文摘
背景:等温信号放大技术是开发基于循环DNA分子的滚环放大机制。这种技术发挥了极其有益的作用在淋病病原体识别和耐药基因检测。的目标是:本研究分析了等温信号放大技术在淋病的病因诊断和耐药基因检测。材料和方法:尿道、宫颈分泌物或前列腺液样本322例淋病收集从2018年1月至2021年12月在我们医院的性病诊所皮肤科被选为直接涂片检查和淋球菌的文化考试;DNA提取尿道、宫颈分泌物或前列腺液样本,然后用于病原体坐在鉴定试验和滚动循环核酸扩增技术,涂片检查和病原体文化考试方法,坐化验,等温比较敏感性和特异性分析的信号放大技术。结果:淋病积极性最高的尿液滚动循环核酸扩增技术,紧随其后的是拖把滚动循环核酸扩增技术,以及淋病的最低积极性的尿液测试。两者之间的积极性率的差异尿液测试方法是统计学意义( )。最高灵敏度的尿液滚动循环核酸扩增技术方法检测淋病病原体和尿液坐在方法的灵敏度最低的是统计学意义( )。敏感性和特异性的差异之间的滚动循环核酸扩增技术和擦洗擦洗坐在方法没有统计学意义( )。ROC曲线被绘制基于敏感性和特异性,与拭子坐在试验( )>滚动循环核酸扩增技术( )。比较消极的尿液和棉签滚动循环核酸扩增技术和尿液化验坐下时,差异没有统计学意义( )。结论:等温信号放大技术改善的缺点淋病病原体识别手段和耐药基因检测方法,具有良好的检测灵敏度和特异性,操作简单,价格低廉,容易推广,具有明显的优势在临床应用和流行病学研究。
1。介绍
淋病患者很难诊断特异性的症状,尤其是妇女和儿童等特殊人群和可能引起的并发症等公共卫生问题,如上游内部生殖系统感染导致不孕和慢性炎症,严重威胁人类生命和健康(1]。研究实验诊断、临床治疗、流行病学这疾病近年来已获得了高度的关注2]。在淋病的诊断,直接涂片检查现在常用的在临床实践中,除了在男性急性尿道炎,尿道分泌物抽样积极性率可以达到95%3]。其他病变和女性患者积极率低,难以识别不同菌株与脑膜炎(4]。淋球菌的文化测试是临床诊断的金标准,但它也受到材料的收集和对抗生素耐药率的过敏症在培养基中,测试周期长,费时,费力,无症状的检出率很低,恢复患者(5]。样品的纯度是必需的(6]。因此,它仍然是迫切需要找到并查明相关抗性基因,研究耐药的机制,研究耐药菌株的流行病学特征7]。
等温信号放大技术是一种新开发的分子生物学技术基于环状DNA分子的放大机制在自然循环滚动,滚动循环特征的事实只能复制单链封闭状态与相应的引物的存在在一个恒温的滚动8]。等温信号放大技术是非常具体的,需要低样品纯度;如果样品不包含目标序列检测,不能循环,循环调查和放大的反应不会发生9]。支链放大效应可以提高检测的敏感性变异分子大约10册,及其灵敏度非常高,这种技术是极其有利的淋病病原菌的鉴定和耐药基因的检测10]。因此,我们研究的成功实现一定会改变现状的淋病诊断和治疗,具有良好的市场需求和前景。
2。材料和方法
2.1。研究对象
322名患者的数据承认我们医院的皮肤病与性病诊所进行了分析,其中包括201名男性和121名女性,年龄 岁了。入选标准如下:门诊病人怀疑有尿道感染和本研究的知情同意。排除标准如下:例院前抗菌治疗。总共322份尿路,宫颈分泌物,或收集前列腺液直接涂片和淋球菌文化,从尿道中提取DNA,宫颈分泌物或前列腺液,利用SAT测试和滚动循环核酸扩增技术确定病原菌。上面的涂片检查的敏感性和特异性和病原体文化考试方法,坐在检测,和等温信号放大技术进行比较和分析建立一个准确、快速、高效淋病病原体的识别方法;比较和客观地评价等温信号放大技术的优点和缺点在淋病奈瑟氏菌耐药基因的检测;并打下坚实的基础为淋病治疗方案的优化和后续研究耐药机制。所有患者纳入本研究参与了这项研究。
2.2。方法
仪器和试剂如下:淋球菌的分离培养基从珠海Yinke购买医疗工程有限公司引物由上海建筑渲染合成生物工程有限公司,由上海岛有限公司和RNA探针合成制药技术有限公司
