文摘

客观的。食道癌(EC)是一个极其侵袭性恶性肿瘤,预后不良,需要安全有效的治疗方法。免疫治疗提供了新的治疗近年来电子商务的想法。这个项目进行了探讨的作用和机制lncRNA OIP5-AS1 ferroptosis和EC的免疫疗法。方法。细胞通过CCK-8可行性的评估和乘法,集落形成试验。水平的铁2 +、MDA和脂质ROS被应用于确定ferroptosis。GPX4并通过实时PCR测定OIP5-AS1水平检查。OIP5-AS1和GPX4估计之间的关系通过RNA免疫沉淀反应试验。流式细胞术应用于检查OIP5-AS1对CD8 + T细胞的影响。结果。OIP5-AS1抑制显著地抑制EC细胞生存和增殖,诱导ferroptosis,和表达下调GPX4水平,而GPX4逆转这些影响。OIP5-AS1 / GPX4诱导CD8 + T细胞相互作用和诱导细胞凋亡通过PD-1 / PD-L1免疫检查点的CD8 + T细胞。结论。OIP5-AS1 / GPX4促进电子商务发展和缓解ferroptosis;此外,OIP5-AS1 / GPX4促进免疫逃避通过调制PD-1 / PD-L1,建议针对OIP5-AS1是一个可能的路线,可能会增强免疫治疗的有效性。

1。介绍

食管癌(EC)作为恶性肿瘤,这发生在食管鳞状上皮或腺上皮,并熟悉在人类癌症,占据90%以上的食管肿瘤的发病率正在增加在全球范围内(1]。尽管可用的治疗方法,改善由于局部浸润和远处转移,整体存活率与食道癌患者仍是失望的2]。在许多肿瘤抑制和EC的继续和发展,致癌基因已确认做一个至关重要的部分3),而在致癌作用和电子商务的发展,具体的分子机制仍有待完全阐述。因此,了解电子商务的分子机制将为治疗提供指导,筛选和食道癌的早期检测。

虽然电子商务的标准治疗方案是多种多样的(4],食道癌患者的预后仍然贫穷(5]。免疫治疗提供了新的治疗思路各种恶性肿瘤和恶性黑色素瘤大大松了一口气,nonsmall细胞肺癌,肝癌,和其他肿瘤,改善病人的生存可能性(6]。许多临床试验已经证实免疫疗法结合放疗可以提高第二和第三阶段患者的抗肿瘤效应(7]。肿瘤免疫治疗目标免疫检查站EC处理(现在是一个新的希望8]。许多免疫检查点信号因素中,程序性死亡蛋白1 /编程死亡蛋白1配体(PD-1 / PD-L1)肿瘤免疫过程中发挥着重要作用,诱导肿瘤免疫抑制微环境,促进肿瘤的扩散和转移9]。一项研究表明,高PD-L1水平显著相关肿瘤患者的生存率(10),针对PD-1 / PD-L1关心临床预后。

长非编码rna (lncRNAs)不仅是重要的监管机构正常细胞生长,分化、细胞凋亡、代谢和组织也参与许多疾病的进展,和lncRNAs已经成为潜在目标疾病治疗(11]。OPA-interacting 5反义转录蛋白1 (OIP5-AS1)在染色体15 q15.1本地化,在脊椎动物的进化是守恒的,参与癌症恶化[12]。先前的研究表明,OIP5-AS1调节肿瘤进展作为致癌或pro-oncogenic基因(13]。先前的研究表明,OIP5-AS1促进EC细胞的扩散和转移(14]。此外,研究表明,OIP5-AS1抑制ferroptosis和促进癌症发展在前列腺癌(15),而需要进一步调查的重要性OIP5-AS1 EC。鉴于上述研究基础上,调节OIP5-AS1 EC细胞ferroptosis和活动,以及免疫治疗的规定,探讨了在这项研究中,还有OIP5-AS1行动的分子机制探索,为了为EC的治疗提供新思路。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和转染

人类食道癌细胞系Eca109 TE-13,关冲,和TTN正常食管上皮细胞系HEEC都是从上海Bogu生物技术有限公司买细胞培养在无菌孵化设备37°C, 5%的公司2,5% v / v。pcDNA3.1-OIP5-AS1 / si-OIP5-AS1载体质粒及其负控制由GenePharma(上海,中国)。空白质粒被用作控制。EC在对数生长期细胞接种在6-well菜肴和转染与控制和pcDNA3.1-OIP5-AS1 / si-OIP5-AS1 70% - -80%细胞融合通过指令Lipofectamine 2000(表达载体;ThermoFisherScientific Inc .)。转染48 h后,所有的RNA,存在进行演示转染的效率。

