文摘
客观的。本研究旨在调查的角色lncRNA GHET1进展的三阴乳腺癌(TNBC)。方法。肿瘤组织和paracancerous组织(正常)TNBC患者收集。人类正常乳腺细胞(MCF10A)和TNBC细胞(mda - mb - 468和HCC1937)了在体外分析。的表达lncRNA GHET1, mir - 377 - 3 - p, GRSF1检测中存在。的lncRNA GHET1和mir - 377 - 3 - p过表达或撞倒TNBC细胞,分别。确定TNBC的特定生物活性细胞,MTT,流式细胞术,和伤口愈合试验采用评估细胞增殖,凋亡,分别和迁移能力。MMP-9 MMP-2蛋白质表达水平检测细胞的免疫印迹。mir - 377 - 3 - p之间的关系和lncRNA GHET1, mir - 377 - 3 - p, GRSF1验证使用dual-luciferase记者分析。结果。lncRNA GHET1显著调节在TNBC TNBC患者组织和细胞系。过度的lncRNA GHET1显著增加扩散和迁移能力,但TNBC减少凋亡细胞。此外,过度lncRNA GHET1调节MMP-9和MMP-2蛋白表达水平。相关分析发现,mir - 377 - 3 - p与GRSF1了积极的关系,但是有一个消极的关系lncRNA GHET1。mir - 377 - 3 - p模拟减毒的影响lncRNA GHET1在细胞增殖、凋亡、迁移TNBC的细胞。结论。lncRNA GHET1促进TNBC进展通过mir - 377 - 3 - p / GRSF1信号轴。
1。介绍
乳腺癌(BC)是最常见的癌症,成为全球女性癌症死亡的首要原因。公元前美国癌症协会估计,有42260人死亡,27岁,2019年公元前1270新病例,占大约30%的女性癌症诊断(1]。这种癌症是分为五个不同的子组根据组织学特征和分子生物学技术。其中,15% - -20%病例属于三阴乳腺癌(TNBC)。TNBC诊断特性-雌激素受体(ER)的表达,孕激素受体(PR),和人类表皮生长因子受体2 (HER2) [2]。在临床上,它的特点是高侵袭性和转移率高,复发和死亡率。TNBC经常通过内部器官和大脑处于初级阶段;然而,它通常是在后期诊断(3]。转移性TNBC的整体生存中值小于1,是否接受密集的全身化疗(4]。尽管在公元前治疗显著改善,TNBC的临床管理仍然是具有挑战性的相比其他亚型,因为它的侵略和缺乏特定的靶向治疗5]。目前临床治疗方案对TNBC局限于手术、放疗和化疗。尽管一些研究已经表明,TNBC患者对蒽环类化疗方案更敏感,整体存活率仍然很低(6]。因此,开发特定的治疗来预防和治疗公元前转移目前的一个关键方面的研究。
在新的和潜在的有用的生物标记物,非编码rna的表达异常(ncRNAs)有密切的关系TNBC发生和进展(7]。长非编码rna (lncRNAs)是一类ncRNAs长度超过200个核苷酸,它被认为是在各种癌症特异表达(乳腺癌、卵巢癌等)8]。Misregulation和突变lncRNAs涉及肿瘤发病机理。改变或突变的lncRNA水平可能诱发肿瘤的生长和转移。lncRNAs可能出现致癌或肿瘤抑制活动。此外,因为他们的组织分布的特点,lncRNAs可以应用作为癌症治疗的新生物标记(9]。许多lncRNAs特异表达已经被证明对TNBC产生重大影响。例如,郑等人发现lncRNA GAS5可能目标mir - 378 - 5 - p / SUFU促进TNBC细胞凋亡及调节癌细胞对化疗药物的敏感性(10]。在王的研究et al ., lncRNAs可以调节TNBC发展通过编码小肽的形成,如LINC00908-encoded多肽ASRPS,减少血管生成(11]。此外,lncRNAs也可以控制他们的目标基因的表达水平在独联体或在反式转录因子相互作用或histone-modifying酶。例如,绑定lncRNA DANCR RXRA可能增加49/78 RXRA丝氨酸磷酸化和随后激活PI3K / Akt信号,最终影响TNBC细胞增殖(12]。然而,仍然有许多相关lncRNAs未被探索。它曾被指出,在缺氧环境中,lncRNA GHET1能促进TNBC糖酵解,增殖,并通过河马/ YAP途径[入侵13]。然而,这lncRNA TNBC的作用尚未全面阐明。因此,我们试图开展进一步的研究。
