文摘
猪肺炎俗称猪出血性败血病是巴氏杆菌引起的猪的传染病multocida感染。据报道,toll样受体通常在猪肺炎发展起着至关重要的作用。然而,这种现象的潜在机制尚未阐明。本研究旨在调查TLR9识别的分子机制调节猪肺炎病程。我们的研究结果表明HD-13应变的巴斯德菌multocida D (HD-13)加速TLR9识别表达猪肺泡巨噬细胞3 d4/21细胞;通过加速TLR9识别表达式HD-13激活炎症反应。从力学上看,HD-13增殖激活蛋白激酶(MAPK)和核转录因子kB (NF -κB)信号。总之,HD-13可能激活MAPK和NF -κB通路通过加速TLR9识别表达式,从而加速炎性反应级数的猪肺炎。TLR9识别可以作为一种新颖的治疗目标猪肺炎。我们的研究可能提供一个理论依据猪肺炎的预防和治疗。
1。介绍
猪肺炎,俗称猪出血性败血病,巴斯德菌引起的一种传染性疾病multocida感染分为慢性型,急性型,根据临床表现和最严重的类型和疾病的过程中1]。更重要的是,猪肺炎有很强的传染性,而且也会使其他传染病,严重影响经济效益(2]。目前,猪肺炎的防治主要依赖于抗生素,灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗等。3]。然而,没有明显的治疗效果已经达到,由于耐药性和副作用的出现(4]。因此,迫切需要阐明猪肺炎的具体发病机制寻求有效的治疗药物。
巴斯德菌multocida,是一种重要的人畜共患致病性细菌感染各种牲畜、家禽和野生动物等,结果导致出血性败血病[5]。猪巴氏杆菌multocida易感的动物之一,主要引起猪肺疾病(6]。巴斯德菌multocida分为五种类型,A, B, D, E, F,根据荚膜抗原的血清型(7]。据报道,巴斯德菌的HD-13应变multocida D (HD-13)有很强的传染性8]。本文旨在研究猪肺炎HD-13引起的具体机制。
Toll样受体(TLR)是一种跨膜蛋白由Toll基因编码的细胞跨膜受体和病原体模式识别受体(PRRs)先天免疫系统(9]。提示炎症反应的毕业典礼是独特的帮助来完成与守恒的PRRs髓细胞表面,肺上皮细胞和淋巴组织。PRRs包括通常,RIG-I-like受体(RLRs)和nod样受体(NLRs)。通常激活病毒反应通过识别病原微生物如病毒、细菌、支原体释放炎性细胞因子(10]。通常是先天免疫系统的重要成分,是用于识别和抵御外来病原体。人数是一个基因在果蝇和Toll样蛋白在动物被发现并被任命为通常。通常是守恒的,大约由10个功能通常(TLR1 TLR10)在人类和12 (TLR1 TLR9识别,TLR11 TLR13)在老鼠身上。TLR1、TLR2和TLR4、TLR5 TLR6,和TLR10表达人类的细胞表面,而TLR3 TLR7, TLR8, TLR9识别表达的膜细胞内囊泡(9,10]。TLR9识别是TLR家族中的一员,其功能是由微生物DNA的unmethylated CpG图案,启动免疫反应的诱导细胞因子和许多分子(11]。据报道,各种主机识别附着在细胞膜结构通过TLR9识别和激活下游增殖蛋白激酶(MAPK)和核转录因子-κB (NF -κB)由MyD88促进MAPK通路介导蛋白质磷酸化和NF -κB进入细胞核,进一步释放细胞炎性因子(12]。即TLR9识别是由脂多糖以同样的方式,它是通过CpG图案,导致细胞炎性因子释放。因此,推测TLR9识别、MAPK和NF -κB通路可能发挥了重要作用在炎症反应的猪肺炎。然而,这种现象的潜在机制仍不清楚。
在这个研究中,我们在猪肺炎进展,旨在探索TLR9识别角色和底层机制是被评估的水平TLR9识别下游效应器,包括骨髓分化因子88 (MyD88), toll样receptor-associated激活干扰素(TRIF)和肿瘤坏死因子receptor-associated因子6 (TRAF6)和炎性细胞因子,包括白介素- 1 (IL)β、il - 6、il - 12和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)。我们的研究结果可能会提供一个理论依据猪肺炎的预防和治疗。
2。材料和方法
2.1。小猪和组织标本
