文摘

背景。组织工程的发展提供了一种新方法的临床治疗骨缺损,但缓慢的问题形成和缓慢的组织工程骨血管化一直存在。研究表明,血管内皮细胞的结合文化体系和脂肪干细胞优于单一细胞修复骨缺损。与优秀的扩散能力,合成分泌胶原蛋白和各种监管因素和成纤维细胞可以分化为成骨细胞和有潜力成为优秀的种子细胞参与组织工程骨建筑。客观的。调查结合的文化的影响成纤维细胞,血管内皮细胞,脂肪干细胞脂肪干细胞的增殖和成骨分化。方法。细胞被分为4组:脂肪干细胞,脂肪干细胞+ coculture组血管内皮细胞,脂肪干细胞+纤维母细胞coculture集团,脂肪干细胞+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture组。细胞的形态变化一个倒置显微镜下观察。后1、3、5、7、9天coculture,脂肪干细胞的增殖在每组由CCK-8检测方法并绘制生长曲线。脂肪干细胞在每组与茜素红染色和碱性磷酸酶在7天,14日,21日和28日。在coculture的第三周,用免疫印迹检测骨形成蛋白2的表达水平在每组脂肪干细胞。结果和结论。(1)经过14天的文化,一些细胞脂肪干细胞+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture集团融合形成团状,分布在巢穴,而脂肪干细胞脂肪干细胞组没有一个细胞形态和细胞集群观察。(2)细胞生长曲线基本上是相同的每组中,与吸光度值逐渐增加。脂肪细胞的吸光度值+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture组最高,其次是脂肪细胞+纤维母细胞coculture组然后脂肪细胞+纤维母细胞coculture组。(3)茜素红染色显示负面反应在每组7天,和少量的红色阳性细胞逐渐出现在每组随着时间的推移。28天,红色阳性细胞被发现在所有组织,和他们中的大多数coculture组脂肪干细胞+ +成纤维细胞,血管内皮细胞显示红色的焦点。coculture组脂肪干细胞+血管内皮细胞和脂肪干细胞+成纤维细胞减少,脂肪干细胞组是最少的。在28天的碱性磷酸酶染色,细胞在每组红色阳性颗粒,和脂肪干细胞+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture纤维母细胞和脂肪干细胞+ coculture组最多,其次是脂肪干细胞+血管内皮细胞coculture组然后脂肪干细胞组。(4)骨形成蛋白2表达的所有组织,特别是脂肪干细胞+纤维母细胞coculture集团和脂肪干细胞+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture组。(5)成纤维细胞可以促进脂肪干细胞成骨分化比血管内皮细胞,但扩散效果不如血管内皮细胞。 The coculture system of fibroblast combined with vascular endothelial cells and adipose stem cells promoted the proliferation of adipose stem cells and the rapid and efficient differentiation of adipose stem cells into osteoblasts.

1。介绍

从生理的角度来看,维护骨组织功能完成互动,推广,和联合行动的各种细胞,细胞外基质,和各种细胞因子。先前的实验已经证实合并后文化系统的血管内皮细胞(vec)和脂肪干细胞(ADSCs)修复骨缺损的能力比单个细胞(1]。

成纤维细胞(神奇动物)和成骨细胞是来源于胚胎间质细胞和维持高增殖特性,在一定条件下可以分化为成骨细胞和表达成骨的标记(2]。成纤维细胞存在于人体的各个组织,可以轻松快速地获得。他们可以自体移植,可以分化成三层(3]。成纤维细胞细胞因子发挥关键作用的增长和发展骨骼系统和骨折愈合。因此,本研究认为结合文化系统中的成纤维细胞的应用脂肪干细胞和血管内皮细胞的研究成纤维细胞和血管内皮细胞的影响脂肪干细胞的增殖和成骨分化。它提供了实验和理论依据选择用于骨组织工程的种子细胞,促进快速骨生成和血管化的组织工程化骨和探索细胞之间的交互。

