文摘

我们专注于研究的影响的关键miRNA-mRNA轴膀胱移行细胞癌(BUC)。首先,microrna在BUC mrna差异表达进行了分析。TCGA临床信息数据库是用于生存分析,和microrna的监管机构- 93 - 5 - p是预测。microrna - 93 - 5 - p和KLF9 mRNA表达检测中存在。蛋白质含量检测和定位测量,分别通过免疫印迹和dual-luciferase方法。增殖、侵袭性和迁移能力测试通过CCK-8, Transwell,伤口愈合的方法。细胞凋亡在每组通过流式细胞仪检测。发现,microrna - 93 - 5 - p水平明显高BUC细胞而KLF9表达式是非常低的。microrna - 93 - 5 - p过度推广BUC细胞的能力。此外,microrna的p - 93 - 5 -抑制KLF9表达式。 Furthermore, KLF9 overexpression dramatically attenuated such promotion on cancer cell abilities. On the whole, miRNA-93-5p/KLF9 axis facilitated BUC progression, offering a new potential target for BUC patients.

1。介绍

膀胱癌(BC),普遍在泌尿生殖系统肿瘤,是由膀胱粘膜上皮细胞过度生长,5年生存率高发病率和低(1]。大约34%的患者死于公元前转移(2]。在美国估计有61700名病人被诊断为公元前2019年和12870年死于疾病(3]。膀胱移行细胞癌(BUC)占所有BC病例的90%,显示一个高复发率(4,5]。局部侵犯和转移到远处器官(肺、肝、骨)导致死亡相关BUC (6]。到目前为止,BUC复杂与肿瘤转移仍未得到解决。因此,深入研究底层转移的分子机制及入侵BUC至关重要,从而提供一种新的治疗目标和提高病人的生存率。

研究说明,microrna是密切相关的肿瘤发生和工作作为一个癌症抑制剂或启动子(7)参与肿瘤细胞分化、生长,细胞凋亡(8]。因此,microrna可作为诊断和预后的生物标志物。microrna - 93 - 5 - p在这项研究中,研究作为最常见的一种循环microrna报道,位于染色体11 q22.1源于mir - 106 b - 25的家庭(9]。在研究肿瘤microrna, microrna - 93 - 5 - p被发现是一个参考基因的结直肠癌10和外阴鳞状上皮细胞癌11]。此外,研究表明,microrna - 93 - 5 - p表达水平异常升高在卵巢癌12)和前列腺癌(13]。一项研究报道,microrna - 93 - 5 - p是ectopically乳腺癌[在一个较高的水平14]。然而,对下游调节机制的microrna的p - 93 - 5 - BUC进展。

Kruppel-like因素(KLFs)转录因子广泛参与细胞活性和胚胎发育15]。一项研究提出,KLF9 KLF家族的一员,参与通过mitochondrial-dependent dexamethasone-induced巨噬细胞凋亡细胞凋亡(16]。目前,很少报道KLF9癌症调节器。一项研究报道,甲基化KLF9是乳腺癌的一个独立预后因子17]。microrna - 940促进神经胶质瘤细胞入侵和扩散通过调解KLF9 [18]。然而,BUC KLF9的机制尚不清楚。因此,研究监管KLF9 BUC有助于找到一个小说预后的生物标志物和开发一种新的治疗方法。

这项工作表明microrna - 93 - 5 - p在BUC刺激,加重BUC KLF9约束。这些结果证明了关键影响microrna - 93 - 5 - p BUC上执行。

2。材料和方法

2.1。数据可用性

htseq-count数据(肿瘤:408;正常:19)和同种型表达量化数据(肿瘤:412;正常:19)相关BUC访问TCGA的膀胱移行细胞癌(BLCA)数据集。后来,微分分析htseq-count进行数据和同种型表达式量化数据通过使用R包“刨边机,” ,adj。 值< 0.05作为微分microrna的筛选标准和正常样本的控制。接下来,microrna的目标- 93 - 5 - p与母星预测,TargetScan miRDB miRTarBase,米兰达数据库。预测的mrna被分割的表达下调mrna ( )获得候选人监管mrna的microrna - 93 - 5 - p。

