文摘
客观的。缺血再灌注是一个持续的临床挑战,可能会导致一系列的病理变化包括氧化应激。可溶性环氧化物水解酶抑制剂的抑制(医师)1 - (1-propanoylpiperidin-4-yl) 3 - [4 - (trifluoromethoxy)苯基]脲(TPPU)导致抗炎、心血管、促进血管生长的影响。因此,本研究集中在保护作用的TPPU大鼠嗜铬细胞瘤(PC-12)细胞氧化应激模型引起的H2O2。方法。CCK-8和赫斯特33342年被用来评估细胞凋亡和免疫印迹检测凋亡蛋白质和脑源性神经营养因子(BDNF)表达。结果。与100年孵化μ50米,μ25米,μM TPPU显著增加PC-12细胞生存能力。Epoxyeicosatrienoic酸(缺钱)预处理也PC-12细胞氧化应激的保护。此外,TPPU减少caspase-3和伯灵顿bcl - 2表达和诱导表达,并邂逅了对caspase-3表达式作为TPPU施加同样的效果。积极的关系被发现TPPU或邂逅了孵化和BDNF表达。结论。这些结果表明TPPU PC-12细胞氧化应激损伤诱导减少了H2O2,促进了BDNF的表达。
1。介绍
中风是一种严重的神经系统与高发病率相关条件,残疾,和死亡率(1]。死亡的第二大原因,全球大部分的中风负担起源于低收入和中等收入国家(2]。中风的主要症状包括疼痛、抑郁、认知功能、疲劳、和残疾(3]。大多数的缺血性中风是类型(4,血液流动的重建可能诱导缺血再灌注损伤(5]。的一个主要的缺血再灌注损伤是氧化应激,这可能破坏呼吸链和磷酸化,引起细胞凋亡和病理损害,最终损害神经系统功能和诱导的神经元死亡(6]。目前,没有有效的治疗缺血再灌注损伤是可用的。大量的研究集中在探索缺血性再灌注损伤中风,但只有少数已经成功地通过了临床试验(7,8]。
花生四烯酸(AA)是细胞膜的重要组成部分,在三个途径代谢:细胞色素P450 (CYP),脂氧合酶(LOX)和环氧化酶(COX)。Epoxyeicosatrienoic酸(缺钱)通过AA-CYP代谢途径。5 6-EET 8 9-EET 11, 12-EET,和14,15-EET四同分异构体的特点(9]。的特点有各种类似的生物功能,如抗炎、antiapoptosis,抗血小板聚集,血管扩张的影响10]。自的特点主要是由可溶性环氧化物水解酶水解,可溶性环氧化物水解酶抑制剂(sEHI)可能提高他们的生物效应。(1)- 1-propanoylpiperidin-4-yl 3 - [4 - (trifluoromethoxy)苯基]脲(TPPU)是一种广泛应用的sEHI医师研究。TPPU减轻神经损伤BCAS-induced激活脑低灌注的neuregulin 1 / ErbB4信号(11]。TPPU也减轻炎症,保护血脑屏障对缺血性损伤(12]。医师的抑制TPPU也保护神经元免受缺血性损伤通过抑制线粒体凋亡[13]。我们之前的研究表明,注射TPPU小鼠产生抗抑郁作用[14]。增加TPPU或邂逅了水平corticosterone-pretreated PC-12细胞也减少了神经毒性引起的肾上腺酮(15]。然而,TPPU对氧化应激损害的影响仍然未知。
脑源性神经营养因子(BDNF)是一种分泌蛋白由119个氨基酸组成,相对分子质量为000 (16]。主要分布在中枢神经系统,以及它的功能包括生存的监管、分化、神经胶质细胞和神经元的再生;促进髓鞘形成,神经元迁移,轴突的生长;和受损神经元的保护17]。脑源性神经营养因子的缺乏可能会导致神经系统疾病如帕金森病、脑萎缩,抑郁,和阿尔茨海默病(18- - - - - -20.]。氧化应激可能会减少BDNF表达(21]。我们之前的研究表明抗抑郁效应引起的TPPU BDNF水平的增加密切相关(14];TPPU也增加BDNF表达和保护PC-12细胞受到皮质甾酮(15]。
PC-12细胞系代表一个合适的细胞系为研究神经和精神系统疾病,被广泛用于研究氧化应激损伤细胞(22]。本研究评估的细胞保护作用和机制TPPU PC-12细胞氧化应激引起的H2O2。相关的脑源性神经营养因子表达的变化也被评估。
2。材料和方法
2.1。材料和化学物质
提供的中国医学科学院PC-12细胞。TPPU H2O2,赫斯特33342年,初级抗体anti-Bcl-2和anti-Bax从西格玛奥德里奇(美国)购买。细胞培养试剂获得从英杰公司(美国)。从开曼群岛的特点得到化学(美国)。细胞计数kit-8购买从Dojindo分子技术公司(美国)。Anticleaved Caspase-3抗体从细胞信号(美国),脑源性神经营养因子抗体购自微孔,anti-GAPDH收购从博士德(中国)。