2.2。CCK-8化验

这些细胞被制成单细胞悬液和统计。细胞被附加到墙后,每个板块被和10μ美国L CCK-8试剂(σ)是添加到每个测量吸光度在不同时间点(24小时、48小时、72 h, 96 h)。每个好测定的吸光度(A)在450 nm波长酶标记,重复三次获得的平均价值。

2.3。中存在

转染hBMSCs收集,所有RNA被试剂盒方法得到的样品,RNA浓度是决定spectrophotometrically, cDNA被逆转录合成。执行中存在根据SYBRPremix ExTaqTM II设备指令(中国人、日本)。反应条件:95°C, 0.5分钟;95°C, 5 s, 58°C, 0.5分钟,40周期;95°C, 15秒58°C, 0.5分钟,95°C, 15秒。使用GAPDH作为内部参考,2- - - - - -ΔΔCt方法是利用mir - 103 - 3 - p, OIP5-AS1, GPX4水平。引物序列都是由广州日博生物合成(中国)。

2.4。平板克隆形成实验

细胞是在对数生长阶段,常规消化,和单细胞悬浮体准备和计算。细胞接种在1000个细胞6-well板/ 2毫升/;盘子被轻轻的在动摇横向分散细胞和孵化经常在37°C公司5%210 ~ 14 d。克隆肉眼可见时在盘子里,文化是终止;培养液丢弃,与PBS洗两次,空气干燥。甲醇是固定15分钟,丢弃,风干。沾Gimsa污点10分钟,冲洗掉污渍慢慢下流水,空气干燥,拍照和计算。

2.5。免疫印迹

转染细胞提取的细胞溶解和蛋白质,蛋白质含量测定,上面的样本的数量确定,和10%聚丙烯酰胺凝胶是根据Ki67的大小和开发PCN1分子量;无水乙醇是用来关闭凝胶分离,无水乙醇倒了40分钟后,超纯水洗3次,集中凝胶插入梳子,电泳开始后30分钟的聚合。完成后的电泳,凝胶被和转移转化,PVDF膜转移和关闭1 h,然后稀释初级抗体(1:800)添加和孵化瓶一夜之间在4°C。条被第二天,TBST洗3次,放置在一个离心管和孵化二级抗体室温1 h,在TBST和洗3次。发射极耦合逻辑检测试剂准备,放到PVDF膜,反应1 ~ 2分钟,并测试机器和结果进行了分析。

2.6。RNA免疫沉淀反应试验

RNA免疫沉淀反应是根据Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀反应。实验根据麦格纳的指示把RNA结合蛋白免疫沉淀反应工具包(微孔、德国),外加AGO2和免疫球蛋白抗体加入蛋白质沉淀,和目标RNA PCR检测。目标在沉淀RNA表达被PCR检测。

2.7。流式细胞术

细胞接种于96孔板在1×104细胞/孵化24 h,在PBS清洗两次,被固定在70%酒精,并获得所有晚上在4°C。在PBS和细胞密度细胞被清洗一次改为1×106细胞/毫升。Propidium碘染色液是最终内容0.05毫克/毫升,沾在4°C为30分钟。所有组分析流动单元技术。细胞周期分析了流动单元技术。三个复制井被设置为所有组,和类似的测试了三次,平均结果。

2.8。统计分析

根据SPSS 22.0统计程序(美国),统计分析。措施表现为平均±SD ( ), - - - - - -测试是用来做个比较组之间的样本均值,单向方差分析是利用多个样本均值比较,和SNK-q测试被用于双向比较。

3所示。结果

3.1。OIP5-AS1抑制Ferroptosis和促进电子商务发展

Erastin和RSL3广泛用于ferroptosis刺激器(16]。OIP5-AS1显著缓解Erastin RSL3-exposed抑制细胞活力如图1(一)和1 (b)。后来,ferroptosis的标记,包括增强的铁水平2 +、MDA和脂质ROS ( ,数据1 (c)- - - - - -1 (e)),被OIP5-AS1明显抑制,表明ferroptosis的抑制。在子序列,EC细胞的活力和乘法检查OIP5-AS1所致。首先,在所有四个EC细胞系,OIP5-AS1水平调节( ,图1 (f))。与OIP5-AS1消极的控制,OIP5-AS1特别是加速细胞增殖曲线( ,图1 (g)),以及集落形成能力( ,图1 (h))。

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图1
OIP5-AS1抑制ferroptosis和促进电子商务发展。(a, b) OIP5-AS1监管Erastin和RSL3细胞活力的抑制效果。ferroptosis(汉英)标记,包括价水平增强,MDA和脂质ROS。(f)在所有四个EC细胞系,OIP5-AS1水平检测到存在。(g h) CCK-8和集落形成评估EC细胞的可行性。 , , 。所有的实验都重复三次。
3.2。OIP5-AS1击倒促进Ferroptosis和抑制电子商务的发展