microrna也是一种ncRNAs,只包含20 - 24核苷酸(14]。他们中的许多人发挥关键作用在癌症的发展和进展,比如mir - 377 - 3 - p。先前的研究表明,mir - 337 - 3 - p作为肿瘤抑制基因在各种癌症。虽然它已经表明,Linc00339促进TNBC的进展通过mir - 377 - 3 - p / HOXC6信号通路(15),详细机制仍发现了。也不能忽略lncRNAs充当microrna的海绵。因此,我们试图询问之间是什么关系lncRNAs GHET1和mir - 377 - 3 - p和什么是在TNBC的影响,以提供新的生物标志物和治疗TNBC的目标。
2。材料和方法
2.1。临床样本
20肿瘤组织样本收集的鲁米那TNBC没有任何化疗患者接受手术治疗部分在我们医院2020年1月至2021年3月。中央部分的组织应用TNBC样本,和外围组织的质量被用作控制正常组织。样品被确认为TNBC组织由三个独立的病理学家。本研究获得了从每个病人知情同意的伦理委员会批准锦州医科大学第一附属医院(KYLL202123)。
2.2。细胞培养
TNBC细胞(mda - mb - 468和HCC1937)和人类正常乳腺细胞(MCF10A)提供的美式文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。细胞培养在一个完整的含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)(Gibco, EI尔帕索,德克萨斯州,美国),100毫克/毫升青霉素和链霉素10毫克/毫升的孵化器有限公司为5%2在37°C。
2.3。细胞转染
lncRNA GHET1超表达质粒(GHET1) shRNA争夺(sh-NC) lncRNA GHET1成分(sh-GHET1),模仿争夺(数控模拟),mir - 377 - 3 - p超表达质粒(mir - 377 - 3 - p模仿),mir - 377 - 3 - p抑制剂(mir - 377 - 3 - p抑制剂),和抑制剂数控由GenePharma(上海,中国)。这些结构的质粒转染到mda - mb - 468和HCC1937细胞,分别用Lipofectamine 2000转染工具包(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。转染介质取代完全培养基6 h后,和随后的实验进行转染48 h后。
2.4。中存在
细胞核和细胞质中提取通过使用核和胞质提取设备(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。试剂盒方法(热费希尔科学)是用于RNA提取细胞核,细胞质,整个细胞或组织。的浓度和纯度提取的RNA被NanoDrop-based然后分析检测。RNA被反向转录成cDNA用逆转录酶工具包(Zomanbio,北京)。lncRNA GHET1, mir - 377 - 3 - p,或GRSF1放大的cDNA通过使用SYBR绿色装备(豆类、东京、日本)。的引物lncRNAs GHET1, mir - 377 - 3 - p, GRSF1表中列出1。六个复制设置为每个实验。U6或GAPDH应用作为内部参考控制。量化分析了目标基因相对表达的2- - - - - -ΔΔCt方法。
2.5。MTT试验
mda - mb - 468或HCC1937细胞被播种在96 -孔板(5000个细胞/)24 h。这些细胞被沾染了20μ5 L更易为4 h / L MTT 37°C孵化器。150年之后,μL (DMSO溶液添加融化细胞,持续15分钟。最后,生存能力率检测OD 450纳米测量。
2.6。细胞凋亡检测
的膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测设备(Yeasen、上海、中国)是用来做细胞凋亡测定。mda - mb - 468细胞或HCC1937细胞被收集到一个离心管,与预冷无菌PBS冲洗两次,调整 细胞/毫升。随后,200μL细胞悬液,10μL的膜联蛋白V-FITC, 10μL 20 mg / Lπ的解决方案(设备)都是在室温下混合和避免光孵化条件10分钟,稀释500紧随其后μPBS的L。凋亡率被发现FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学、钙、美国)。
2.7。伤口愈合实验
治疗细胞被播种到6-well盘子和培养,直到融合。一个10μL无菌技巧应用于细胞创建一个伤口字段。后删除PBS的细胞碎片和分离细胞,新鲜无血清培养基添加24 h文化。挠的迁移细胞面积在倒置显微镜下拍摄。ImageJ软件用于计算迁移的面积从原来的挠伤口。