样本收集如下:所有临床试验标本收集从我们医院门诊。(1)培养法样本如下:2 - 4厘米的尿道分泌物(尿道拭子)的男性患者和0.5 - 1厘米内宫颈粘液的孔(宫颈拭子)的女性患者收集无菌棉签和立即接种淋球菌的选择性培养基(线性调频,孵化35°C 5%二氧化碳孵化器48 h)。轮,提高了,潮湿、淋球菌的半透明,或浅灰色的颜色特征。氧化酶试验阳性和革兰氏染色阴性双球菌被确定为淋球菌的积极。坐在方法(2)标本,标本不是前2 h内收集撒尿,第一个尿样约1毫升是收集和保存与l毫升尿液混合解决方案工具包中提供的()获得尿液样本,这是冻结在−70°C。
Sothermal信号放大技术检测方法:样本提取DNA,然后用大约80基地一个单链寡核苷酸探针设计,和探针序列是完全互补序列的基因被检测出来。较低的环境中盐离子和ATP水平,T4的RNA连接酶结合兴趣;预定设计引物模板复制滚动循环形成一个滚动循环链;另一个引物放大了单链产品绑定后滚环,和放大是另一轮扩增引物的模板序列;最终产品的反应是dsDNA各种长度的变形。放大流程图如图1。
根据设备指令,400μl与100年的样本μl的核酸提取的解决方案,让它在一个恒定的温度60°C 5分钟,然后让它在室温下10分钟,然后把它变成一个半自动提取的核酸提取器。核酸RNA提取完成后,添加30 l的放大试验解决方案(包括磁珠)微量反应管,prewarm 42°C,并生成100 - 1000与RNA RNA复制起始模板。每个RNA复制然后再放大和转移到photocycliometer 480荧光定量PCR仪器初始化反应过程。PCR仪器开始反应程序。反应过程如下:Carboxyfluorescein被选为荧光标记,42°C 1分钟,40周期;荧光信号每分钟收集一次,总共40倍。
2.3。统计分析
所有我们的研究计算的统计数据统计软件SPSS 25.0处理。测量数据被表示为平均值±标准偏差( )使用独立的样本 - - - - - -测试和计数数据表示为使用卡方检验整个数字或百分比。包括数据描述(QR)如果他们不符合正态分布。所有统计测试是双面的概率测试的统计学意义 。
3所示。结果
3.1。检测感染的不同的方法
322名患者尿液和取样检测淋病使用坐和环形材核酸扩增技术,分别。最高的淋病的积极性得到了尿液滚动循环核酸扩增技术,紧随其后的是拖把滚动循环核酸扩增技术,以及淋病的最低水平的积极性得到尿液测试。两者之间的积极性率的差异尿液化验是统计学意义( ),同时积极率之间的差异两个拖把化验没有统计学意义( )(见图2)。
(一)
(b)
3.2。评估测试方法
尿液的敏感性滚动循环核酸扩增技术方法是最高的,和尿液坐法的敏感性最低,具有统计上的显著差异( );特异性是相反的,相比具有统计上的显著差异( )。敏感性和特异性的差异之间的拭子滚动循环核酸扩增技术方法和拭子坐在方法没有统计学意义( )。敏感性和特异性的差异之间的尿滚动循环核酸扩增技术方法和棉签滚动循环核酸扩增技术方法在统计学上没有显著意义( )(见图3)。
(一)
(b)
3.3。敏感性和特异性分析
ROC曲线被绘制根据敏感性和特异性,并拭子坐在试验( )>滚动循环核酸扩增技术( ),与温和的诊断精度高的上述分析(见图4)。
3.4。评估预后的周转速度
没有显著差异的负面转化率尿液和棉签滚动循环核酸扩增技术和尿液检测( )(见图5)。
4所示。讨论
淋病的早期发现疾病控制很重要,但目前淋球菌的测试主要是收集泌尿生殖器的分泌物标本,这可能导致痛苦的抽样和减少病人的意愿进行测试(11]。此外,敏感性和特异性也存在不足之处。男性淋球菌尿道炎患者通常有更多的尿道口脓在疾病的发作,和积极的样品可以在尿道口或检测到更多的肤浅的尿道(12]。相比之下,尿道分泌物可能在病程长的患者少或没有,这很容易导致错过了检测,因此积极的淋球菌的检测率通常是低在病程长的患者13]。坐是一个非侵入性的测试,可以检测泌尿生殖器的分泌物和尿液标本,并收集尿液标本的主题测试不仅可以减少病人的痛苦,还可以减少临床医生的工作负载(14]。