还是南方的云南小耳朵猪( ,12个/组)用于本研究由中国农业大学(中国,北京)。仔猪生长在房屋用金属栅栏和混凝土层,面积1.5到3.0米2每条,栅栏应该至少高0.6米,为每只动物提供干地躺下,充分扩展它的身体。地面用明显的斜坡和操场是水泥地板,防止污水被困或倒圆。通道与地面有一个有效的排水系统和配备泄漏粪便和尿液地板和自动饮水器。与“干猪粪处理治疗”;即粪便与污水分离,猪粪是积累和发酵,污水被排放到治疗区域远离猪的房子通过关闭和污水沟渠。养猪的合适的温度是°C,年龄在18岁至25岁之间和相对温度是40% - -60%。脏乱的地方需要温暖的冬天,没有风,夏天凉爽和通风,阴凉处。需要通风至少20次每小时为了有效地去除水分和热量的房子和给它每天不少于10 h的光。干草、锯木、chuanhua或锯末被选为铺垫材料的猪圈。床上用品应该改变一天一次。 Drinking water was provided continuously, and the pigs were provided fodder (Zhong liang, COFCO, Beijing, China) every day. At the end of the experiment, the pigs were killed by neck detachment. Spleen and lung tissues were cut and frozen at 80°C for functional experiment. The animal experiments involved in this paper were carried out in accordance with the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals issued by the National Institutes of Health (NIH).
2.2。巴斯德菌multocida、抗体、试剂
HD-13是由中国农业大学(中国,北京),它提供了可以使用了。HD-13 (104CFU /毫升)应变被鼻滴和呼吸道感染,感染和细菌的解决方案是掉进猪的鼻腔。试剂,包括PD98059担任p-ERK / ERK信号通路抑制剂,SB203580担任p-p38 / p38信号通路的抑制剂,SP600125担任p-JNK /物的信号通路抑制剂,和bay11担任NF - - 7082κB信号通路抑制剂,买来Solarbio(中国,北京)。抗体,包括TLR9识别,MyD88、TRIF TRAF6, p-ERK,兵,p-p38, p38, p-JNK,物,p-p65, p65 p-IKKα、IKKα,β肌动蛋白,由Abcam(单克隆,英国剑桥1:1000年,物种的老鼠)。
2.3。细胞培养
初级3 d4/21细胞从昆明医科大学(云南昆明)在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM,罗氏、巴塞尔、瑞士)补充10%胎牛血清(瑞士巴塞尔的边后卫,罗氏公司)和1% penicillin-streptomycin解决方案(Solarbio,北京)包含5%的潮湿的孵化器有限公司2在37°C。
2.4。细胞转染和感染
Sangon生物技术(上海,中国)综合TLR9识别核和消极的控制的随机序列(阅读全文siRNA)。当细胞confluency达到约80%,TLR9识别核或阅读全文核转染3 d4/21细胞通过Lipofectamine™3000转染试剂(豆类、辽宁、中国)。简单,3 d4/21细胞随机分为4组:阅读全文group-cells转染小干扰rna(2阅读全文μ48 h g),作为一个消极的控制;小干扰rna group-cells TLR9识别和TLR9识别核(2转染μTLR9识别沉默48 h g);HD-13 +阅读全文group-cells感染了HD-13转染和小干扰rna(2。阅读全文μ为48 h g);和小干扰rna group-cells HD-13 + TLR9识别感染HD-13和转染TLR9识别siRNA TLR9识别沉默的48 h。在48 h后治疗, 3 d4/21细胞应用于后续实验每组中。此外,在活的有机体内质粒( )通过尾静脉注入小猪注入。
2.5。RT-qPCR
试剂盒试剂(豆类、辽宁、中国)被用来提取总RNA从3 d4/21小猪与相应的质粒转染细胞或组织。M-MLV逆转录酶(前体)工具包(豆类、辽宁、中国)来合成的互补。如前所述(执行RT-qPCR13]。引物用于RT-qPCR如表所示1。
2.6。免疫印迹