2.8。西方墨点法
细胞或组织的蛋白质浓度溶解产物检测BCA蛋白质化验设备(Beyotime、上海、中国)。每个20μ克样品中检测到的是煮1 x加载缓冲区(Beyotime)和冷却在冰盒,加载和sds - page分离,转移到PVDF膜1 h。膜被屏蔽5%脱脂奶粉1 h,孵化主要与相应的抗体在一夜之间在4°C,一式三份冲洗1 x TBS-T缓冲区(Beyotime),继续与相应的二次抗体反应1 h,并再次一式三份用TBS-T洗净。对蛋白质的发展,化学发光试剂(Beyotime)下降的膜1分钟。图像的采集完成后用凝胶成像系统(美国马热费希尔,沃尔瑟姆)。分析了微目标蛋白质的乐队ImageJ软件。GAPDH应用作为一个内部参考计算相关蛋白表达。
2.9。Dual-Luciferase记者分析
(写明ATCC)转染293 t细胞与数控模拟/ mir - 377 - 3 - p模仿和dual-luciferase记者向量lncRNA GHET1野生型(WT-GHET1) /突变(MUT-GHET1)或GRSF1野生型(WT-GRSF1) /突变(MUT-GRSF1),分别。萤火虫和Renilla荧光素酶活动测量48 h后使用dual-luciferase记者分析系统(CAS: E1910 Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)。荧光素酶活动记录GloMax 96微型板块荧光计(Promega)。
2.10。统计分析
使用SPSS 26.0统计分析。单向方差分析、独立样本 - - - - - -测试分析了多个组,两组之间的比较,分别。结果表示为 (SD)。此外,皮尔森相关分析组织样本的表达两个参数之间的相关性。 担任的截止值的显著差异。
3所示。结果
3.1。的表达lncRNA GHET1 TNBC显著调节
根据存在结果关于lncRNA GHET1 TNBC表达式,我们发现lncRNA TNBC组织中显著增加(图1(一)),以及在HCC1937和mda - mb - 468细胞(图1 (b))。在细胞水平上,lncRNA GHET1显示表达式在TNBC单元HCC1937最高。这些结果表明,lncRNA GHET1可能在TNBC致癌基因发挥作用。
(一)
(b)
3.2。lncRNA GHET1促进TNBC的恶性过程细胞
验证的作用lncRNA GHET1 TNBC发展,lncRNA是mda - mb - 468细胞中过表达,HCC1937撞倒了。超表达的有效性和可拆卸的检查中存在(图2(一个))。MTT测定细胞增殖,流式细胞术对细胞凋亡,移民和伤口愈合实验能力发现lncRNA GHET1超表达有致癌活性显著增加细胞增殖和迁移和细胞凋亡明显降低,而击倒lncRNA GHET1相反的变化(数据造成的2 (b)- - - - - -2 (e))。进一步检查的蛋白表达基质金属蛋白酶9 (MMP-9)和2 (MMP-2)表明,蛋白质表达水平MMP-9和MMP-2显著增加后的过度lncRNA GHET1细胞,但减少击倒后(图2 (f)),这表明MMP-9和MMP-2都密切相关的肿瘤迁移。上述结果表明,lncRNA GHET1参与TNBC的致癌基因。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。lncRNA GHET1充当mir - 377 - 3 - p TNBC的海绵
详细的机制lncRNA GHET1影响TNBC进展进一步调查。亚细胞分布的分析lncRNA GHET1显示,主要分布在细胞质(图3(一个))。有趣的是,ENCORI (https://starbase.sysu.edu.cn/)预测显示结合位点lncRNA GHET1和mir - 377 - 3 - p。是dual-luciferase试验验证了mir - 377 - 3 - p超表达的荧光强度降低lncRNA WT-GHET1而不影响MUT-GHET1-MUT(图3 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
