文摘
背景。Lymphangiogenesis参与许多疾病的发病机制是一个过程。识别关键分子和途径针对这一过程对淋巴regeneration-associated疾病至关重要。EGR1是一个转录因子,但其功能lymphangiogenesis尚不得而知。本研究旨在探索的功能活性和分子机制在lymphangiogenesis EGR1牵连。方法。CCK-8方法,transwell迁移试验,和管形成试验被用来检测细胞活力,能动性,分别和管HDLEC细胞的形成。荧光素酶报告实验应用于检测EGR1 SOX18子活动的影响。芯片分析是用来分析的直接绑定EGR1 SOX18启动子。存在和免疫印迹分析进行调查参与lymphangiogenesis分子和途径。结果。EGR1异位表达显著增加了细胞生长,流动性,管形成,lymphangiogenesis-associated标记的表达在HDLEC细胞(LYVE-1和PROX1)。EGR1与SXO18基因启动子和转录监管HDLEC SXO18表达的细胞。沉默的促销活动SOX18废除EGR1细胞生存能力,流动性,管的形成和LYVE-1 / PROX1 HDLEC细胞中表达。SOX18过度激活JAK / STAT信号,导致增加lymphangiogenesis HDLEC细胞。结论。ERG1能促进lymphangiogenesis,介导的激活SOX18 / JAK / STAT3级联。ERG1可以作为一种很有前途的淋巴vessel-related障碍的治疗目标。
1。介绍
Lymphangiogenesis具有关键作用的疾病,如肝缺血再灌注损伤、子宫内膜异位,癌症和炎症性肠病,以及[1- - - - - -4]。lymphangiogenesis的发展涉及到大量的分子和途径。VEGF建议最重要的监管机构在淋巴管生成和广泛用作治疗目标与淋巴管生成相关的疾病,比如癌症(5,6]。然而,还有许多其他因素参与lymphangiogenesis。发现小说介质控制lymphangiogenesis是非常重要的对于发展中新的淋巴重构策略。
EGR1作为转录因子与启动子结合,控制多个pathogenesis-related基因的转录7- - - - - -9]。EGR1已被视为治疗多种疾病的目标,如前列腺癌、淋巴肿瘤,老年痴呆症,糖尿病(10- - - - - -13]。EGR1起着至关重要的作用在许多生物项目,包括细胞存活、细胞死亡,细胞凋亡,细胞活性和转移9,14,15]。EGR1演示了在血管生成有重要作用。例如,Egr1可以增强血管生成调节DCC的软骨(16]。在早期胚胎逮捕,microrna - 518 b抑制滋养层血管生成通过调制EGR1表达式(17]。燕等人报道,与CCL2 EGR1可以形成一个反馈循环,促进肿瘤血管生成在胃癌(18]。类似于血管生成,lymphangiogenesis新的淋巴管形成的过程19]。多个angiogenesis-related监管机构也被报道参与lymphangiogenesis [5,19,20.]。因此,我们假设EGR1可能也有一个至关重要的功能lymphangiogenesis的进展。
SOX18是袜亚科的成员之一,扮演着一个重要的角色在细胞分化和细胞生存在胚胎发育阶段(21]。SOX18具有重要功能的形成淋巴网络(22]。它已经证明了SOX18促进淋巴管形成胚胎发生和肿瘤导致lymphangiogenesis [23]。一项研究显示,SOX18是EGR1[下游因素24),但是否EGR1调节lymphangiogenesis通过SOX18是未知的。
本研究旨在调查的功能活动EGR1 lymphangiogenesis和识别下游目标和途径参与EGR1-mediated lymphangiogenesis。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
人类皮肤淋巴内皮细胞(HDLEC)从Jennio获得生物技术和维护在EGM-2-MV(美国Lonza),补充了EBM-2(美国Lonza)。
2.2。转染
pcDNA3.1-EGR1和控制向量买来GeneCopoeia(广州)。siRNA针对SOX18和控制核购买(GenePharma、上海、沥青)。Lipofectamine 2000(美国ThermoFisher)被用来使转染DNA质粒或siRNAs HDLEC细胞。
2.3。细胞计数Kit-8化验
HDLEC细胞被镀在96 -孔板。在指定的时间点,10μl CCK-8试剂(Seyotin生物科技、广州、中国)被添加到一式三份井和维护2 h,然后450海里的吸光度进行了测试。