2。实验材料

实验的主要设计是体外细胞学的观察实验,实验进行,在昆明动物研究所,中国科学院,从2019年4月到2020年2月。

实验材料由包括以下三个部分:(1)细胞来源:脂肪细胞来自昆明细胞库,典型的文化宝藏,委员会中国科学院(细胞行号KCB2010101)。血管内皮细胞是来自昆明细胞库,典型的文化宝藏,委员会中国科学院(细胞行号KCB2012087YJ)。成纤维细胞是来自昆明细胞库,典型的文化宝藏,委员会中国科学院(细胞行号KCB2019021YJ)。(2)实验主要试剂:骨形态形成蛋白2(美国多国评价);CCK-8(美国Gibco);EDTA(σ);胰蛋白酶(σ);低糖DMEM培养基(Gibson);甲基纤维素(研发公司);内皮细胞培养基(ScienCell);免疫印迹工具包(美国Gibco);二甲亚砜(σ);alizuhong(上海Saieise试剂有限公司); BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Coloration Kit (Beyotime Biotechnology Institute); and hematoxylin (Beyotime Biotechnology Institute) are the main reagents.(3)实验主要仪器:超净工作台、恒温有限公司₂孵化器(热科学);倒置显微镜(奥林巴斯);低温超高速离心机(MCE);低温自动平衡离心(北京医科离心机厂);电热恒温水箱(上海医疗器械厂7号);和紫外线投影分析仪(上海逸恒科技有限公司)是主要的工具。

3所示。实验方法

3.1。细胞培养和鉴定

前面描述的细胞培养方法(1]。简而言之,把细胞在一个恒温的有限公司₂孵化器2 - 4小时,取出适量的原始介质,并逐步把新旧媒介从少到多通道。细胞消化后,添加L-DMEM完全培养基(含10%胎牛血清,1%链霉素、头孢菌素1%,20μg / L血管内皮生长因子,2μ胰岛素样生长因子1 g / L, 2μg / L基本成纤维细胞生长因子和20μg / L表皮生长因子),细胞被放置在一个培养瓶底面积25厘米²孵化器和孵化37°C。每隔一天更换培养基,和成纤维细胞的增殖需要每天更换。细胞融合覆盖超过90%时,细胞用0.25%胰蛋白酶和0.01% EDTA消化和培养比1:2。增殖率的第四代人类脂肪干细胞在第四个星期,第五代人类成纤维细胞在第三周,和第五代人类血管内皮细胞在第三周是相对稳定的。观察每一个细胞的形态变化和扩散在倒置相差显微镜下观察。

在细胞表面标记的识别,免疫荧光法用于检测抗体的表达CD90、CD105, CD133、vWF、附着细胞波形蛋白,肌动蛋白(4]。细胞种植在96孔板,5井的人类脂肪细胞的干细胞和血管内皮细胞,4是染上荧光标记和1用作阴性对照组。样本与PBS洗两次,与40 g / L多聚甲醛固定30分钟,10分钟干,3%血清白蛋白孵化了20分钟。不同主要抗体被添加在4°C,然后离开休息一夜之间,与PBS洗3次。适量的羊anti-rabbit或anti-mouse CY3荧光素标记二次抗体了,孵化在湿盒37°C为30分钟,与PBS洗3次,浸泡与DAPI 60年代,密封与缓冲甘油50%,荧光显微镜下观察。

3.2。实验组织和显微观察

脂肪干细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞cocultured,分为以下四个组:(1)脂肪干细胞组,(2)脂肪干细胞+血管内皮细胞coculture组,(3)脂肪干细胞+纤维母细胞coculture集团和④脂肪干细胞+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture组。脂肪干细胞被放置在20 6-well盘子,和非接触coculture模型建立了通过Transwel细胞孔隙大小为0.4μ米(5]。细胞培养在37°C公司₂孵化器的体积分数为5%。脂肪干细胞在众议院被消化和亚文化每两或三天,cocultured两周在正常情况下,在显微镜下观察和记录。文化模型如图1。

3.3。CCK-8探测每组的扩散和绘制生长曲线

脂肪干细胞的每组cocultured 1, 3, 5, 7, 9天一步1.4.2,和细胞浓度调整 /毫升。细胞接种100μ在5 L / 96孔板,每组和4多井的盘子。与10 CCK-8试剂添加到盘子μ信用证。细胞在细胞孵化器孵化2 h。绘制细胞生长曲线。

