文摘

目标。肺癌是宽,常见的肿瘤。本研究旨在探讨YFXJ公式的影响在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系。方法。YFXJ公式(主要由黄芪,白术macrocephala、基数Saposhnikoviae,基数Glehniae,薏苡仁,草桧柏,Hedyotis diffusa, Pericarpium Citri Reticulatae,石棺martensii,扁桃体脓肿寻常的,文蛤文蛤,和牡蛎)与75%乙醇提取。我们进行MTT、流式细胞仪、TUNEL和质谱研究YFXJ公式对A549 / DDP细胞的影响。结果。结果表明,YFXJ能抑制A549 / DDP细胞的生长,并且可以逆转A549 / DDP细胞对顺铂的敏感性。YFXJ抑制凋亡的表达、MRP1和单体在A549 / DDP细胞基因。结论。YFXJ公式可以逆转A549 / DDP细胞的耐药性,这可能是通过激活自噬。

1。介绍

肺癌是宽,常见的肿瘤,导致人类死亡。大约有150万人死于这种疾病。非小细胞肺癌(NSCLC)占近85%的每年新诊断肺癌,如腺癌、鳞状细胞癌和大细胞肺癌(1]。II期非小细胞肺癌可以通过手术治愈。然而,85% - -90%的非小细胞肺癌患者手术已经失去了最好的机会(2]。目前,传统放疗和化疗是治疗晚期非小细胞肺癌,尤其是新出现的第二代(培美曲塞二钠)和第三代化疗药物(多西他赛、紫杉醇、vinorelbine等)大大提高化疗的疗效。此外,免疫疗法的出现,介入治疗等手段进一步提高肿瘤治疗的效率和延长癌症的发病率。然而,生物免疫疗法并不是广泛应用由于价格和效果的局限性。这使得化疗成为抗肿瘤治疗的主要力量。改变化疗耐药性可以受益患者更大范围和更广泛,这对延长患者的生存是非常重要的。因此,如何延迟、反向或部分逆转化疗抵抗尤为重要,非常必要和现实意义。

在1980年代和1970年代,顺铂、卡铂、异环磷酰胺,长春花碱,长春西汀,丝裂霉素,盐酸表柔比星、依托泊苷被认为是作为非小细胞肺癌化疗的有效药物。用于单药化疗时,至少有效率为15%。当结合顺铂,有效率为30%,1年生存率为10% ~ 12%。可以看出,单一化疗和联合化疗较低效率和短期存活率。的经济成本的组合两个第三代化疗药物或第三代药物和靶向治疗药物的组合对大多数人来说通常是十分困难的。由于历史习惯和其他原因,含铂化疗被广泛使用。然而,有一个重要的瓶颈在化疗药物的治疗,即获得性耐药,特别是改变化疗后的肿瘤细胞的耐药性,这限制了化疗方案的疗效和影响进一步改善患者的临床疗效。

YFXJ公式(主要由黄芪,白术macrocephala、基数Saposhnikoviae,基数Glehniae,薏苡仁,草桧柏,Hedyotis diffusa, Pericarpium Citri Reticulatae,石棺martensii,扁桃体脓肿寻常的,文蛤文蛤,和牡蛎)是用于治疗癌症。以前的实验已经表明YFXJ公式可以延长无病进展时间和推迟耐药性。因此,体外实验来进一步阐明YFXJ的降级和抗肿瘤效应公式对耐药细胞自然成为我们的进一步的研究方向。

在这里,我们准备YFXJ公式的酒精提取和分析肝癌,流式细胞仪,TUNEL和质谱研究YFXJ公式对非小细胞肺癌细胞株的影响。我们的数据表明,酒精提取YFXJ汤可以逆转A549 / DDP细胞的耐药性。

2。材料和方法

2.1。制备酒精提取YFXJ公式

根据YFXJ公式(黄芪30克,Fangfeng 10克,白术macrocephala 30 g,蝎子3 g,南沙参15克,shijianchuan 30 g),称量一定量的药材煎煮,加8倍量75%乙醇回流,提取、煎两次,一次1小时。汤结合,离心,干燥获得ethanolic提取。在实验之前,适量的乙醇提取物的干粉称重和溶解在涡流中,超声波水浴和其他方法。过滤器是用于过滤和准备解决方案所需的浓度。存储的解决方案是在4°C到使用。

2.2。细胞系和分组

多药耐药性肺癌A549细胞株和人类细胞系A549 /民进党从生物化学和细胞生物学研究所的购买(上海生命科学院)。A549细胞的敏感是复苏和培养。对数生长期细胞分为实验组(A549 / DDP +传统媒介+ YFXJ汤醇提取物),对照组1 (A549 / DDP +传统介质)和对照组2(敏感细胞株A549 +传统的媒介)。所有三组添加与顺铂药物干预。