2.4。EdU染色试验
HDLEC细胞被播种在24-well盘子。与PBS洗后,10μM EdU (RiboBio、广州、中国)在介质的边后卫了细胞。三小时后,细胞被固定为4%聚甲醛和沾染了阿波罗的解决方案。细胞核与DAPI染色。使用荧光显微镜染色细胞被可视化。
2.5。迁移分析
HDLEC细胞被调整的密度 在没有血清的培养基,和100年μl细胞被镀的上层舱transwell插入(美国康宁公司),而基底外侧室挤满了0.6毫升中含有10%的边后卫。在37°C孵化后24 h,细胞被固定与甲醇,其次是与结晶紫染色法(0.5%)。细胞的数量在过滤器的底部。
2.6。管形成分析
HDLEC细胞( 细胞/)在24-well盘子镀涂层与基底膜基质(美国BD科学)。盘子被维持在37°C。24小时后,形成管光学显微镜下可视化。管数量计算三个随机选择的字段。
2.7。存在分析
从HDLEC细胞总RNA分离是reverse-transcribed cDNA与PrimeScript rt - pcr试剂盒(Seyotin生物科技、广州、中国)后,制造商的协议。PCR进行了使用SYBR绿色PCR mastermix (Seyotin生物科技、广州、中国)以下引物:EGR1: 5 - - - - - -CTGACCGCAGAGTCTTTTCCTG-3和5 - - - - - -TGGGTGCCGCTG AGTAAATG-3 ;SOX18: 5 - - - - - -TTCCATGTCACAGCCCCCTAG-3和5 - - - - - -GACACGTGGGAACTCCAG-3 ;GAPDH: 5 - - - - - -GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3和5 - - - - - -CCACCACCCTGTTG CTGTAG-3 。2- - - - - -ΔΔCT公式用于计算基因表达,这是GAPDH规范化。
2.8。免疫印迹
蛋白质样品分离出HDLEC细胞分离和转移到PVDF膜(美国Bio-Rad)。孵化后5%脱脂牛奶1 h,细胞膜是主要抗体孵育1 ~ 2 h。三次洗膜TBS-Tween解决方案后,细胞膜是孵化与二次抗体结合合1 h。检测与ECL发光蛋白质乐队进行解决方案(Seyotin生物科技、广州、中国)。抗体LYVE-1和PROX1来自Abcam(英国)。抗体GAPDH, JAK2、phospho-JAK2 STAT3和phospho-STAT3 (Tyr705)从细胞信号技术(美国)。
2.9。荧光素酶报告实验
SOX18启动子与EGR1绑定主题(一个892个基点片段的上游ATG启动密码子)与引物5放大 - - - - - -GTGGCCTGGGCTGGGCAGGGGAGC-3和5 - - - - - -TCCAGCTGGGCGCGGCCTGGGC-3然后插入一只萤火虫荧光素酶向量pGL4.10 (pGL4.10-SOX18)。荧光素酶的记者分析,HDLEC细胞( 每24-well板)被播种。细胞连接后一夜之间,pcDNA3.1-EGR1(或者控制向量)转染HDLEC细胞一起pGL4.10-SOX18(或空pGL4.10向量)和Renilla荧光素酶向量48 h。Dual-Luciferase记者分析系统(Promega)是用于检测Renilla和萤火虫荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活动规范化Renilla荧光素酶活性。
2.10。染色质免疫沉淀反应(芯片)
染色质免疫沉淀反应(芯片)试验设备(美国Sigma-Aldrich)是用于检测直接绑定EGR1 SOX18启动子。短暂,HDLEC细胞用甲醛固定,染色质是分为200 ~ 500 bp碎片。染色质片段是孵化anti-EGR1抗体或控制免疫球蛋白在一夜之间在4°C。PCR进行放大的DNA。引物被用于放大后的启动子区域SOX18: 5 - - - - - -CGGGGAGGAGGCGGCCCCGAC-3和5 - - - - - -TCCAGCTGGGCGCGGCCTGGGC-3 。PCR电泳测定的产物。
2.11。统计分析
所有的数据都显示为 。统计与学生的进行了比较 - - - - - -测试(两组)或单向方差分析(超过两组)。被认为是统计学意义 。
3所示。结果
3.1。EGR1 HDLEC提高细胞的过度增长,移民,和管形成
