体被孵化96 -孔板在4°C,这盘子洗后和100年μL适当的血液样本被添加到适当的水井,由2 h成功孵化在37°C。盘子被清洗4次,在100年的成功μL(二次抗体(1:200)在37°C 1 h。盘子然后再冲洗,通过实现100年孵化μL(辣根过氧化物酶(合;1:1000)每30分钟在37°C。使用洗盘子随后被冲洗5次缓冲区,和100年μL三甲衬底的每好接着说。15分钟后孵化25°C受光照时,反应是通过添加2 M H终止2所以4。盘子被允许站5分钟,之后标仪是用来评估OD值在450海里。一个标准曲线被用来衡量IL-17, il - 10、il - 6、TNF -α,TGF -β在每个样例内容。

2.10。统计分析

数据是 通过学生的(SD)和比较 - - - - - -采用SPSS 13.0进行测试。 是意义阈值( )。

3所示。结果

3.1。非瑟酮抑制在小鼠耳肿胀ACD模型

相对于对照组,在ACD模型小鼠耳肿胀显著增强( ;图2(一个)),而非瑟酮的腹腔内注射后,分析显示非瑟酮低剂量显著抑制耳肿胀在这些动物( ),中、高非瑟酮剂量有肿胀的抑制效应更加明显剂量依赖性的方式( )。低剂量的非瑟酮治疗比治疗更有效的临床CTX免疫抑制药物。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
非瑟酮治疗减少过敏性耳朵厚度。(一)耳朵厚度测量和(b)在小鼠ACD模型组织病理学分析。体重的增加8毫米耳朵穿孔组织部分被用来分析ACD反应严重程度通过比较左右耳朵在48 h后第二次挑战。组织学改变在这些老鼠的右耳朵评估DNFB治疗后48 h (200 x)。数据是 ( )。 # # 与对照组。 和 和ACD组。
3.2。非瑟酮规范化组织病理学结果在ACD模型小鼠

更全面地评估非瑟酮治疗的影响,从治疗小鼠耳组织部分)染色。相对于对照组,那些在ACD模型组证明增加炎症细胞浸润和肿胀DNFB挑战后,与成功的ACD模型建立(图一致2 (b))。然而,非瑟酮治疗显著降低炎性浸润相对于ACD和CTX组,进一步证实的能力非瑟酮抑制ACD-related耳肿胀。

3.3。非瑟酮调节Th17 / Treg平衡在ACD模型小鼠

影响非瑟酮治疗Th17和Treg细胞群在ACD模型小鼠是下一个评估(表2)。相对于对照组,ACD模型小鼠表现出显著的Th17细胞和大量减少Treg细胞( ),而非瑟酮和CTX治疗逆转这些变化( 或 )。获得的结果定义非瑟酮能够调节/ Treg Th17细胞平衡。

表2
FIS的影响对Th17 / Treg ACD的老鼠。
3.4。非瑟酮调节RORγt和Foxp3 mRNA表达在ACD模型老鼠

接下来,rt - pcr是用来评价相对RORγt和脾细胞中Foxp3的表达。相对于对照组,ACD模型小鼠Th17-specific转录因子的增加表达ROR展出γt和减少Treg-specific转录因子的表达Foxp3在mRNA水平( ,图3)。非瑟酮或CTX治疗后,RORγt mRNA水平大幅减少,而Foxp3水平增强对ACD模型组( )。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
非瑟酮改变RORγt和Foxp3 mRNA的表达在活的有机体内。(一)代表为rt - pcr产品电泳分析结果。相对ROR (b)的比率γt或者通过密度测量通路,Foxp3表达量化β肌动蛋白被用于规范化。数据是 ( )。 # # 与对照组。 和 和ACD组。
3.5。非瑟酮在ACD模型小鼠细胞因子调节生产

接下来,血清IL-17, il - 10、il - 6、TNF -α,TGF -β水平在这些ACD模型小鼠评估通过ELISA(图4)。相对于控制,ACD模型小鼠表现出增强TNF -α、il - 6和IL-17水平( ),虽然TGF -β在这些ACD和il - 10水平显著降低模型小鼠( 或 )。相反,非瑟酮和CTX治疗降低TNF -α、il - 6和IL-17水平( 或 )同时增加了TGF -β和il - 10水平( 或 )。获得的结果说明,非瑟酮可以抑制炎性细胞因子的生产而加强抗炎细胞因子的分泌。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图4
非瑟酮改变细胞因子的生产。elisa是用来测量血清水平的(a) IL-17, (b) il - 6, (c) TNF -α,(d) TGF -β,(e) il - 10在48 h后第二个挑战。数据是 ( )。 # # 与对照组。 和 和ACD组。