3.4。茜素红和碱性磷酸酶染色

(1)饱和茜素红染色:每组的脂肪干细胞cocultured 7日,14日,21日和28天一步1.4.2与饱和钙茜素红染色;细胞从1的每组与PBS洗两到三次和风干。添加适量的10%中性甲醛,固定在室温下为30分钟,与超纯水洗两到三次。茜素红染色的解决方案是添加0.5%,染色溶液轻轻摇动在振动台5 - 10分钟。PBS是洗一次15分钟,PBS吸,添加了超纯水,骨钙的分泌细胞在每组一个倒置显微镜下观察。(2)碱性磷酸酶染色:偶氮耦合方法被用来测量碱性磷酸酶活性;每组的脂肪干细胞cocultured 7日,14日,21日和28天一步1.4.2用于碱性磷酸酶染色;细胞从1在每组与PBS冲洗两次,然后晒干,与40 g / L多聚甲醛固定30分钟,用蒸馏水冲洗,并添加孵化解决方案(磷酸萘酚是双20毫克,二甲亚砜0.5毫升,0.2 mol / L巴比妥酸盐醋酸缓冲50毫升,hexazo parafuchsin 0.5毫升,pH值和9),在室温下孵化为45分钟,用水洗,晒干。混合细胞碱性磷酸酶染色是在倒置显微镜下观察。

3.5。采用免疫印迹检测骨形成蛋白2的表达

脂肪干细胞培养21天的每组添加到里帕溶解冰溶解蛋白分离解决方案(6),蛋白质含量是衡量BCA法、sds - page胶制备、蛋白质样本加载了分离和膜转移和密封在室温下以3% BSA 1 h,屏蔽解决方案被移除,PVDF膜与TBST2洗。抗体在室温下孵化瓶1 h,和化学发光显示。相对蛋白质表达水平显示了目标的灰度值的比值乐队的β肌动蛋白带(7]。

3.6。主要结果测量

(1)细胞培养2周后,脂肪干细胞的形态是在显微镜下观察到。(2)CCK-8在每组用于检测细胞增殖。(3)饱和茜素红和碱性磷酸酶染色结果显示每组的脂肪干细胞。(4)骨形成蛋白2的表达,脂肪干细胞的成骨的标记,被免疫印迹检测评估的成骨分化能力coculture系统。

3.7。统计分析

所有的实验数据都表示为 ,与 测试水平。单向方差分析被用于对比组,a测试被用于对比较和统计软件SPSS 26.0被用于统计分析。 被认为是具有统计学意义。

4所示。结果

4.1。细胞培养和鉴定

以下4.4.1。脂肪干细胞的形态观察和识别

(1)倒置相差显微镜下观察到,大量的梭形细胞和多面体细胞稳定传播到4周后观察和3代。胞体大,细胞核居中,增长是形状的巢穴,安排在一个紧凑的常规方法。表面抗原鉴定表明,CD90和CD105染色的第三代脂肪干细胞阳性免疫荧光检测(8),CD133和vWF是负的,没有发现阳性细胞在消极的控制。14天的成骨诱导后,碱性磷酸酶染色显示,大部分细胞呈阳性,细胞融合成团体,蓝色和黑色颗粒相互融合,排列成一个网络。茜素红染色显示部分的融合细胞钙,钙的形成与大红色斑片状钙化结节。染色结果证明细胞成骨分化能力,所以获得的细胞测定脂肪干细胞(9),如图2(2)血管内皮细胞在形态学观察和识别,倒置相差显微镜下观察,细胞生长的数量大,形态是多元化的,包括梭状回和多边形混合生长,排列成块和包,单分散分布。表面抗原鉴定表明,CD133和vWF染色阳性的血管内皮细胞的免疫荧光检测后3周的亚文化10),CD90染色是消极的,没有发现阳性细胞在消极的控制,如图3(3)在成纤维细胞形态观察和识别,倒置相差显微镜显示有大量的细胞有大量细胞尸体,其中大多数是梭状回和梭状扁平细胞,但其中一些不规则的形状。细胞是由细长的相互交联过程和密集安排在漩涡的形状。表面抗原鉴定表明,波形蛋白(波形蛋白)染色是积极和肌动蛋白(肌动蛋白)染色是亚文化的负面在3周后成纤维细胞(11),没有发现阳性细胞在消极的控制,如图4

