文摘
客观的。ubiquitin-like博士和无名指域1 (UHRF1)是一种蛋白质编码基因与大肠癌和其他疾病相关。因此,本研究旨在调查的效果和机理UHRF1蛋白质在人类肾癌细胞浸润和转移。方法。UHRF1干扰后或在肾癌细胞系A498和769 - p,相对mRNA和蛋白水平的UHRF1被RT-qPCR和免疫荧光检测。集落形成试验和麻省理工进行观察每组的增殖和细胞生存能力。此外,每组细胞的浸润和转移被Transwell和伤口愈合试验检测。最后,免疫印迹是用来测量MMP-2 MMP-9和蛋白表达水平的蛋白质在Wnt /β连环蛋白信号通路。结果。细胞能力、扩散、入侵和转移A498和769 - p细胞抑制干扰UHRF1之后。此外,MMP-2的表达,MMP-9,原癌基因,β连环蛋白显著减少,而GSK-3的表达β显著增加。然而,对比结果证明当UHRF1过表达。结论。干扰UHRF1的表达可以抑制人类的入侵和转移肾癌细胞系A498和769 - p,这可能与调停Wnt /β连环蛋白信号通路调节MMP-2的表达和MMP-9。
1。介绍
肾细胞癌(RCC),约占所有恶性肿瘤的-3%,2%已经第二次发生在中国的泌尿系统恶性肿瘤,发病率已增加(1]。不知不觉中发作,碾压混凝土没有特定的症状在早期阶段。因此,当患者出现典型的三联征的迹象”血尿、lumbodynia和腹部肿块,“肿瘤通过肾集合系统打破了,渗透到周围组织,甚至转移到遥远的组织(2,3]。目前,治疗RCC正变得越来越成熟,和手术治疗早期肿瘤是有效的。然而,放疗结合化疗或免疫疗法对肿瘤局部或远处转移发展没有得到一个令人满意的疗效。更糟糕的是,极有可能出现肿瘤复发和转移手术后没有有效的预防措施。近年来,转移RCC也可以与细胞因子治疗或靶向药物治疗;然而,评估效果仍然不满意在改善病人的客观反应率以及延长无进展生存(PFS)和总生存时间(OS) (4]。因此,重视研究碾压混凝土的入侵和转移机制在分子水平上。
肿瘤侵袭转移是一个复杂的生物过程(5]。基因调控中起着至关重要的作用在许多过程,如无限增长潜力,epithelial-mesenchymal过渡(EMT)和细胞凋亡逃避6]。Wnt细胞信号通路的一个重要信号通路影响肿瘤细胞的迁移和入侵能力。当Wnt /β连环蛋白细胞信号转导通路被激活,Wnt分泌蛋白质穿透细胞膜,GSK3旨在降低β/ APC /轴蛋白/ CKIa复杂。因此,这个过程可以防止β连环蛋白的磷酸化的复杂而逐渐导致β连环蛋白在细胞质中积累。当β连环蛋白积累一定数量,转移到细胞核,结合T细胞转录因子(TCF) /淋巴enhancer-binding因子(LEF)形成转录复杂。这个复杂的随后激活其下游靶基因基质金属蛋白酶(MMPs), p21和原癌基因7,8]。此外,过度的UHRF1已被确定为一个可能的生物标志物在多种恶性肿瘤,导致全球hypomethylation DNA, DNA甲基化或两者都有助于癌症发展,发展,和入侵9]。基质金属蛋白酶是一组高度同源,zinc-dependent蛋白水解酶。同时,基质金属蛋白酶降解细胞外基质成分可以把它们分解成小毛孔,使肿瘤细胞可以通过传播这些毛孔,促进肿瘤侵袭转移10]。此外,的积累β连环蛋白将增强N-cadherin之间的相互作用和细胞骨架,从而增加其亲和力间充质细胞,从而导致肿瘤细胞的浸润和转移11]。
Ubiquitin-like博士和无名指域1 (UHRF1) UHRF家族的一员,是多种肿瘤组织中高度表达。许多研究表明UHRF1密切相关,不同类型的细胞增殖,入侵和转移。此外,Daskalos et al。12)发现UHRF1在肺癌细胞诱发肿瘤抑制基因RASSF1, CYGB snps和CDH13启动子甲基化和。通过抑制其表达,UHRF1能促进肿瘤细胞入侵。此外,周et al。13)指出,Slit3 UHRF1促进基因启动子甲基化,CDH4,和RUNX3,从而加速胃癌细胞的浸润和转移。UHRF1在肝细胞癌可能加强入侵特征通过基因组稳定性和p53的规定,从而促进肿瘤进展(14]。从这一点,可以获得在不同肿瘤类型,UHRF1调节肿瘤抑制基因的表达通过不同的遗传机制,影响肿瘤细胞的入侵和迁移。添加,王等人的体外试验证实UHRF1在肾癌组织中表达的高度15]。通过干扰其表达式,增殖,迁移和入侵肾癌细胞的希望被抑制。然而,UHRF1的具体调控机制仍不清楚。因此,本研究旨在调查机制UHRF1肾癌细胞的浸润和转移。研究结果将提供更有效的指导和协助诊断、治疗和预后评价的碾压混凝土的未来。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和细胞转染