明显,mir - 377 - 3 - p水平显著减少TNBC组织(图3 (c))。后续检测显示,过度的lncRNA GHET1拒绝mir - 377 - 3 - p水平。然而,击倒lncRNA GHET1显著升高mir - 377 - 3(图- p水平3 (d))。相关分析显示之间的负相关lncRNA GHET1和mir - 377 - 3 - p(图3 (e))。总的来说,lncRNA GHET1针对TNBC mir - 377 - 3 - p。
3.4。击倒mir - 377 - 3 - p逆转的影响lncRNA GHET1击倒对TNBC细胞
验证的角色的交互lncRNA GHET1和mir - 377 - 3 - p在TNBC,我们执行救援实验。TNBC细胞治疗同时过度或击倒的lncRNAs GHET1或mir - 377 - 3 - p。细胞的生物学性能测量。结果显示,lncRNA GHET1模仿(GHFT1)显著调节GRSF1蛋白质表达、细胞增殖、迁移,但降低mda - mb - 468细胞凋亡细胞。然而,这些改变被GHET1明显逆转+ mir - 377 - 3 - p HCC1937模拟超表达的细胞。此外,sh-lncRNA GHET显著降低GRSF1蛋白表达和细胞增殖和迁移,但促进了细胞凋亡。有趣的是,转染与sh-lncRNA GHET和mir - 377 - 3 - p抑制剂成功逆转变更引起的模式sh-GHFT1(数字4(一)- - - - - -4 (d))。集体,击倒mir - 377 - 3 - p恢复lncRNA GHET knockdown-induced抑制对TNBC细胞的恶性进展的影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。GRSF1的目标基因mir - 377 - 3 - p
进一步调查antioncogenic mir - 377 - 3 p的机制,我们使用了TargetScan计划(http://www.TargetScan.org/vert_72/)预测的目标基因mir - 377 - 3 - p,发现mir - 377之间的一个互动网站3 - p和GRSF1(图5(一个))。此外,mir - 377 - 3 - p超表达显著抑制WT-GRSF1的荧光强度。然而,这并不影响MUT-GRSF1 dual-luciferase记者荧光强度的测定(图5(一个)),证明有一个互动mir - 377 - 3 - p和GRSF1。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
GRSF1表达式被发现显著增加TNBC组织的存在(图5 (b))。GRSF1 mRNA和蛋白表达的调节mir - 377 - 3 - p抑制剂。然而,mir - 377 - 3 - p模仿的表达水平明显降低GRSF1 TNBC的细胞(数字5 (c)- - - - - -5 (e))。相关分析也GRSF1之间呈负相关,mir - 377 - 3 - p(图5 (f))。
的规定由lncRNA GRSF1 GHET1随后调查。结果表明,lncRNA GHET1 TNBC细胞模拟GRSF1表达明显增加,而击倒lncRNA GHET1 GRSF1表达降低(图5 (g))。相关分析还表明GRSF1之间的积极关系和lncRNA GHET1(图5 (h))。GRSF1共同的目标基因mir - 377 - 3 - p,和lncRNA GHET1可以调节mir - 377 - 3 - p / GRSF1影响TNBC的过程。
4所示。讨论
公元前TNBC的激进的亚型,其发展是由于多种癌基因和肿瘤抑制基因。全面了解分子事件和关键生物标记的识别可以提高TNBC疗法的疗效[16]。近年来,越来越多的证据强烈支持lncRNAs参与的人类癌症的发病和进展17]。为了开发新的癌症治疗,lncRNAs的功能和机制需要进一步调查。lncRNA GHET1已被证明是一个关键调控分子在许多癌症的发展。朱镕基等人发现,lncRNA GHET1也提高了通过激活HIF-1前列腺癌细胞扩散α/ notch 1信号通过绑定KLF2 [18]。值得注意的是,抑制lncRNA GHET1可以下调EGFR蛋白的表达,抑制PI3K / AKT信号活动,从而抑制细胞活性的BC (19]。与之前的研究一致,我们的研究表明,lncRNA GHET1 TNBC组织和细胞的显著调节。高表达的lncRNA GHET1显著促进细胞增殖和迁移和抑制细胞凋亡。这些发现表明,lncRNA GHET1 TNBC的发展中扮演着重要角色。