4.2。细胞形态学观察

细胞培养2周后,在显微镜下观察细胞形态,如图5。(1)脂肪干细胞组,单一的梭状回,没有细胞重叠。(2)coculture组脂肪细胞+血管内皮细胞,细胞的数量增加,细胞生长在一个漩涡的形状,和形态多样化,主轴和多边形混合增长。主轴是更为常见,少数分布在一窝的形状。(3)脂肪干细胞+纤维母细胞coculture组细胞形态还简单,显示长轴形状和统一安排,胞体大于平均水平,没有细胞融合质量。(4)coculture组脂肪干细胞+血管内皮细胞+成纤维细胞,细胞的数量逐渐增加,大多数的细胞失去纺锤形状,成为大型和多边形形状,一些细胞融合成块和分布式像巢。

4.3。生长曲线

脂肪干细胞的吸光度值每组由CCK-8测量,并绘制生长曲线。每组的细胞生长曲线相似,与吸光度值逐渐增加。统计单向方差分析被用于对比组,和一个测试是用于成对比较每组的吸光度值。没有统计学意义的差异组1(天 ),而其他群体之间两两比较有显著意义( )。3天,没有显著区别脂肪干细胞组和脂肪干细胞+纤维母细胞coculture集团( )。天3,5,7,9,脂肪干细胞的OD值+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture组显著高于其它三组,和脂肪干细胞的OD值+血管内皮细胞coculture组高于脂肪干细胞+纤维母细胞coculture组,有统计学意义( ),如图6。

4.4。茜素红、碱性磷酸酶染色的结果

(1)茜素红染色分析细胞在每组:7天,每组细胞表现出负面的反应。14天,数量非常小的红色阳性细胞出现在混合文化团体。21天,红阳性细胞数量的增加在混合文化团体,特别是在coculture组脂肪干细胞+血管内皮细胞+成纤维细胞。28天,所有的细胞都在每组红色阳性细胞和脂肪干细胞+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture组最红焦,而脂肪干细胞+血管内皮细胞coculture纤维母细胞和脂肪干细胞+ coculture组少,脂肪干细胞组是最少的,如图7。(2)每组细胞碱性磷酸酶染色分析:7天,阳性颗粒出现在所有组除脂肪干细胞群,和最积极的粒子出现在脂肪干细胞+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture组。14天,红色正粒子出现在所有组,更明显的脂肪干细胞+纤维母细胞coculture集团和脂肪干细胞+ +纤维母细胞coculture组血管内皮细胞。21天,红色的正粒子数量的增加在混合文化团体,特别是在coculture组脂肪干细胞+血管内皮细胞+成纤维细胞。28天,除了脂肪干细胞组不明显,其余的组织细胞有明显的积极的粒子,红色的脂肪干细胞+纤维母细胞组训练,脂肪细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞组训练,大多数脂肪干细胞+内皮细胞coculture集团,脂肪干细胞组,如图8

4.5。免疫印迹检测骨形成蛋白2的表达

骨形成蛋白2表达的脂肪干细胞每组和更明显的脂肪干细胞+纤维母细胞coculture集团和脂肪干细胞+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture组,如图9。没有统计上的显著差异之间的脂肪干细胞组和脂肪干细胞+血管内皮细胞coculture集团( ),而其他组之间有统计上的显著差异( ),如图10。

5。讨论

组织工程包括三个关键因素,组织材料,和生长因子。科学研究的重点之一,中国农业科学理想的细胞产品应该有良好的生物功能,如细胞活动,工厂,生产,和合成[12];间充质干细胞与多向乐队的性质和特点都进行了广泛的研究12]。虽然间充质干细胞主要分布于骨髓和脐带血,他们在外周血非常低,有抑制作用(13]。当长大了,成纤维细胞存在于人体的各个组织,可以轻松快速地获得。他们可以自体移植,可以是巨大的3]。的间质表型。他们是相似的在细胞形态和发展,成纤维细胞有细胞特征,他们没有:骨细胞,骨钙蛋白、骨形态形成蛋白II型物质粒子,和phosphatase-free表达成骨细胞标记(2]。因此,成纤维细胞逐渐成为首选的种子细胞模型组织的研究。