淋病的识别病原体,分泌物涂片,病原菌文化,通常用于临床实践(15]。直接涂片检查有限采样和低积极率为损伤其他比男性急性尿道炎分泌物和困难识别不同菌株的脑膜炎(16]。坐法很容易污染和假阳性,需要样品纯度高。耐药基因检测,虽然基因测序被公认为一个精确的和敏感的检测方法,其实验要求高和昂贵的,和长周期时间是不适合临床研究,特别是流行病学调查(17]。等温信号放大技术是一种新开发的分子生物学技术基于环状DNA分子的放大机制,基于这样一个事实:滚动循环只能复制单链封闭状态与相应的引物的存在在一个恒温的滚动18]。等温信号放大技术是非常具体的,需要样品纯度较低,而其支链放大效应可以提高检测的敏感性变异分子大约10册,使它非常敏感(19]。这种技术是非常有利于淋病病原体的识别与当前使用的临床识别和检测技术。耐药基因检测,等温信号放大技术也非常具体和敏感,但与基因测序相比,它是便宜的,实验条件要求低,相对较短的周期时间,容易促进临床[20.]。
最高的淋病积极性在我们的研究中是尿液滚动循环核酸扩增技术,紧随其后的是拖把滚动循环核酸扩增技术,以及淋病的最低积极性的尿液测试。尿液滚动循环核酸扩增技术方法灵敏度最高,和尿液坐法检测的灵敏度最低淋病病原菌。基于敏感性和特异性,拭子坐在分析>滚动循环核酸扩增技术。文化方法长久以来的黄金标准检测,但它不是有利于淋病病原菌的快速检测和早期诊断由于恶劣的文化条件,孵化时间长,容易隔离的死亡21]。因此,nonculture方法现在越来越多地用于淋病的诊断病原体。其中,等温信号放大是一种新的核酸检测技术相结合的新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术(22]。双链DNA的基本原则是目标核酸的复制(RNA)是第一个由M-MLV逆转录酶在同一温度,然后生成多个RNA副本从这个DNA复制使用T7 RNA polymutase [23]。每个RNA复制然后进入下一个放大周期从反转录,而用荧光标记探针具体结合这些RNA复制产生荧光,可以捕获在实时荧光检测仪器实时反映放大周期(24]。这种方法具有高灵敏度、高特异性、低污染、稳定的反应。可能的原因是,一方面,坐在测定的低效率使用传统的煮沸裂解法核酸提取,再加上大量的坐在尿液成分,测定反应抑制剂导致的不敏感性坐化验尿液和影响核酸扩增(25]。相比之下,分离培养法,这是淋病病原菌的诊断的金标准,对环境有很高的要求,收集和运输的标本,也会导致错过检测由于抗生素使用和病原微生物的失活后接种(26]。另一方面,等温信号放大技术方法使用提取核酸的磁珠法反应体系中加入竞争的内部标准,从而增加检测的敏感性反应(27]。此外,从中华民国曲线、拭子等温信号放大技术方法和尿液等温信号放大技术方法有中度到高AUC和具有较高的诊断价值28]。和尿液等温之间的敏感性和特异性的差异信号放大技术方法和棉签等温信号放大技术方法未达到统计上的显著水平,表明这两个等温信号放大技术方法可以用尿道分泌物和尿液样本进行测试和作为非侵入性采样,避免尿液拭子采样的尴尬和痛苦的男性患者(29日]。因此,拒绝或尿道拭子取样困难在男性患者中,保留尿标本进行检查可以考虑根据实际情况,但首先空心尿必须明确定义的概念的时候保留尿标本,即。,尿潴留的时间必须至少从去年空心尿2 h,它必须30毫升尿液的第一段(30.]。这将确保准确和可靠的测试结果。总的来说,等温信号放大技术可以排除假阳性致命的病原体引起的,治疗后患者的病灶和RNA在致命的病原体的快速降解,促进疗效的观察和判断治疗后治疗和避免过度治疗,从而减少病人的负担(31日]。
总之,等温信号放大技术提高了淋病病原体识别手段和耐药基因的缺陷检测方法,检测灵敏度和特异性好,操作简单,是廉价和容易推广,具有明显的优势在临床应用和流行病学研究。
数据可用性
使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究得到了武汉市卫生委员会WX14D01科研项目。