人类肾上皮细胞(HK-2),人类肾癌细胞系A498, Caki-1, 769 - p都购自上海细胞库(上海,中国)。HK-2在DMEM培养/ F-12 769 - p和A498在rpmi - 1640细胞培养介质,和Caki-1 5真品的培养基培养(美国Gibco),含10%胎牛血清(的边后卫,Gibco)。中提出了在饱和湿度孵化器在37°C公司为5%2。
核(si-UHRF1)对UHRF1和消极的控制(Si-NC)是由Ruibo设计和合成生物技术有限公司有限公司(广州)。Overexpressing质粒pcDNA3.1-UHRF1 (UHRF1) UHRF1连同控制向量(矢量)从一般购买杂志(安徽,中国)。A498培养在6-well盘子。六组,即空白组(空白),si-UHRF1集团si-NC, UHRF1,向量,建立了。按照制造商的指示,所有细胞转染进行使用Lipofectamine 2000(表达载体、钙、美国)。
2.2。原因选择细胞系A498和769 - p
细胞系A498和769 - p建立了港口突变和分泌高水平的血管内皮生长因子(VEGF)。这些细胞株高致瘤性,甚至可能提高肿瘤形成串行通道后裸小鼠保留原来的组织学特征。
2.3。MTT试验
每组的细胞增殖是MTT试验观察(美国Gibco)。每组细胞转染48小时后,769 - p和A498细胞被镀成96 -孔板(6000个细胞/)和孵化为1,2,3天。然后,20μl MTT(5毫克/毫升;美国Gibco)被添加到每个好,培养4 h。随后,培养基被删除了,150μl DMSO溶液用于溶解晶体。吸光度测量在使用标570海里。
2.4。免疫荧光分析
每组细胞转染48小时后,他们用4%多聚甲醛固定15分钟。随后,与0.5% Triton x - 100细胞是不断在室温下培养了20分钟。之后,多余的液体是吸气,与山羊血清细胞被封锁。30分钟后,UHRF1主要抗体解决方案(ab57083 Abcam)添加和孵化一夜之间在4°C。荧光二次抗体anti-LPO抗体合添加第二天和孵化为1小时37°C。之后,样本孵化与DAPI在黑暗中5分钟。细胞核染色,然后冲洗使用PBST四倍。多余的液体吸气后,安装解决方案包含antifluorescent淬火剂是用来挂载的样品图片在荧光显微镜下观察和收集。
2.5。集落形成实验
每组细胞的生存能力是通过集落形成试验观察。每组的细胞与PBS冲洗两次。每组之后,单个细胞用0.25%胰蛋白酶,然后接种到文化菜一小时。连续稀释样品获得100细胞10毫升培养基。最后,细胞接种到其他文化菜10 - 14天,紧随其后的是一个在显微镜下观察细胞集落形成。
2.6。Transwell化验
每组细胞的入侵能力被Transwell评估分析。Transwell室准备后,ECM凝胶铺在参议院,而中等含10%血清被添加到众议院,并允许站4个小时。之后,每组细胞被播种在参议院,分别培养24小时。然后,他们取出,在乙醇固定,与结晶紫染色方案。最后,在显微镜下观察细胞入侵(×100)。
2.7。伤口愈合实验
A498和769 - p细胞文化6-well板( 细胞/);转染48 h后,200μl吸管提示被用来形成细胞单层线性划伤。然后,细胞培养在5%的股份有限公司2在标准条件下孵化器在37°C。后伤口的形象被显微镜(尼康公司),伤口的宽度计算使用ImageJ软件。
2.8。RT-qPCR化验
每组总RNA提取试剂盒。随后,RNA是相对地转录成cDNA经过RNA纯度和完整性测试。随后,RT-qPCR化验进行反应条件:96°C 4分钟,94°C的30秒,30秒58°C, 72°C, 30秒,重复40倍。相对与2评估了mRNA的表达−∆∆Ct方法,GAPDH作为内部参考。引物序列显示在表中1。