4所示。讨论

过敏性接触性皮炎是一种相对常见的过敏性皮肤病,可以引发的敏化过敏原可以挑战,以避免在日常生活中。ACD治疗目前主要依靠H1受体拮抗剂和糖皮质激素的使用,但这些表现出相对有限的疗效和高的副作用(26- - - - - -28),强调需要新颖的设计,安全的治疗这种疾病。非瑟酮黄酮类化合物存在在各种各样的植物,水果和蔬菜(29日,30.]。我们以前所示非瑟酮抑制Th1 / Th2细胞活动,我们在此寻求扩大这些分析,评估其能力调节Th17 / Treg免疫内稳态在ACD的小鼠模型31日,32]。

重复DNFB应用程序成功地诱导模型ACD的耳肿胀实验小鼠表现为明显的48 h post-DNFB应用程序。非瑟酮治疗足以缓解这样的肿胀,这些研究结果进一步证实了通过组织病理学分析显示非瑟酮能减少DNFB-induced表皮炎症和炎性细胞浸润。

CD4+Th17和Treg细胞表现出相反的表现的自身免疫性炎症和免疫内稳态的维护33,34]。之前的研究表明,过度Th17细胞激活和受损Treg活动与各种自身免疫性疾病的扩张。因此,调制这Th17 / Treg平衡可能有效地治疗ACD (35,36]。我们因此探索能力的非瑟酮调节Th17 / Treg平衡我们的ACD模型老鼠。虽然ACD模型动物展出Th17细胞的增加和减少Treg细胞水平相对于控制,非瑟酮和CTX治疗Th17细胞频率和增强Treg细胞频率下降。这些数据表明,Th17细胞/ Treg失衡是一个标志的ACD服从fisetin-mediated免疫调节的监管。

RORγt和Foxp3 lineage-specific调控转录因子控制的功能和分化Treg和Th17细胞,分别为(37,38]。来评估非瑟酮的能力来改变这些转录因子的表达,我们检查Foxp3和RORγt表达式在ACD模型小鼠,揭示这种治疗减少了ROR下降γt和增强表达Foxp3的表达。因此,这些数据支持的存在Th17 / Treg失衡在ACD模型小鼠由非瑟酮矫正治疗。

分化的细胞因子函数作为主要监管机构Th17 Treg子集,il - 6和TGF -β调制在CD4 lineage-specific转录因子的表达+细胞命运的决心的上下文(39,40]。低TGF -β浓度il - 6的存在能够驱动Th17细胞的分化及其顺向IL-17A和TNF分泌α,进而促进局部炎症,而高TGF -β浓度可以促进亚群的分化(41,42]。il - 10是一种抗炎细胞因子,阻碍了炎性细胞激活和促炎细胞因子的分泌43,44]。在这里,我们发现非瑟酮治疗明显减少IL-17A, il - 6和TNF -α治疗相对于这些细胞因子的水平在ACD模型小鼠,而Treg-related细胞因子il - 10和TGF -β参加高水平fisetin-treated老鼠。这表明,非瑟酮可以抑制ACD-related疾病病理学通过增强抗炎il - 10和TGF -β生产而下调炎症介质水平包括IL-17A, il - 6和TNF -α。

短暂,我们这里采用DNFB-induced鼠ACD模型系统证明非瑟酮治疗足以抑制DNFB后耳肿胀是因为它能够抑制炎症细胞的招募耳朵发炎组织部分。非瑟酮也可以恢复Th17 / Treg平衡这些老鼠通过抑制IL-17分泌的il - 6、TNF -α和ROR的表达γt在mRNA水平而提高TGF -β和il - 10分泌和促进mRNA-level upregulation Foxp3。因此,非瑟酮可能代表一个可行的候选药物ACD治疗由于其调节Th17 / Treg平衡的能力。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称他们没有竞争的经济利益或个人关系可能出现影响调查报告摘要。

作者的贡献

Bocui歌曲和申雪执行研究概念和设计。分钟刘和钱学森陈进行数据采集和分析。韩宇奇李、黄Baolei执行数据的解释。Mengmeng江和双张起草了手稿。瑞王赵和竞争修订后的手稿。通成好金和Chunyu执行提交手稿的最终批准。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(31702289和31702289),黑龙江的博士后科研启动基金(LBH-Q21158),黑龙江八一农业大学对学习和引进人才科研启动计划(XYB2015-09),青年创新人才的培训项目黑龙江教育委员会(unpysct - 2017),黑龙江八一农业大学支持项目“圣宗”(TDJH201905),和大学生创新与创业培训项目在黑龙江省:棉子酚的抑制作用在Eotaxin IgE介导的小鼠I型过敏反应(201910223026)。