2.2。细胞系,细胞培养

不灭的人类正常uroepithelial细胞系SV-HUC-1培养在CM7-1medium(美国HyClone)。人类BUC细胞系BT-B在杜尔贝科修改鹰的培养中葡萄糖(美国Gibco DMEM-H)。BUC细胞系RT4在CM5-1培养基培养和rt - 112(美国HyClone)。BUC细胞株5637放在CM2-1介质(美国HyClone)。细胞株用于实验如表所示1。所有细胞培养在37°C公司为5%2。

表1
细胞株用于实验。
2.3。细胞转染

microrna - 93 - 5 - p模仿(miR-mimics),负控制模拟(miR-NC) pcDNA3.1-KLF9质粒编码KLF9 (oe-KLF9)和空白质粒pcDNA3.1 (oe-NC)从RiboBio购买(广州)。Lipofectamine 2000工具包(美国表达载体)应用中转染miR-mimics miR-NC,或目标质粒到癌症细胞系。

2.4。实时荧光定量聚合酶链反应(存在)

总RNA分离细胞通过使用试剂盒工具包(生活技术,美国)。总RNA浓度由NanoDrop 2000系统(美国热费希尔科学)。之后,从细胞中提取的microrna相对地转录成cDNA通过TaqMan®逆转录工具包(美国应用生物系统公司)。接下来,信使rna是相对地转录成cDNA PrimeScript RT大师混合(豆类、日本)。此后,microrna和信使rna表达水平来衡量miScript SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒、德国)和SYBR®预混料交货Taq TM II(豆类、日本),分别。存在对应用生物系统公司®7500实时PCR系统(美国)热费希尔科学探测microrna - 93 - 5 - p和KLF9 mRNA表达水平。GAPDH和U6被作为内部参考KLF9和microrna - 93 - 5 - p,分别。2- - - - - -ΔΔCt值用于计算相对microrna的表达- 93 - 5 - p和KLF9信使rna在不同的治疗组。引物序列见表2。

表2
中存在的引物序列。
2.5。免疫印迹分析

蛋白质提取进行了使用里帕裂解缓冲(Beyotime,中国),和浓度决定BCA试剂盒(美国热费希尔科学)。等价的蛋白质(20μg)的每组后被转移到一个聚偏二氟乙烯膜钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳。接下来,膜被5%的牛血清白蛋白(BSA),然后一夜之间反应主要抗体在4°C。之后,膜与二次孵化抗体2 h。蛋白质印迹被观察到增强化学发光(ECL)(美国通用电气医疗集团)和由一个量子系统量化图像分析仪(美国Bio-Rad)。试验中使用的抗体主要抗体兔子anti-KLF9 (ab227920, 1: 2000),兔子anti-p-JAK1 (ab203784, 1: 1000),兔子anti-JAK1 (ab133666, 1: 1000),兔子anti-p-STAT3 (ab76315, 1: 2000),兔子anti-STAT3 (ab68153, 1: 1000),兔子anti-GAPDH (ab181602, 1: 10000),和二级抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白(ab205718, 1: 10000)。这些抗体购自Abcam(英国)。

2.6。细胞增殖的评估

细胞增殖能力评估利用细胞计数Kit-8 (CCK-8) (Dojindo、日本)。细胞接种于96孔板( 细胞/)和培养公司为5%2在37°C。0、24、48、72和96 h后,10μL CCK-8试剂是补充。之后,细胞培养公司为5%2在37°C 2 h。在450纳米波长吸光度是由一个微型板块阅读读者(美国热费希尔科学)。

2.7。细胞入侵检测

细胞( 细胞/)被添加到Transwell室涂层与基底膜基质(8μM;美国生物科学)。DMEM含有10%的边后卫被添加到众议院。24小时后,细胞在参议院轻轻地被移除。之后,众议院入侵细胞用4%多聚甲醛结晶紫在一夜之间和0.1%。图像是由一个光学显微镜。3随机领域的入侵细胞数。