总蛋白质是收获与相应的质粒转染3 d4/21细胞或感染HD-13通过细胞裂解缓冲(Beyotime,南京,中国)。西方墨迹图进行了如前所述[14]。总之,蛋白质是由钠十二烷基解决sulfate-polyacrylamide凝胶电泳,转移到聚偏二氟乙烯膜(微孔,贝德福德,妈,美国),和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。辣根peroxidase-conjugated二级抗体与膜在第二天孵化。这些墨迹和ECL试剂(微孔)的可视化。所有抗体都来自Abcam(英国剑桥1:1000)。蛋白质的光密度乐队被使用ImageJ软件量化(ImageJ软件有限公司、美国)。
2.7。免疫荧光
免疫荧光进行描述与未成年人修改。简单地说, 3 d4/21细胞被播种在板材12-well转染或感染。细胞被洗1×PBS和固定15分钟4%甲醛。然后,100年Triton-XTM添加到膜透性增加。洗后和阻塞3 d4/21细胞孵化TLR9识别或p-p65抗体(Abcam,剑桥,英国,1:1000)在一夜之间在4°C。在第二天,细胞被孵化与二次抗体(鼠标anti-rabbit IgG-HRP, Abcam,剑桥,英国1:1000)1 h。然后,细胞复染色和DAPI带盖的密封玻璃,最后用共焦荧光显微镜观察(LSM880、蔡司、德国)。
2.8。ELISA
1毫升的蛋白质提取试剂(Beyotime、南京、中国)应用于溶解肺组织是分开的小猪或者HD-13-infected plasmid-transfected 3 d4/21细胞。随后,炎性细胞因子的浓度,包括il - 6、il - 12, TNF -α,il - 1β,是由使用酶联免疫试剂盒(罗氏、巴塞尔、瑞士)手册》里描述的那样。
2.9。统计分析
代表数据从这项研究中获得的 从三个独立的实验。GraphPad Prism 5.0版本软件(GraphPad软件,Inc .)是用于统计分析的数据。一个 - - - - - -测试被用于比较两组和方差分析其次是图基用于事后分析多个组之间的比较。值< 0.05表明,差异具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。HD-13 3 d4/21细胞移植TLR9识别水平
探索toll样受体的作用在猪肺炎病程,RT-qPCR进行评估的水平通常在3 d4/21细胞,HD-13感染在0 h后,1 h, 4 h, 8 h、12 h, 24 h,分别和48 h。结果表明,除了TLR9识别基因,没有其他TLR基因的mRNA水平变化,而控制。TLR9识别基因,HD-13调节时间的方式(图TLR9识别水平1(一))。HD-13感染后的小猪在0 h, 12小时,24小时,36小时,48 h,分别进行了RT-qPCR检测TLR在脾脏组织水平;结果符合上述(图1 (b))。进一步验证的效果HD-13 TLR9识别,免疫印迹进行评估3 d4/21 TLR9识别细胞的水平,之后HD-13感染在0 h, 1 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h,分别和48 h。调查结果显示,HD-13时间的方式提升TLR9识别蛋白质的水平( ;图1 (c))。更重要的是,通过免疫荧光观察到相同的现象(图1 (d))。集体,HD-13可能上调3 d4/21细胞TLR9识别水平。
(一)
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(c)
(d)
3.2。通过上调TLR9识别HD-13激活炎症反应水平
调查是否在3 d4/21 HD-13介导炎症反应细胞加速TLR9识别,感染后HD-13或TLR9识别沉默3 d4/21细胞,RT-qPCR进行评估TLR9识别水平。结果表明HD-13调节TLR9识别和TLR9识别水平差别救了对这些基因的转染引起的小干扰rna (TLR9识别 ;图2(一个))。进一步的研究表明,TLR9识别沉默抑制下游效应器的mRNA水平TLR9识别,包括MyD88 TRIF TRAF6,但HD-13调节他们的水平。值得注意的是,TLR9识别沉默抑制MyD88的mRNA水平,TRIF, TRAF6加速HD-13 ( ;图2 (b))。上述结果进一步验证了免疫印迹( ;图2 (c))。il - 1β,il - 6、il - 12和TNF -α作为重要的炎性细胞因子(15];后感染HD-13或TLR9识别沉默3 d4/21细胞,RT-qPCR和ELISA检测进行了他们的水平。结果表明,TLR9识别沉默抑制il - 1的水平β,il - 6、il - 12和TNF -α,而HD-13调节他们的水平。此外,TLR9识别沉默抑制il - 1的水平β,il - 6、il - 12和TNF -α提升HD-13 ( ;数据2 (d)和2 (e))。综上所述,HD-13可能激活炎症反应通过加速TLR9识别水平。