2.3。MTT法

MTT法是用于确定YFXJ酒精提取的影响公式对A549 / DDP细胞在24日,48岁,72,和96 h,敏感细胞株A549被用作控制。YFXJ公式的影响在A549 / DDP细胞线被IC50值评估。IC50被拟合计算抑制曲线GraphPad Prism 5.0软件: (YFXJ治疗组)。

2.4。流式细胞术和TUNEL

A549 / DDP细胞培养在饥饿。不同浓度的酒精提取物处理后YFXJ公式,孵化器的细胞培养37°C, 5%的公司2、和饱和湿度的12、24、36岁和48 h。细胞周期和细胞凋亡测定使用流式细胞仪和TUNEL,分别。

2.5。质谱(icp)

酒精提取YFXJ公式是用来治疗A549 / DDP细胞36 h,然后进一步处理10 g / ml DDP 4 h。使离心10分钟后在14000转/分钟,浮在表面的真空干燥24 h,和70年μL PBS的解决方案是添加、稀释和混合洗多次,完全转移到40毫升烧杯。同时,高档纯硝酸(2毫升)被添加到电热板消化最后增加高档纯高氯酸(1毫升)在高温消化样品。冷却后,样品被放入10毫升容量瓶。样品测量前用滤纸过滤,然后积累DDP浓度在细胞检测到。

2.6。统计分析

GraphPad Prism 5.0软件,SPSS18.0统计软件, - - - - - -测试和 测试被用于定量处理和分析。具体的统计方法时可能会使用一些实验步骤,这是密切相关的计算机软件使用。

3所示。结果

3.1。麻省理工是用来检测YFXJ A549 / DDP细胞增殖的影响

MTT试验被用来研究YFXJ A549 / DDP细胞增殖的影响。48小时后,YFXJ 2和5的抑制率μmol / L A549 / DDP细胞增殖分别为4.97%和14.71%,分别为(图1)。因此,当YFXJ浓度是2、5μmol / L,它可以被认为是无毒浓度( )和低毒性浓度( ),分别。通过这两个浓度,可以认为A549 / DDP的增长率并没有改变明显比对照组。

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图1
YFXJ对A549 / DDP细胞的抑制率YFXJ导致增长抑制A549 / DDP细胞。 ; 。
3.2。YFXJ对A549 /民进党的影响细胞对顺铂敏感性

A549 /民进党的影响细胞A549 /民进党细胞对顺铂的敏感性时观察和检测到的浓度YFXJ是2μmol / L和5μ分别mol / L。0、2、5、10、20、50和100μmol / L顺铂被添加到相应的漏洞。四组如下:A549 +顺铂对照组,A549 /民进党+顺铂组,A549 /民进党+顺铂+ 2μmol / L YFXJ集团和A549 /民进党+顺铂+ 5μmol / L YFXJ组。然后,CCK-8试验进行了计算药物对细胞的抑制率。横坐标是顺铂的浓度,纵坐标是抑制率。

顺铂的抑制率在A549 /民进党细胞增殖的影响下2或5μmol / L YFXJ高与A549 /民进党+顺铂组相比,表明YFXJ可以增加A549 /民进党细胞对顺铂的敏感性(图2)。根据IC50值,在A549 / DDP的IC50民进党细胞60.24;的IC50 DDP + YFXJ 2μ30.71 mol / L A549 /民进党细胞;的IC50 DDP + YFXJ 5μmol / L细胞A549 /民进党是16.12。因此,逆转2和5的倍数μmol / L YFXJ分别为1.96和3.74倍,分别。

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(b)
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图2
YFXJ逆转A549 / DDP细胞对顺铂的敏感性。YFXJ逆转A549 / DDP细胞对顺铂的敏感性,与对照组相比, 。
3.3。YFXJ结合顺铂对A549 /民进党细胞的凋亡

结果被显示在图3和流式细胞术检测细胞凋亡的影响。A549 /民进党细胞的凋亡率在顺铂组和2和5μmol / L YFXJ结合顺铂组与对照组相比更高( )。同时,YFXJ结合顺铂组比单独与顺铂组( ),和5μmol / L YFXJ结合顺铂组是最好的( )。建议YFXJ结合顺铂可以诱导A549 / DDP细胞凋亡浓度的方式。

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图3
YFXJ结合顺铂对A549 / DDP细胞的凋亡。YFXJ A549 / DDP细胞对顺铂的细胞凋亡增加,与对照组相比, , 。
3.4。MRP1 YFXJ对凋亡的影响,单体基因mRNA表达细胞A549 /民进党