调查的影响EGR1 lymphangiogenesis,我们过表达EGR1 HDLEC细胞。结果证实,有增加EGR1表达式EGR1-overexpressed HDLEC细胞(图1(一)和图S1)。然后,我们访问EGR1对HDLEC细胞生长的影响。细胞的可行性EGR1-overexpressed HDLEC细胞相比大大增加了控制细胞(图1 (b))。Transwell迁移试验显示,过度EGR1高度升高的迁徙活动HDLEC细胞(图1 (c))。管子的数量也是高度升高HDLEC细胞转染后EGR1(图1 (d))。的水平与结果一致,LYVE-1 PROX1,两个关键lymphangiogenesis的监管机构,也提高了(图1 (e)和图S2)。总的来说,这些数据表明,EGR1可以增强生存能力,能动性,管形成HDLEC细胞。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.2。异位表达SOX18 HDLEC细胞生存能力提高,能动性,管形成
SOX18 EGR1上游是一个监管机构,调节细胞生存、分化和迁移24]。一致,我们发现EGR1可以增加SOX18 mRNA和蛋白表达水平(图2(一个))。接下来,我们检查的潜在活动SOX18 HDLEC细胞。EdU-positive细胞的数量在高架SOX18-overexressing HDLEC细胞EdU染色(图做了演示2 (b))。此外,迁移活动SOX18-overexressing HDLEC细胞也增加(图2 (c))。此外,该管的形成也增加SOX18-overexressing HDLEC细胞相比,控制细胞(图2 (d))。LYVE-1和PROX1蛋白质的水平是增强HDLEC细胞overexpressing SOX18而控制细胞(图2 (e))。总的来说,这些数据显示SOX18的促销活动调节的可行性,在HDLEC细胞迁移和管形成。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。SOX18 EGR1调节转录
EGR1是一种转录因子,通过与目标交互调节基因转录基因启动子。调查是否EGR1转录监管SOX18 HDLEC细胞的荧光素酶报告实验进行SOX18启动子。EGR1可以显著增加SOX18启动子荧光素酶活性(图3(一个))。的直接绑定EGR1 SOX18发起人需要调制的SOX18 EGR1。验证有一个互动EGR1 SOX18启动子,芯片分析。如图3 (b),EGR1抗体可以结合SOX18启动子(图3 (b))。此外,消声EGR1已故SOX18蛋白质水平(图3 (c))。总的来说,这些结果表明,EGR1 SOX18转录监管机构。
(一)
(b)
(c)
3.4。通过激活SOX18 EGR1促进Lymphangiogenesis
接下来,我们调查是否SOX18调制导致EGR1-induced lymphangiogenesis。的异位表达EGR1 HDLEC细胞生存能力增加,但这种效应抵消了siRNA-mediated沉默的SOX18(图4(一))。迁移试验显示转染的EGR1 HDLEC细胞的迁移能力增强,这可能是减少SOX18击倒(图4 (b))。此外,损耗SOX18减毒EGR1 overexpression-induced管形成HDLEC细胞(图4 (c))。沉默的SOX18废除的增强效果EGR1过度LYVE-1和PROX1表达式(数字4 (d)和4 (e))。总的来说,这些数据表明EGR1诱发lymphangiogenesis通过upregulation SOX18。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.5。SOX18诱发Lymphangiogenesis通过JAK2 / STAT3通路
JAK2 / STAT3通路参与lymphangiogenesis的进展,和SOX18报道规范这个途径(25]。因此,我们调查是否SOX18-mediated JAK2 / STAT3激活参与了lymphangiogenesis。Upregulation SOX18 p-JAK2和p-STAT3的水平升高,但没有显著影响其蛋白表达(图5(一个))。进一步调查lymphangiogenesis JAK2 / STAT3通路的影响,JAK2 / STAT3通路抑制剂ruxolitinib应用。虽然SOX18的超表达显著增加的迁徙活动HDLEC细胞,治疗ruxolitinib减少增加(图5 (b))。管形成分析还表明,ruxolitinib下降管形成上升的SOX18超表达(图5 (c))。此外,的宣传效果SOX18过度LYVE-1的水平和PROX1被治疗ruxolitinib中和(图5 (d))。此外,ruxolitinib也减少EGR1-induced LYVE-1和PROX1表达式(图S4)。在一起,这些数据暗示SOX18介导激活JAK2 / STAT3有助于lymphangiogenesis晋升。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