(一)
(b)
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(d)
(e)
3.3。HD-13激活MAPK和NF -κB通路
调查的具体机制HD-13激活炎症反应,感染后与HD-13 0 h, 0.5 h, 1 h,和1.5 h,分别免疫印迹进行评估的水平MAPK pathway-related蛋白质,包括ERK p-ERK, p38, p-p38物,p-JNK 3 d4/21细胞。结果表明,HD-13加速p-ERK的水平,p-p38, p-JNK蛋白质,HD-13磷酸化是最有效的感染(1 h ;图3(一个))。同时,感染后与HD-13 0 h, 1 h, 6 h,和12 h,分别在3 d4/21,进行免疫印迹检测NF -的水平κB pathway-related蛋白质,包括p65 p-p65 IKKα,p-IKKα。结果表明,p-p65和p-IKK的水平α由HD-13得到晋升,最有效的时间点6 h,这证实了免疫荧光法( ;数据3 (b)和3 (c))。为了进一步验证是否HD-13激活炎症反应通过MAPK和NF -κB通路,而感染3 d4/21细胞HD-13 1 h,添加了相应的MAPK通路抑制剂,其中PD98059充当p-ERK / ERK通路的抑制剂,SB203580作为p-p38 / p38通路的抑制剂,和SP600125作为p-JNK /物通路的抑制剂。免疫印迹和ELISA结果表明HD-13促进il - 1的水平β,il - 6、il - 12和TNF -α,缓解由MAPK通路抑制剂( ;数据3 (d)和3 (f))。NF -κB通路研究以同样的方式,和类似的结果观察( ;数据3 (e)和3 (g))。总的来说,HD-13可能激活MAPK和NF -κB通路。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.4。HD-13激活MAPK和NF -κB通路通过上调TLR9识别水平
进一步调查HD-13是否激活MAPK和NF -κB通路通过加速TLR9识别表达式,从而激活炎症反应在3 d4/21细胞,感染后HD-13或TLR9识别沉默3 d4/21细胞,免疫印迹进行测量的水平MAPK pathway-related蛋白质,包括ERK p-ERK, p38, p-p38,物,p-JNK。结果表明,TLR9识别沉默抑制水平的p-ERK, p-p38, p-JNK蛋白质,但HD-13调节他们的水平。用心,TLR9识别沉默抑制水平的p-ERK p-p38, p-JNK HD-13引起的蛋白质( ;图4(一)),这表明HD-13可能激活MAPK通路通过上调TLR9识别水平。NF -κB通路是由同样的方式探讨;结果表明,TLR9识别沉默抑制p-p65和p-IKK的水平α,而HD-13上调他们的水平。有趣的是,HD-13效果是减轻TLR9识别沉默( ;数据4 (b)和4 (c))。这些发现表明HD-13可能激活NF -κB通路通过上调TLR9识别水平。综上所述,HD-13可能激活MAPK和NF -κB通路通过上调TLR9识别水平。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
猪肺炎是一种呼吸道传染病引起的巴斯德菌multocida,传染性极强,经常引起其他传染病,严重危害养猪业的好处(16]。关键是探索猪肺炎的发病机理,寻求有效的预防和治疗方法。我们的研究结果表明,HD-13可能激活MAPK和NF -κB通路通过加速TLR9识别表达式,从而激活炎症反应级数的猪肺炎。我们的研究可能提供一个理论依据猪肺炎的预防和治疗。