2.8。伤口愈合实验

细胞接种到6-well板( 细胞/)直到融合细胞形成一层。一个200μL无菌的微量吸液管提示来轻轻地勉强通过单层的中心创建一个伤口(约0.5毫米)。之后,细胞被洗两次与PBS去除分离细胞。然后,细胞无血清培养系统中。图像在0和24小时被抓获在倒置显微镜(日本奥林巴斯)。伤口宽度测量通过ImageJ软件(美国国家卫生研究院)和伤口愈合比例计算 。

2.9。Dual-Luciferase检测

pmiRGLO荧光素酶报告基因载体(美国Promega)野生型(WT)和突变(傻瓜)KLF9 3 - - - - - -UTR构造。随后,BUC细胞系RT4被播种到96孔板( ),然后,100 nM miR-mimics / miR-NC和KLF9-WT / KLF9-MUT质粒被利用Lipofectamine 2000 cotransfected进入细胞。经过48小时的文化,通过dual-luciferase荧光素酶活性检测报告基因检测系统(美国Promega)。

2.10。细胞凋亡检测

细胞凋亡的能力被膜联蛋白化验V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)细胞凋亡检测设备。收集细胞悬浮在300年μ5 L绑定缓冲然后孵化μL膜联蛋白V-FITC解决方案在4°C为30分钟。后来,5μ美国L propidium碘(π,σ)被用于进一步孵化5分钟。最后,细胞凋亡是检查和分析与BD FACSCanto II配备BD FACSDiva软件(美国正欲)。

2.11。统计分析

每个试验进行不少于三个重复。6.0数据分析进行GraphPad棱镜(拉霍亚,CA)。结果显示为 。学生的显著性差异进行了分析 - - - - - -测试或单向方差分析。皮尔森相关分析用于分析相关性。统计学意义时 值< 0.05。

3所示。结果

3.1。microrna - 93 - 5 - p BUC非常调节水平

144年微分microrna获得(图1(一))。生物信息学分析TCGA-BLCA表现出显著的刺激microrna - 93 - 5 - p在BUC组织(图1 (b))。与此同时,一项研究证实了这种upregulation在公元前19];因此,microrna - 93 - 5 - p选择进行研究。此后,存在验证这种upregulation BUC(图在细胞水平1 (c))。总的来说,microrna - 93 - 5 - p在BUC不同激活。

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图1
microrna - 93 - 5 - p BUC细胞中表达增加。(一)火山的微分microrna在TCGA-BLCA数据集在正常组和肿瘤组。红、绿指调节基因是指表达下调的基因。(b) microrna - 93 - 5 - p的表达在正常样本和肿瘤样本。蓝箱线图是指正常样本,和红色的箱线图是指肿瘤样本。(c)中存在检测microrna的表达- 93 - 5 - p在正常和肿瘤细胞。 。
3.2。microrna - 93 - 5 - p过度刺激恶性BUC细胞的功能

如图1 (c),microrna - 93 - 5 - pexpression BUC细胞系中表达下调RT4和rt - 112;因此,这些细胞被microrna - 93 - 5 - p超表达。存在显示microrna - 93 - 5 - p明显增强后超表达(图2(一个))。之后,CCK-8化验显示,microrna的p - 93 - 5 -超表达明显(图BUC刺激细胞增殖的能力2 (b))。microrna的p - 93 - 5 -超表达明显加速BUC细胞的侵入性和迁移能力(数据2 (c)和2 (d))。细胞凋亡分析显示,microrna的p - 93 - 5 -超表达显著下调BUC细胞的凋亡水平(图2 (e))。上述结果说明,microrna - 93 - 5 - p过度刺激BUC恶性细胞的功能。