类似于其他癌症,公元前治疗包括手术切除、化疗、放疗、靶向治疗。内分泌治疗也可以应用于公元前常见。尽管化疗带来的好处有限,TNBC仍然是敏感和标准治疗。只有一小部分的TNBC患者应对目标免疫抑制网站或poly-ADP-ribose聚合酶(PARP)抑制剂。然而,他们经常会产生耐药性,甚至复发。很少有其他选项TNBC治疗(20.]。本研究的发现,lncRNA GHET1调节TNBC通过mir - 377 - 3 - p / GRSF1途径无疑对TNBC的治疗提供了新的线索。
现在公认的是,lncRNAs的表达可以作为一个信号特定细胞的状态或衡量活跃的细胞过程。因此,这种生物标记物可以提供为癌症的预后价值,甚至为癌症患者提供治疗方案(21]。最近的研究表明,lncRNAs可以调节基因的表达在不同的水平,包括染色质修饰和转录和转录后的调控22]。他们可以充当microrna与miRNA-targeted mrna,从而影响miRNA-mediated基因调控(23]。这个相声形成一个复杂的转录后的监管网络,包括mrna和lncRNAs和被称为竞争内源性RNA(龙头)网络。ceRNA-mediated监管机制是一个转录后的调控通过lncRNAs TNBC的重要途径。龙头、监管网络可以帮助我们理解潜在的生理功能和病理特征的角色lncRNAs TNBC开发和进展(24]。在这项研究中,lncRNA GHET1直接目标被发现mir - 377 - 3 - p作为ecRNA。以前,它已经表明,mir - 377 - 3 - p作为肿瘤抑制在许多类型的癌症。例如,它抑制食管癌的开发和发展针对CD133和VEGF (25)和抑制胃癌细胞增殖和转移抑制VEGFA表达式(26]。此外,mir - 377 - 3 - p是一个重要的组成部分,电抗器网络由lncRNAs在癌症发展。现有的研究报道,LINC00339促进胃癌进展通过抑制mir - 377 - 3 - p增加DCP1A表达式(27]。lncRNA SNHG4促进骨肉瘤细胞增殖和迁移,骗取mir - 377 - 3 - p (28]。在这项研究中,我们还发现mir - 377 - 3 - p可能扭转效应诱导的超表达lncRNA GHET1 TNBC细胞上,展示的共同参与lncRNA GHET1和mir - 377 - 3 - p TNBC的发展。
GRSF1是一种线粒体RNA结合蛋白,guanine-rich序列的因素,和一个组件的线粒体RNA粒子,大核糖核蛋白(RNP)结构29日]。以前的研究已经指出,GRSF1需要维持线粒体功能损失GRSF1引发DNA的损害和损害细胞增殖(30.]。在癌症的发展,GRSF1表达显著增加,高表达的GRSF1预测预后不良(31日]。在这项研究中,我们发现GRSF1目标基因mir - 377 - 3 - p,并显著提升TNBC的组织。确定的角色lncRNA GHET1 / mir - 377 - 3 - p / GRSF1 TNBC,我们同时拆除或过表达lncRNAs GHET1和mir - 377 - 3 - p,相应地,GRSF1 TNBC细胞表达的影响和生物性能也是影响。这些发现表明lncRNA GHET1 / mir - 377 - 3 - p / GRSF1 TNBC发展网络起着至关重要的作用。
基质金属蛋白酶属于锌肽链内切酶,作为细胞外基质(ECM)的关键因素变性(32]。基质金属蛋白酶起着至关重要的作用在许多病理和生理问题,包括炎症、胚胎发育、伤口愈合、肿瘤转移和入侵33]。在癌症、海拔MMP-2和MMP-9导致ECM降解,导致肿瘤浸润和转移(34]。此外,MMP-2和MMP-9还包括肿瘤的生长通过调节细胞增殖、凋亡和血管生成35- - - - - -37]。Upregulation MMP-2和MMP-9 lncRNA GHET1显然展品的致癌机制lncRNA GHET1通过MMP-2和MMP-9监管。
5。结论
总之,lncRNA GHET1增强TNBC细胞增殖和迁移的能力,减少细胞凋亡调控mir - 377 - 3 - p / GRSF1通路,因此在TNBC发挥促进作用。这些结果表明,lncRNA GHET1 / mir - 377 - 3 - p / GRSF1可能是一个潜在的预后标志物和治疗TNBC的目标。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
所有作者声明没有利益冲突。
确认
这项研究得到了辽宁省教育部支持的项目(没有。LJKZ0807)和横向项目基金支持的锦州医科大学(排名2021005)。