激活TLR发起一系列事件涉及多种蛋白激酶,最终导致一些转录因子如NF -κβ,激活MAPK干扰素调节因子(IRF)和激活蛋白1 (AP1)。众所周知,它扮演着一个重要的角色在炎症介质的感应,所以导致抗病毒先天免疫反应通过TLR3和TLR4-mediated信号转导。这是证实IFN-related基因表达的缺陷由TLR3和TLR4 TRIF-knockout老鼠9,11,15,16]。许多基因关联研究表明TLR也与过敏性哮喘的恶化。例如,TLR7和TLR 8与哮喘的发展,及其配体可以防止实验诱导哮喘气道重塑12- - - - - -16]。配体TLR10尚未确定,但他们在两个独立的单核苷酸多态性与哮喘分享相关样本。TLR4和TLR9识别与喘息,而TLR4与有浓度过敏原特异性IgE的分泌有关。因此,TLR9识别配位目前在临床试验中预防或治疗哮喘(2,4,8]。TLR9识别是主要的模式识别受体在先天免疫系统中,它选择性地识别pathogen-related分子模式启动先天免疫和诱导炎性因子的释放17]。方等人的研究表明,TLR2和TLR4与各种传染性疾病密切相关,特别是肺部疾病(18]。我们的研究结果表明,HD-13提升TLR9识别的水平及其下游效应,包括MyD88 TRIF, TRAF6。此外,HD-13激活炎症反应,因为upregulation的il - 1β,il - 6、il - 12和TNF -α表达式3 d4/21细胞。上述结果表明,HD-13可能激活炎症反应通过加速TLR9识别表达猪肺炎。
MAPK通路是先天免疫的重要组成部分,它存在于动物、植物和真菌(19]。参与调节细胞MAPK通路更保守应对各种刺激,如热休克,有丝分裂,炎症和传送细胞核的信号放大,进一步促进细胞因子mrna转录(20.]。王等人的研究表明,激活MAPK和NF -κB信号通路会加重肺炎、心肌炎和关节炎在小猪21]。在本文中,我们的研究结果表明,1 h HD-13感染显著加速MAPK-related蛋白质的水平,包括p-ERK p-p38, p-JNK。上述结果表明,HD-13激活MAPK通路。更重要的是,TLR9识别沉默抑制水平的p-ERK, p-p38, p-JNK蛋白质,但HD-13加速他们的表达,表明HD-13可能激活MAPK通路通过加速TLR9识别表达式加剧猪肺炎的发展。
NF -κB是一个多向核转录因子转录监管,监管起着至关重要的作用的天然免疫反应,获得性免疫反应和炎症反应22]。据报道,NF -κB通路密切相关的发展猪肺炎(21]。我们的研究结果表明,HD-13提升NF -的水平κB-related蛋白质,包括p-ERK p-p38, p-JNK,表明NF - HD-13激活κB通路。进一步的研究结果表明,TLR9识别沉默抑制NF -κB途径活性,由HD-13缓解。上述发现表明HD-13可能激活NF -κ通过加速TLR9识别表达式B通路,导致加重猪肺炎的发展。此外,研究表明,人体黑色素细胞表达功能TLR9识别和TLR9识别配体激活NF -κB信号和诱导黑色素细胞的细胞因子和趋化因子的表达。胞嘧啶鸟嘌呤ODN2006 TLR9识别是一种兴奋剂,可以激活NF -κB激活增加黑色素的合成。odn2006和UVB照射显著增加酪氨酸酶的表达和PMEL黑色素细胞。因此,TLR9识别刺激倾向于提高黑色素生产人类黑色素细胞和炎症细胞因子诱导。
总之,我们发现照亮HD-13加速TLR9识别表达式3 d4/21细胞,HD-13激活炎症反应通过加速TLR9识别表达式,HD-13激活MAPK和NF -κB通路,HD-13激活MAPK和NF -κ通过加速TLR9识别表达式B通路。我们的数据都表明,HD-13可能激活MAPK和NF -κB通路通过加速TLR9识别表达式,从而激活炎症反应级数的猪肺炎。我们的研究可能提供一个理论依据猪肺炎的预防和治疗。
缩写
| 通常: | toll样受体 |
| TNF-a: | 肿瘤坏死因子α |
| NF -κB: | 核转录因子κB |
| MAPK: | 增殖蛋白激酶 |
| PRRS: | 模式识别受体 |
| MyD88: | 88年骨髓分化因子 |
| TRIF: | toll样receptor-associated激活干扰素 |
| TRAF6: | 肿瘤坏死因子receptor-associated因子6 |
| HD-13: | HD-13巴斯德菌菌株multocida D。 |
数据可用性
原始数据支持这个手稿的结论将由作者提供,没有过度的预订,任何合格的研究人员。
附加分
突出了。(我)HD-13激活TLR9识别表达式3 d4/21细胞。(2)HD-13激活炎症反应通过加速TLR9识别表达式3 d4/21细胞。(3)HD-13激活MAPK和NF -κB通路。(iv) HD-13激活MAPK和NF -κ通过加速TLR9识别表达式B通路。
的利益冲突
没有利益冲突声明。
作者的贡献
徐经刘和益co-first作者。
确认
这项工作是支持由中国山西省自然科学基础研究计划(2019 jm - 133)和山西省国际科技合作计划(2018 kw - 062)。