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图2
microrna - 93 - 5 - p过度刺激BUC细胞恶性表型。(a)转染效率的microrna的p - 93 - 5 - RT4和rt - 112细胞miR-NC和miR-mimic组。(b)细胞生存能力。(c)细胞入侵能力组(100 x)。(d)细胞迁移能力组(40 x)。(e)细胞凋亡率。 。
3.3。KLF9 BUC细胞明显下调

首先,1595年微分mrna筛选进行微分分析mrna在TCGA-BLCA数据集(图3(一个))。之后,microrna的预测目标基因- 93 - 5 - p与mrna表达下调,包含目标和9微分mrna结合位点的microrna - 93 - 5 - p(图得到3 (b))。相关分析显示出最高的相关性microrna - 93 - 5 p和KLF9(数字3 (c)和3 (d))。因此,KLF9终于选择进行研究。TCGA-BLCA数据显示KLF9表达明显低BUC组织(图3 (e))。存在,KLF9 mRNA表达明显下调BUC细胞系(图3 (f))。同样,免疫印迹试验也揭露了一个相当大的一滴KLF9 BUC细胞系的蛋白表达比正常细胞(图3 (g))。因此,它是假定可能KLF9 microrna的目标- 93 - 5 - p。

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图3
KLF9 BUC细胞低表达。(一)火山情节微分mrna的数据集。红色:调节;格林:表达下调。(b)的维恩图预测目标mrna的microrna - 93 - 5 - p和差异表达下调mrna。黄色是指miRTarBase。橙色是指TargetScan数据库。布朗是指不同表达下调TCGA-BLCA mrna。绿色指的是米兰达的数据库。蓝色是指母星数据库。 Red refers to the miRDB database. (c) Pearson correlation analysis of miRNA-93-5p and candidate genes. (d) Pearson correlation analysis of miRNA-93-5p and KLF9. (e) KLF9 expression in the TCGA-BLCA dataset. Blue refers to normal samples, and red refers to tumor samples. (f, g) KLF9 mRNA and protein expression levels in normal and cancer cells. 。
3.4。microrna - 93 - 5 - p BUC KLF9结合

数据库预测发现,microrna - 93 - 5 - p与KLF9共享结合位点3 - - - - - -UTR(图4(一))。基于dual-luciferase方法,microrna的p - 93 - 5 -超表达荧光素酶活性的抑制KLF9-WT 3 - - - - - -UTR,而并不影响KLF9-MUT 3 - - - - - -UTR(图4 (b))。此后,存在检测到microrna的p - 93 - 5 -超表达显著下调KLF9 mRNA表达细胞(图4 (c))。KLF9蛋白质水平显著压抑后overexpressing microrna - 93 - 5 - p被免疫印迹(图4 (d))。总的来说,microrna - 93 - 5 - p下调KLF9 BUC表达式。

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图4
microrna - 93 - 5 - p会使KLF9表达式。(一)假定的结合位点的microrna - 93 - 5 -彩球KLF9-WT / KLF9-MUT 3 UTR。(b) Dual-luciferase化验检测荧光素酶活性BUC细胞系RT4 miR-NC和miR-mimic组。(c, d) KLF9 mRNA和蛋白表达在miR-NC BUC细胞系和miR-mimic组。 。
3.5。microrna - 93 - 5 - p调节通过KLF9 BUC细胞表型

探索microrna的p - 93 - 5 -是否可以调节通过针对KLF9 BUC细胞,我们使用RT4和rt - 112细胞系构建miR-NC + oe-NC miR-NC + oe-KLF9, miR-mimics + oe-KLF9。存在和免疫印迹结果表明KLF9信使rna和蛋白质含量大大刺激miR-NC + oe-KLF9组,而相对减少在miR-mimics + oe-KLF9集团(数字5(一个)和5 (b)),说明microrna - 93 - 5 - p压抑KLF9。KLF9超表达显著限制BUC的异常,而这种抑制作用是减少miR-mimics + oe-KLF9组(图5 (c))。之后,发现迁移和入侵能力明显下降后overexpressing KLF9。然而,入侵和迁移能力明显增加,恢复在miR-mimics + oe-KLF9组与oe-NC + oe-KLF9集团(数字5 (d)和5 (e))。KLF9过度加速BUC细胞凋亡,而效果减弱了overexpressing microrna - 93 - 5 - p(图5 (f))。上述结果暗示microrna - 93 - 5 - p可能会加速通过下调细胞表型KLF9表达式。