coculture成纤维细胞和干细胞可以通过分泌促进干细胞增殖和诱导分化成纤维细胞因子和参与MAPK-mediated信号通路(14]。近年来,纤维母细胞生长因子被认为是在增长和发展起到关键作用的骨骼系统和骨折愈合15]。已发现至少23相关因素,包括纤维母细胞生长因子2,纤维母细胞生长因子8日18纤维母细胞生长因子、成纤维细胞生长因子21。纤维母细胞生长因子结合到细胞表面的纤维母细胞生长因子受体诱导受体激活细胞信号通路如erK1/2和物,调节目标基因转录,促进成骨分化。体外和体内的研究已经证实,纤维母细胞生长因子2还可以促进细胞通过促进骨生成β连环蛋白表达和核积累(16]。不同类型的纤维母细胞生长因子在不同的细胞有不同的影响。信号通路如ERK和物也参与纤维母细胞生长因子和骨形成蛋白之间的相互作用,这对骨生成产生影响(17]。在这项研究中,成纤维细胞被选为种子细胞,和coculture系统确认他们有一定的论述对脂肪干细胞的影响。在这项研究中,骨钙素和骨形态形成蛋白被用来评估骨形成的性能。成骨细胞骨钙素是最典型的分泌,外观可以直接标志着成熟的成骨细胞和被认为是一个先进的成骨细胞表型分化特征(18]。免疫印迹可以用来检测骨形成蛋白2的表达(19]。骨形态发生蛋白2 (BMP - 2)是一种骨形成促进剂和转化生长因子β总科的一员(20.]。骨形成蛋白2可促进骨钙素和碱性磷酸酶的表达,促进骨桥蛋白的合成,骨钙素,I型胶原蛋白和细胞外基质的矿化21,22),从而促进成骨细胞和成熟成骨细胞增殖,分化和诱导新骨形成体内和体外23]。

近年来,单细胞组织工程的建设不能满足模拟要求的组织结构和生理效应,保持组织稳定和活力24]。特别是在缺乏维管组织建设,良好的血液供应是治疗成功的关键组织工程(25]。不仅需要一个良好的血液供应,但也存在不同的细胞成分(26]。越来越多的研究人员倾向于使用多单元的文化构建种子细胞系统(6]。当研究多单元的coculture系统,直接和间接coculture方法用于组织工程、和coculture不同细胞之间的相互作用的特点,提出coculture系统是由各种细胞类型和信号转导细胞的交互行为(27]。coculture系统的成纤维细胞,血管内皮细胞,脂肪干细胞,由成纤维细胞和血管内皮细胞分泌的细胞因子相互作用促进脂肪干细胞的增殖和成骨分化28]。血管内皮生长因子之间的串扰和骨形态形成蛋白6信号通路提高成骨分化的间充质干细胞(29日]。coculture细胞外基质、成纤维细胞具有更高潜力促进间充质干细胞分化为血管平滑肌细胞(30.]。大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化潜力高膜显示基本成纤维细胞生长因子的诱导下,可以增加转化生长因子的表达水平β1阶段的后期骨(31日]。的三维coculture bmsc转染与碱性纤维母细胞生长因子和韧带成纤维细胞可以促进bmsc的扩散和增强其分化成韧带成纤维细胞的能力。先前的研究已经证实,血管内皮细胞的结合文化和脂肪干细胞能有效促进脂肪干细胞的增殖和成骨分化(32]。然而,正常骨组织包含大量的成纤维细胞,具有良好的增殖和分化特性,胶原蛋白的分泌和合成功能,包含各种监管纤维母细胞生长因子(33]。在coculture系统中,由血管内皮细胞和成纤维细胞分泌的细胞因子可以提供微环境对脂肪干细胞的增殖和分化,因为骨形成protein-2的联合行动,血管内皮生长因子,和纤维母细胞生长因子,促进成骨细胞的生成和分化(34- - - - - -37]。本研究建立了一个coculture系统的成纤维细胞,脂肪干细胞和血管内皮细胞,发现三个有一定的coculture对脂肪细胞的增殖和成骨分化的影响。

6。结论

总之,脂肪干细胞+血管内皮细胞+纤维母细胞coculture组最强的能力,促进脂肪干细胞的增殖和分化成成骨细胞迅速和有效。的coculture脂肪干细胞与血管内皮细胞和成纤维细胞有巨大的研究潜力。在未来的研究中,它可以被认为是为组织工程提供种子细胞,为组织工程提供一个新的想法来构建生物支架修复骨缺损。然而,影响细胞增殖和分化的因素在coculture系统和调控机制目前还不清楚,所以三种细胞的交互因素coculture系统可以在未来的学习。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的一般项目联合应用基础研究专项基金的云南省科学技术厅和昆明医科大学(201701 uh00095)。