TPPU溶解在40%聚乙二醇400 (PEG 400)。的特点是干和溶解在40% PEG 400,和H2O2溶解在40% PEG 400准备工作的解决方案。
2.2。细胞培养和治疗
低温贮藏PC-12细胞从液氮取出,在室温下解冻,并溶解在细胞培养基penicillin-streptomycin组成的1%,10%的边后卫,DMEM 89%。约 /毫升PC-12细胞培养皿被播种,低于5%孵化有限公司2在37°C。细胞培养基是每隔一天更换一次。
只有在指数增长阶段细胞被选为所有实验。预处理与TPPU或单一剂量的1μ遇见心仪24 h和100年最终浓度μM H2O2是补充道。所有实验进行进一步孵化后16 h。
2.3。细胞生存能力分析
CCK-8分析工具包在96孔细胞板是用来评估细胞生存能力(如前所述)(23]。细胞的治疗后,5μl CCK-8被添加到每个好,这些细胞被孵化2 h的37°C。吸光度测量的标450海里。所有的实验都重复三次。
2.4。赫斯特33342年染色
PC-12细胞和4%多聚甲醛固定20分钟在37°C。接下来,这些细胞被洗,赫斯特33342年染色方案的最终浓度5毫克/毫升补充道。片被蒙在鼓里室温15分钟。染色的解决办法是删除,片洗和密封。细胞被确定为凋亡如果细胞核密集染色或分散在显微镜下检查15]。
2.5。蛋白质提取和免疫印迹
细胞培养是用冰酷PBS,剩下的细胞里帕缓冲区包含100细胞溶解μM phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)冰提取总蛋白。接下来,这些细胞被刮掉使用刮刀和离心5分钟在12000 RPM和4°C。BCA蛋白质分析工具被用来测量蛋白质含量。提取的蛋白质样本存储在-20°C。
总共有20μg蛋白样品/车道被添加到2×加载缓冲区和煮10分钟的100°C。加载到10%的蛋白质sds - page凝胶电泳分离。随后,被转移到PVDF膜的蛋白质,这是孵化与5%脱脂牛奶1 h阻止非特异性绑定。接下来,膜是孵化与主抗体(1:1000)在4°C过夜,然后与相应HRP-conjugated二级抗体在室温下1 h。发射极耦合逻辑主要试剂用于检测特定的蛋白质。FluroChem™SP软件被用来量化的蛋白质。
2.6。统计分析
使用SPSS 20.0软件进行统计分析(IBM、美国),和结果表示为扫描电镜。比较不同人群进行使用单向方差分析(方差分析),而事后至少显著差异(LSD)测试是选择方差齐性。的值 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。TPPU提高细胞生存能力下降了H2O2全身的细胞氧化损伤
TPPU在H的效果2O2全身的细胞氧化损伤被CCK-8评估分析。控制细胞被认为是100%可行的细胞。结果表明,100年μM H2O2PC-12生存能力下降至62.9%,而100年,50岁和25岁μM TPPU显著增加PC-12生存能力为97.1%,99.8%,和97.0%,分别。然而,12.5μM TPPU孵化没有显示出对细胞氧化损伤的保护作用(细胞生存能力62.2%;图1(一))。与100年孵化μM H2O2导致原子核和核分裂,染色体聚合表明细胞凋亡如图所示由赫斯特33342年染色。值得注意的是,100年,50岁和25岁μM TPPU孵化逆转细胞凋亡。与CCK-8结果一致,12.5μM TPPU coculture没有施加任何保护作用对PC-12细胞对氧化损伤(图1 (b))。
(一)
(b)
3.2。邂逅了提高细胞生存能力下降了H2O2全身的细胞损伤
由于TPPU医师抑制剂,抑制医师可能会增加活动的特点。因此,缺钱的影响研究来评估是否有同样的作为TPPU对细胞健康有保护作用的影响。一个μ米的特点显著增加的可行性2O2受伤PC-12细胞76.9%,85.0%,78.0%,和81.7%,分别为(图2)。这些结果表明,邂逅了保护细胞免受氧化应激。
3.3。TPPU产生凋亡对氧化压力诱导细胞凋亡的影响