接下来,我们检查的影响YFXJ mRNA表达凋亡,MRP1和单体基因在细胞A549 /民进党。凋亡的mRNA水平、MRP1和单体基因A549 /民进党YFXJ治疗后细胞减少。2和5的凋亡表达μmol / L组为81.1%,对照组的68.0%,MRP1 mRNA表达是对照组的82.1%和73.9%,和含碘mRNA表达是对照组的70.3%和63.3%,分别。这表明YFXJ可以调节耐药相关基因的转录(图4)。世行证实凋亡的蛋白质含量,MRP1和单体基因在A549 /民进党YFXJ治疗后细胞减少(图5)。凋亡、MRP1和单体蛋白表达下调了YFXJ剂量依赖性的方式。


图4
YFXJ对mRNA表达凋亡,MRP1和单体基因在A549 / DDP细胞。YFXJ抑制凋亡的mRNA表达、MRP1和单体基因在A549 / DDP细胞。 ; 。
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图5
YFXJ对凋亡的表达的影响,MRP1和含蛋白质在A549 / DDP细胞。MRP1 YFXJ抑制凋亡的蛋白表达,和单体基因在A549 / DDP细胞。 ; 。
3.5。不同浓度的影响YFXJ Autophagy-Related基因的mRNA表达A549 / DDP细胞

Akt的信使rna, p53、PTEN mTOR ATG5, LC3基因,与细胞自噬在A549 /民进党显示浓度依赖不同YFXJ治疗后改变。然而,只有50岁μmol / L浓度,YFXJ可以显著增加一种蛋白激酶的表达( ,图6)。在一起,YFXJ可能逆转A549 / DDP耐药性通过激活自噬。


图6
不同浓度的影响YFXJ autophagy-related基因的mRNA表达在A549 / DDP细胞。 ; 。
3.6。YFXJ对Autophagy-Related分子蛋白表达在肺癌细胞A549 /民进党

世行的结果表明,一种蛋白激酶,p53, PTEN mTOR ATG5, LC3相关,明显抑制了细胞自噬在A549 /民进党YFXJ剂量依赖性的方式(图7)。这些结果表明,YFXJ可以激活自噬和促进A549 /民进党细胞凋亡。结合定量PCR的结果,建议YFXJ可能不会直接抑制信使rna的转录水平但可能会影响蛋白质的翻译或退化。


图7
不同浓度的影响的YFXJ autophagy-related蛋白的表达在A549 / DDP细胞。

4所示。讨论

以前的实验已经表明YFXJ公式可以延长无病进展时间和推迟耐药性。因此,进一步在体外实验来阐明YFXJ的降级和抗肿瘤效应公式对耐药细胞自然成为我们的进一步的研究方向。

靶向药物的存活时间进一步延长chemotherapy-resistant病人在某种程度上。随着新的化疗药物的出现,许多临床研究表明,3- - - - - -9)对晚期NSCLC患者预后良好因素,新的化疗药物的结合比单药化疗。此外,荟萃分析表明,这两个药物的使用比单一药物疗法在改善患者的生存时间,而这三个药物不良反应增加,没有与这两个药物相比,存活时间显著改善方案(10]。与标准化疗相比,发展自由时间延长2 - 4个月用更少的副作用,例如,表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼、埃罗替尼,icotinib, afatinib、筛选抑制剂如clotriminib c-Met抑制剂tivantinib。然而,由于成本高,半年的靶向药物治疗成本超过100000 - 150000。此外,耐药性是不可避免的,有些药物在实验阶段,导致有限的普遍性的靶向药物和瓶颈改善功效。

自噬是细胞新陈代谢的过程和一些细胞器更新。那就是通过吞噬细胞质蛋白质或细胞器笼罩在囊泡,然后与溶酶体融合,降低它们的内容。然而,自噬的作用是正面还是负面的尚未完全阐明,尤其在癌症研究,值得关注。在这项研究中,YFXJ激活自噬的耐药性逆转A549 / DDP细胞。

综上所述,我们的结果提交理论依据YFXJ配方的影响在非小细胞肺癌的治疗和提供证据支持进一步推动YFXJ公式的使用。此外,牡蛎和娼妓是常见的原材料在舟山地区海洋中药。本研究可以促进和改善海洋中药和市场经济的价值。

数据可用性

数据和材料可以在请求从相应的作者。

的利益冲突

作者证实不存在利益冲突。

作者的贡献

Zhongliang刘写的手稿。Zhongliang Liu yap丁、沂州田和Da进行实验,收集数据,收集和分析数据。Zhongliang刘和yap丁设计的研究中,和所有作者提交批准。

确认

这项研究由舟山科技计划项目(2015 c31036)。