2.9。免疫印迹
从每组细胞总蛋白提取时,蛋白质浓度测定用BCA蛋白量化工具(皮尔斯,23225)。蛋白质分离与12% sds - page和转移到PVDF膜。用5%的脱脂奶粉阻塞后在室温下,一夜之间,细胞膜被孵化在4°C主要抗体MMP-9(1: 1000稀释,ab58803 Abcam), MMP-2(1: 1000稀释,ab92536 Abcam),β连环蛋白(1:1000稀释、ab16051 Abcam), GSK-3β(1:1000稀释,ab93926 Abcam),原癌基因(1:1000稀释,ab32072 Abcam),和β肌动蛋白(1:800稀释、ab179467 Abcam)。第二天,膜清洗三次PBS和二次抗体孵育山羊anti-rabbit IgG-HRP(1: 1500稀释,Bioworld公司)在室温下90分钟。最后,ECL显色底物添加颜色反应。分析的结果是ImageJ软件。
2.10。统计分析
实验数据被表示为 ,并使用SPSS 21.0软件进行统计分析。此外, - - - - - -测试方法被用于比较两组。 认为结果是显著的。
3所示。结果
3.1。UHRF1肾癌细胞中高度表达
检查UHRF1表情的影响肾癌细胞的功能,我们比较UHRF1的表达在正常肾细胞和肾癌细胞,发现UHRF1显著调节在肾癌细胞比正常肾细胞(HK-2)和高度表达A498和769 - p细胞(图1(一))。小干扰rna (si-UHRF1)或UHRF1 overexpressing质粒(Pc-UHRF1) A498细胞转染表达下调或上调UHRF1表达式。淘汰赛UHRF1可以抑制其表达A498和769 - p细胞,而过度可以扭转结果(数据1 (b)和1 (c)),这表明转染成功。免疫荧光分析的结果(数据1 (d)和1 (e))表明,UHRF1主要是表达A498和769 - p细胞的细胞核。与si-NC组相比,UHRF1 si-UHRF1组的表达减少。然而,与向量组相比,UHRF1 UHRF1组的表达增加。结果表明,UHRF1肾癌细胞中高度表达。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.2。抑制UHRF1可以抑制肾癌细胞的增殖和细胞生存能力
细胞增殖是MTT试验进一步研究。结果(数据2(一个)和2 (b))确认A498扩散的能力和769 - p细胞si-UHRF1组与si-NC组相比显著降低。相反,A498的能力和769 - p细胞UHRF1组与向量组相比显著增加。细胞集落形成试验是用来评估的可行性A498和769 - p细胞(图2 (c))。我们发现淘汰赛UHRF1可以抑制细胞的可行性A498和769 - p细胞和超表达UHRF1可以极大地激励。结果表明,UHRF1参与肾肿瘤细胞的增殖和细胞生存能力。
(一)
(b)
(c)
3.3。抑制UHRF1可以抑制肾癌细胞的浸润和转移
进一步,我们检查的影响UHRF1肾细胞癌的浸润和转移。分别Transwell和伤口愈合化验,用来评估A498的入侵和转移能力和769 - p细胞。结果(数据3(一个)和3 (b))认为A498侵袭转移和769 - p细胞显著减少干扰后UHRF1表达式与si-NC组。相反,A498侵袭转移和769 - p细胞显著增加后overexpressing UHRF1与向量组( )。进一步调查的机制UHRF1调节功能变化在肾癌细胞的水平MMP-2和MMP-9检查,这是肿瘤细胞的浸润和转移密切相关(图3 (c))。它表明,MMP-2的表达和MMP-9 A498和769 - p细胞后显著增加干扰UHRF1表达式。然而,MMP-2的表达和MMP-9显著减少后overexpressing UHRF1。
(一)
(b)
(c)
3.4。抑制UHRF1可以抑制Wnt /的表达水平β连环蛋白信号蛋白
Wnt / UHRF1表达的影响β连环蛋白信号通路与肿瘤转移的同事被检测到。免疫印迹(图表示4)的表达水平β连环蛋白和原癌基因A498 si-UHRF1和769 - p细胞组明显减少;虽然GSK-3的表达水平β增加与si-UHRF1组。这些结果证实,Wnt /的激活β连环蛋白信号通路在干扰抑制UHRF1的表达。