后来,在EC, OIP5-AS1估计的影响进一步地通过使转染si-OIP5-AS1构建OIP5-AS1 low-expressing EC细胞系。Erastin和RSL3-exposed抑制细胞活力大大加剧了si-OIP5-AS1 ( ,数据2(一个)和2 (b))。此外,ferroptosis的标记,包括增强的铁水平2 +、MDA和脂质ROS ( ,数据2 (c)- - - - - -2 (e)),被si-OIP5-AS1特别加强,表明ferroptosis的发生。在子序列,比较OIP5-AS1消极的控制,si-OIP5-AS1明显抑制细胞增殖曲线( ,图2 (f)),以及集落形成能力( ,图2 (g))。

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OIP5-AS1击倒促进ferroptosis和抑制电子商务的发展。(a, b) si-OIP5-AS1监管Erastin和RSL3细胞活力的抑制效果。ferroptosis(汉英)标记,包括价水平增强,MDA和脂质ROS。(f, g) CCK-8和集落形成评估EC细胞的可行性。 , , 。所有的实验都重复三次。
3.3。在EC细胞OIP5-AS1与GPX4互动

此外,免疫沉淀反应结果表明,RNA OIP5-AS1丰富更多GPX4 mRNA相比lgG组( ,图3(一个))。结果表明,GPX4被si-OIP5-AS1被提拔GPX4 ( ,图3 (b)),GPX4显著减毒的抑制细胞生存能力相比Erastin和RSL3 si-OIP5-AS1集团( ,数据3 (c)和3 (d))。GPX4显著抑制si-OIP5-AS1-induced ferroptosis,包括铁减少2 +、MDA和脂质ROS水平( ,数据3 (e)和3 (g)。随后,GPX4相比显著增加细胞增殖概要si-OIP5-AS1集团( ,图3 (h))。集落形成增强( ,图3(我))。

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在EC细胞OIP5-AS1与GPX4互动。(a) RNA免疫沉淀反应被用来检测他们的互动。(b) GPx4检测中存在。(c, d) si-OIP5-AS1监管Erastin和RSL3细胞活力的抑制效果。ferroptosis (eg)标记,包括增强的铁水平2 +、MDA和脂质ROS。(h i) CCK-8和集落形成评估EC细胞的可行性。 , , 。所有的实验都重复三次。
3.4。通过PD-1 / PD-L1免疫检查点,OIP5-AS1 CD8 + T细胞的诱导细胞凋亡

肿瘤细胞与CD8 + T细胞,它已报告在肿瘤微环境和干扰他们的细胞毒性作用17]。因此,我们推测,CD8 + T细胞可以改变通过OIP5-AS1 / GPX4 EC。后来,EC细胞CD8 + T细胞培养,以模拟肿瘤微环境。CD8 + T细胞,一个upregulation百分比和减少细胞凋亡被流式细胞仪分析显示,而逆转GPX4 OIP5-AS1击倒的存在( ,数据4(一)和4 (b))。此外,由于PD-1 / PD-L1交互抑制CD8 + T细胞活性,增强在肿瘤免疫逃避18),我们假设通过PD-1 / PD-L1检查点OIP5-AS1 GPX4可以调节CD8 + T细胞的变化( ,数据4 (c)和4 (d))。在子序列,在共培养系统中,抗体反对PD-1和PD-L1采用块PD-1 / PD-L1为了证实我们的假设。因此,在TTN TE-13细胞,OIP5-AS1 GPX4 CD8 + T细胞比例下降,与此同时加强CD8 + T细胞凋亡,anti-PD-1或anti-PD-L1治疗可以逆转这种情况( ,数据4 (e)和4 (f))。一句话,OIP5-AS1 / GPX4一起诱导EC cell-CD8 + T细胞的相互作用,并引发CD8 + T细胞凋亡通过PD-1 / PD-L1免疫检查点。

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通过PD-1 / PD-L1免疫检查点,OIP5-AS1 CD8 + T细胞的诱导细胞凋亡。(a, b)和CD8 + T细胞的凋亡比例显示通过流式细胞术分析。在共培养系统中,抗体反对PD-1和PD-L1采用块PD-1 / PD-L1。(a, b)百分比和CD8 + T细胞的凋亡,通过流式细胞仪分析显示在EC细胞。 , 。所有的实验都重复三次。