细胞培养与25μM TPPU 24 h,提取的蛋白质免疫印迹分析。结果表明,Caspase-3和伯灵顿TPPU治疗后蛋白表达减少,而bcl - 2增加(图3)。这些结果表明,TPPU凋亡影响H2O2全身的氧化损伤。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。TPPU逆转H2O2脑源性神经营养因子的差别全身对这些
免疫印迹分析进行进一步调查是否TPPU提高BDNF表达H2O2受伤PC-12细胞。结果显示,25岁的孵化μM TPPU BDNF表达的差别减少了对这些在H2O2全身的氧化损伤(图4)。
(一)
(b)
3.5。邂逅了对Caspase-3和BDNF在H2O2全身PC-12细胞凋亡
TPPU对凋亡的影响蛋白质和BDNF在图所示4和5。免疫印迹分析,进一步探索特点的保护作用,结果显示TPPU类似的趋势。Caspase-3蛋白表达在治疗组1μM的特点相比,显著降低其表达的H2O2组,而BDNF蛋白表达增加。这些结果表明,缺钱也可以发挥H的凋亡效应2O2全身的氧化损伤。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
据我们所知,这是第一个研究医师抑制剂在H的保护作用2O2全身的细胞氧化损伤。本研究调查的影响TPPU和特点PC-12细胞诱导的细胞凋亡2O2全身的氧化应激。总的来说,100年,50岁和25岁μM TPPU或1μM的特点加强PC-12细胞生存能力。TPPU邂逅了caspase-3和伯灵顿表达下降,生产H的凋亡效应2O2全身的细胞凋亡。TPPU和特点也废除了H2O2脑源性神经营养因子的差别全身对这些。
电子受体和活性氧(ROS)增加缺血再灌注损伤。ROS是化学包含代谢物,包括过氧化氢自由基(活性氧分子2)、羟基自由基(OH•),超氧化物阴离子(O2•- - - - - -)和nonradicals (H2O2、次氯酸和臭氧)。身体的大脑消耗20%的氧气24)和产生更多的活性氧在比其他器官缺血再灌注损伤。ROS产生不同影响包括DNA氧化、redox-sensitive转录因子的激活,蛋白质修饰、蛋白激酶激活,脂质过氧化反应,离子通道的开放(25]。H2O2是一个特别重要的ROS (26),因为它可以穿过细胞膜,并产生凋亡效应(27]。
因为缺钱是医师基质,医师抑制剂增强特点的生物活性(28]。医师的抑制酶活性,或者邂逅了水平的增加,可能会产生各种病态的抗氧化效果。沉默的医师2基因激活PI3K / Akt / GSD3β在H通路2O2全身的伤害(29日]。公园和粪便(2021)报道,邂逅了减弱顺铂肾毒性的稳定线粒体跨膜电位和减少氧化应激(30.]。然而,医师抑制剂的影响或邂逅了H2O2全身的氧化PC-12细胞凋亡是未知的。我们的研究结果表明,TPPU显著降低细胞凋亡在H2O2全身的氧化应激,露出,至少在某种程度上,对细胞健康有保护作用的效果。
脑源性神经营养因子是神经营养蛋白家族的一员。这是广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统,调节大脑发育(31日]。BDNF保护神经元细胞凋亡在活的有机体内(32),在体外(33)和强烈有利于脑ischemic-reperfusion损伤(34]。我们先前的研究显示,TPPU施加在雄性老鼠快速抗抑郁作用,所屏蔽BDNF-trkB通道拮抗剂K252a [14]。TPPU也保护PC-12细胞皮质甾酮调制BDNF表达[伤15]。这次调查显示,医师在氧化抑制剂,邂逅了提升BDNF表达stress-damaged PC-12细胞。TPPU所使用的机制或缺钱诱导脑源性神经营养因子的增加氧化应激后需要进一步研究。
总之,本研究报告TPPU在H的保护作用2O2全身的细胞凋亡分析细胞生存能力和细胞凋亡。免疫印迹显示凋亡蛋白被TPPU监管,TPPU和特点也调节BDNF的表达。新见解对于理解医师抑制剂对缺血再灌注损伤的作用提供了这些发现。因此,TPPU可能被用作预防和治疗治疗缺血再灌注损伤,但还需要进一步的基础和临床研究。
数据可用性
使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
我们感谢广绘罗,甲他Quanzhong Chang和Jiezhen Mai的专家支持。这项研究得到了广东医学研究基金(不:B2020182),普通大学青年创新人才项目(没有:2019 gkqncx034)和江门应用基础的基本和关键项目(没有:17)。