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图5
microrna - 93 - 5 - p加速通过针对KLF9 BUC。(a, b) KLF9信使rna和蛋白质水平BUC细胞系RT4转染。(c)转染组细胞增殖。(d)转染组细胞入侵(100 x)。(e)细胞入侵不同群体(40 x)。(f)转染组细胞凋亡率。 。

4所示。讨论

最近,越来越多的研究表明,价值microrna在大多数癌症。一项研究表明,microrna - 99 - 5 - p目标mTOR肿瘤抑制剂和增强RAD001-induced人类BUC细胞凋亡(20.]。减少microrna - 199 - 5 - p培养BUC通过调制MLK3 / NF -肿瘤发生κB通路(21]。这些microrna BUC小说和潜在的生物标记物。一般来说,microrna的p - 93 - 5 -被认为是肿瘤促进剂。例如,microrna - 93 - 5 - p / IFNAR1加速子宫内膜癌转移通过STAT3通路(9]。高度保守的microrna - 93 - 5 - p被记录在外阴鳞状细胞癌(11)和结肠直肠癌10),而我们证明microrna - 93 - 5 - p水平明显调节BUC通过生物信息学分析和细胞生物学实验。的原因可能是不同的microrna基因- 93 - 5 - p介导和不同的数字拷贝。此外,细胞功能实验表明,microrna - 93 - 5 - p过度加速BUC细胞过程从而促进癌症恶化。

目前,很少研究如何microrna在BUC - 93 - 5 - p功能。本研究首先KLF9预测其潜在目标基因。然后,microrna的规定- 93 - 5 -彩球KLF9 BUC审查。一项研究报道,KLF9压制interferon-related信号预防结直肠癌(22]。miRNA-20a-5p加速非小细胞肺癌细胞增殖抑制KLF9 [23]。circPTPRA / microrna - 636 / KLF9能够调解膀胱癌扩散所澄清他et al。(24]。然而,在BUC KLF9的潜在机制仍有待完善。这里,KLF9 BUC表达下调,通过细胞生物学实验测试。此外,KLF9过度克制BUC细胞迁移、增殖,并入侵和刺激细胞凋亡BUC与对照组相比,表明KLF9 BUC克制的恶性发展。此外,针对microrna的关系- 93 - 5 - p和KLF9确认。救援试验证明,microrna的p - 93 - 5 -抑制加剧BUC KLF9表达式。这些结论在BUC提供KLF9的潜在机制,完善理论KLF9癌症调节器,并帮助精密BUC的药物。KLF9通路富集分析发现其紧密的链接JAK / STAT3通路(补充图1)。免疫印迹建议KLF9显然过度压抑JAK-STAT3-related蛋白表达,而microrna的p - 93 - 5 -超表达恢复这些蛋白质水平(补充图miR-NC + oe-NC水平1 b)。

总的来说,这项研究证明,microrna - 93 - 5 - p BUC恶化。我们阐述了microrna - 93 - 5 - p / KLF9网络BUC细胞过程。结果发现microrna的规定- 93 - 5 - p在BUC细胞功能,提供了一个新的潜在的治疗目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。数据和材料在当前的研究中可从相应的作者以合理的要求。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

TL和XW为研究设计做出了贡献。JX进行文献检索。YW获得数据。RL写了这篇文章。古银和RZ进行数据分析和起草。HW修改这篇文章。所有作者给提交版本的最终批准。

确认

本研究资金支持的高层医院培养资助从福建省级医院,福建省,中国(授予数量:2020 hsjj13),福建医科大学和科研启动基金(批准号:2019 qh1175)。

补充材料

补充图1:JAK / STAT3通路由microrna - 93 - 5 - p / KLF9。(补充材料)