4所示。讨论

欧共体是上消化道系统常见的恶性肿瘤之一,目前排名第八届世界上最常见的癌症(19]。在中国,食道癌等级5th恶性肿瘤的发病率,每年287000新病例和211000例死亡,主要在男性(20.]。食道癌的早期症状不明显,和大多数患者出现临床症状如吞咽困难和寻求医疗咨询、在这段时间里,这种疾病主要是在一个高级的阶段,这是预后不良的主要因素和低存活率食道癌的21]。作为分子标记的类肿瘤密切相关,lncRNAs发挥重要作用的发展和电子商务的发展。在目前的研究中,我们发现OIP5-AS1是随着电子商务的发展密切相关的人物5。


图5
OIP5-AS1击倒提升ferroptosis和免疫逃避通过调节GPX4食道癌。

先前的研究表明,OIP5-AS1可以促进电子商务发展,针对mir - 1297 (22]。同样,OIP5-AS1表达式是调节在EC的组织和细胞,能够促进电子商务发展通过调节miR-30-5p [14]。符合上面的研究,在当前的研究中,我们发现OIP5-AS1表达式在EC细胞和调节OIP5-AS1能够抑制EC细胞的增殖。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是一个集体名词的氧化物酶普遍存在于动物,和GPX4是其中一个最重要的这种酶家族的成员。李等人发现GPX4超表达与局部淋巴结转移及临床分期有关在口腔鳞状细胞癌(23]。GPX4在人类肝细胞癌的过度表达,相对于控件,可以在更高的肿瘤中扮演一个角色等级(24]。此外,研究表明,GPX4促进电子商务发展(25]。在当前的研究中,我们确认绑定OIP5-AS1 GPX4 RNA免疫沉淀反应化验,除了证实OIP5-AS1击倒能够抑制EC细胞增殖的表达下调GPX4。

目前,细胞凋亡,坏死,pyroptosis ferroptosis已确定。Ferroptosis伴随着显著增加细胞内铁离子流动,活性氧(ROS)和脂质过氧化水平,最终膜破裂由于脂质过氧化和细胞死亡细胞膜的磷脂衬里的26]。然而,有相当多的证据表明,GPX4可以用作参考标记确定细胞ferroptosis [27]。GPX4蛋白质的失活,清除脂质过氧化物的作用,导致氧化体内平衡的破坏,破坏膜结构的脂质过氧化物引发ferroptosis [28]。菲2+、MDA和脂质ROS的关键标记ferroptosis [29日]。在当前的研究中,我们发现si-OIP5-AS1大大促进了铁2 +、MDA和脂质ROS,表明OIP5-AS1抑制ferroptosis,而且,我们发现GPX4缓解si-OIP5-AS1 ferroptosis-promoting效应。

Tumour-induced免疫抑制的主要机制之一是肿瘤增殖和逃避免疫系统。肿瘤细胞使用多种免疫抑制途径抗肿瘤免疫力,其中之一就是通过PD-1 / PDL1轴,这是一个重要的“免疫检查点”(30.]。PD-1 / PD-L1通路中发挥着关键作用在慢性感染,肿瘤免疫逃避和肿瘤微环境的形成31日]。PD-L1引起t细胞耗竭和免疫耐受被认为是肿瘤免疫逃逸的主要因素(32]。除了广泛的T淋巴细胞表面表达,B淋巴细胞,树突状细胞和巨噬细胞,PD-L1也发现许多肿瘤细胞表面高表达。因此,多种细胞因子和肿瘤微环境中的液可以诱导PD-L1表达和增强PD-1 / PD-L1信号抑制细胞毒性T淋巴细胞激活的肿瘤微环境,从而促进肿瘤逃避(33]。在目前的研究中,我们应用抗体PD-1和PD-L1阻止PD-1 / PD-L1培养系统。因此,在TTN TE-13细胞,OIP5-AS1和GPX4 CD8 + T细胞的比例减少,促进细胞凋亡的CD8 + T细胞,这种现象由anti-PD-1或anti-PD-L1治疗可以逆转。这表明OIP5-AS1 / GPX4一起诱发EC cell-CD8 + T细胞相互作用和触发器CD8 + T细胞凋亡通过PD-1 / PD-L1免疫检查点。

然而,目前的研究有一些局限性和OIP5-AS1 EC临床样本的研究需要进一步探讨,此外OIP5-AS1行为是否其他目标在EC细胞ferroptosis和免疫疗法需要调查。总之,OIP5-AS1击倒促进ferroptosis和免疫逃避GPX4通过监管食道癌,和OIP5-AS1可能作为临床预后标记ferroptosis-based癌症研究和免疫疗法。

数据可用性

没有数据被用来支持本研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

捐赠侯和秦黄了同样工作和分享第一作者。