淋巴系统是至关重要的体内平衡及其畸变与多种疾病的进展1- - - - - -4]。因此,发现淋巴管道的关键因素控制增长应该治疗有很大的好处。EGR1在血管生成是一个重要的监管机构,但其功能lymphangiogenesis不是众所周知的。目前的研究表明,EGR1 lymphangiogenesis刺激活动。此外,我们的数据显示,EGR1通过激活诱导lymphangiogenesis SOX18 / JAK2 / STA3通路。
血液和淋巴网络交付所需气体,液体,分子,以及脊椎动物身体内细胞(19,26,27]。血液和淋巴结构都排列着内皮细胞与细胞外环境(28]。血管生成和lymphangiogenesis经常发生病理条件下,如炎症、组织损伤和肿瘤生长(29日,他们都是对多个抗病诱导剂或抑制剂(19,30.,31日]。许多研究已经报道,因素对lymphangiogenesis参与血管生成也有影响。例如,MetAp2据报道有一个双重角色在血液和淋巴管的形成5]。EGR1已经证明有至关重要的作用在血管形成16- - - - - -18]。有趣的是,我们表明,EGR1能够显著增加扩散,能动性,HDLEC细胞和管形成,说明促进淋巴EGR1活动一代。因此,我们的数据和之前的结果表明,EGR1血管生成和lymphangiogenesis具有双重作用。
SOX18是袜亚科的成员之一,具有重要功能的形成淋巴网络(22]。使用分子、细胞和基因化验,SOX18是证明是重要的小鼠淋巴内皮细胞的分化32]。畸变的SOX18遗传水平上抑制小鼠黑色素瘤lymphangiogenesis [33]。最近的一项研究也报道了SOX18与VEGFC调节淋巴形成在斑马鱼34]。一致,我们发现SOX18可以增加细胞生长,能动性,管HDLEC细胞的形成。EGR1转录监管机构,其绑定所需的启动子区域的目标是其监管。我们的数据表明,EGR1增强启动子活性SOX18和互动促进SOX18 HDLEC细胞,表明EGR1 SOX18的转录激活因子,这是符合的一项研究[24]。此外,击倒SOX18尊敬lymphangiogenesis EGR1的促销效果,确认的贡献在EGR1-induced SOX18淋巴管的形成。
JAK / STAT3通路调节许多过程,如细胞活力、细胞活性和血管生成(35- - - - - -37]。最近的研究也显示,JAK / STAT3通路也涉及淋巴重构。据报道,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)抑制肺癌肿瘤lymphangiogenesis通过JAK / STAT3级联(38]。il - 6一直还显示促进lymphangiogenesis通过激活JAK / STAT3信号(39,40]。SOX18一直显示调节JAK2 / STAT3通路促进喉癌细胞生长,细胞活性,入侵(25]。一致,我们发现的异位experssion SOX18 JAK2和STAT3磷酸化的增加。重要的是,治疗JAK2 / STAT3抑制剂在HDLEC废除了促进细胞SOX18引起的运动性和管形成。这些发现表明SOX18诱导lymphangiogenesis通过JAK2 / STAT3信号。
5。结论
我们的结果表明,异位表达EGR1增强HDLEC细胞生存能力,能动性,形成管通过SOX18-mediated JAK2 / STAT3激活。因此,EGR1可能作为治疗疾病的一种新颖的目标参与淋巴生成。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
李阳和李余以来被视为第一作者作者的贡献同样这项工作。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(81873530)和项目的广东省科学技术厅(2014 a010107008)。
补充材料
图S1: mRNA的表达EGR1 HDLEC细胞overexpressing EGR1由存在决定。图S2: mRNA的表达LYVE-1和PROX1 HDLEC细胞overexpressing EGR1被存在了。图S3:的mRNA水平SOX18 HDLEC细胞overexpressing SOX18检测中存在。图S4: ruxolitinib也减少EGR1-induced LYVE-1和PROX1表达式。(补充材料)