4所示。讨论
与阴险的最常见的肾恶性肿瘤发病和强劲的侵袭性在临床实践中,碾压混凝土主要是发现在晚期放疗,化疗,和其他的治疗方法并不是有效的。然而,早期手术是目前最有效的治疗(16]。因此,它已成为一个研究重点探索恶性肿瘤生长和转移的分子机制,为碾压混凝土提供新的治疗策略。作为一种重要的外遗传性监管UHRF1参与肿瘤发展(17,18]。在目前的研究中,我们比较UHRF1的表达在正常肾细胞和肾癌细胞是否影响肾癌细胞的功能。我们发现UHRF1显著调节在肾细胞癌与正常肾细胞(HK-2)相比,在A498和769 - p细胞,给图1(一)。相比之下,一项由的差别呼声不绝于耳等人发现并得出结论,但其“对这些UHRF1依赖于一代的活性氧(ROS) (19]。然而,UHRF1可能显著差别,对这些基因的表达肿瘤抑制基因(20.]。以前,许多研究已经证实UHRF1可以用来作为癌症诊断和预后分子标记(21- - - - - -23]。例如,胡锦涛等人证明UHRF1可以促进胰腺癌的扩散通过抑制SIRT4 [24]。李等人发现,干扰UHRF1可能导致早期宫颈癌细胞的死亡。尽管它已经发现,upregulation UHRF1可以促进转移和预后不良的碾压混凝土,UHRF1调节碾压混凝土的机理还不清楚(25]。
Wnt信号分为典型的Wnt通路和两个典型Wnt通路(26]。典型的(也就是说,Wnt / Wnt信号途径β连环蛋白信号通路)是目前研究最广泛的临床实践。研究表明,近50%的目前已知肿瘤表现出与监管Wnt /异常β连环蛋白信号通路,如肠道癌症27和乳腺癌28,29日]。GSK-3等异常表达的蛋白质β(30.),β连环蛋白(3)和基质金属蛋白酶(10在途径触发持续的细胞增殖,最终导致癌症(31日]。脚手架蛋白轴蛋白坐标dual-kinase过程磷酸化分子的n端胞质β连环蛋白。βGSK3 t(连环蛋白,和其他组件所需Wnt-dependent信号事件对轴蛋白结合位点。CK1家庭成员使磷酸化β连环蛋白在丝氨酸45。这个启动磷酸化对GSK3至关重要,使磷酸化残留41岁,37岁,和将来3332]。同时,它起着至关重要的作用在肿瘤细胞的浸润和转移33,34]。因此,本研究调查了UHRF1能否调解肾癌细胞的浸润和转移通过调节Wnt /β连环蛋白信号通路。
在目前的研究中,扩散和入侵A498和769 - p肾癌细胞减少干扰后UHRF1表达式。然而,细胞的增殖和侵袭性能力提高后overexpressing UHRF1,已经证实UHRF1参与了碾压混凝土的发展。此外,免疫印迹显示MMP-2的表达,MMP-9,原癌基因,β连环蛋白减少,而GSK-3的表达β增加在A498和769 - p肾癌细胞干扰UHRF1表达式。然而,过度的UHRF1后相反的结果。这些发现的差别表明对这些UHRF1可以抑制Wnt /β连环蛋白信号通路,逐步抑制A498和769 - p细胞的浸润和转移。UHRF1被发现的启动子β连环蛋白;然而,对于开发和致癌作用,Wnt的监管β连环蛋白降解是至关重要的。糖原合成酶激酶3 (GSK-3)与肿瘤抑制蛋白轴蛋白和腺瘤息肉病杆菌被认为是开始β连环蛋白分解的伴丝氨酸/苏氨酸磷酸化(APC) (35]。
5。结论
UHRF1蛋白的功能和调制过程复杂先进的显著,和预计成为普遍的癌症生物标志物和特定的癌症治疗的目标。通过干扰UHRF1表达,肾肿瘤细胞侵袭转移A498和769 - p可能抑制。这个结果可以通过调解Wnt /β连环蛋白信号通路。这项研究提供了一个更全面的理论依据UHRF1 RCC患者的治疗目标。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者没有利益冲突的声明。
作者的贡献
研究概念和设计是由西南和CL;采集的数据是由XP和YC;分析和解释数据是由西南和CL;起草这份手稿是由西南和CL;关键的修订手稿的重要知识内容是由SW和CL;统计分析是由XP和YC。所有作者都阅读和批准了最终版本的手稿。
确认
这项研究是由第二批台州社会发展科技计划项目2020年(20 ywb61)。