文摘

背景。相关研究发现,变应性鼻炎(AR)可能与鼻菌群的失衡。因此,如果AR患者的鼻植物,可以迅速地发现具有重要意义,研究AR患者鼻植物的分布规律,并探索其与基于“增大化现实”技术的相关性。客观的。设计一个新的和方便nano-DNA传感器快速筛查鼻菌群在过敏性鼻炎(AR)患者中,以基于“增大化现实”技术的预防和治疗提供实验依据。方法。我们创建一个名为Nano-TiO的DNA合成纳米生物传感器₂DNA传感器,可以结合样本鼻粘膜或分泌效率高和检测某些植物原位提取DNA或RNA序列。在一个物理性质测试,首先,我们测试了渗透率、溶解度和存储温度nano-TiO₂,以Nano-TiO的合成提供了实验依据₂dna传感器。随后,Nano-TiO的渗透率₂dna传感器在金黄色葡萄球菌进一步测试。在临床实验中,我们选择60 AR患者在我们医院从2020年9月到2021年9月AR组和60名健康人群接受体检的同时,对照组。的Nano-TiO₂dna传感器是用来检测典型AR患者鼻植物,和皮尔逊相关分析被用来探索与血清IgE鼻植物之间的相关性和嗜酸性粒细胞。结果。至于物理化学特征,这个传感器可以直接渗透到某些细菌和特别。高亲和能力与目标,结合可以发现荧光定性、定量评估释放。它可以存储在酒精稳定−20°C。通过这个传感器,我们已经成功地检测到金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯菌,草绿色链球菌AR患者与健康人群相比,这将帮助这些患者在预防急性鼻窦炎,急性或亚急性肺炎。此外,我们发现变形最强烈的正相关与基于“增大化现实”技术而放线菌最大的负相关。结论。的Nano-TiO₂dna传感器将帮助一个门诊医生更快速筛选特定鼻AR患者的菌群,提高AR-related并发症的预防。

1。介绍

过敏性鼻炎是一种全球健康的疾病,对人们的社会工作有深远的影响,日常生活中,和学校活动,虽然没有导致严重后遗症和死亡(1]。基于“增大化现实”技术的全球发病率约10%的成年人和40%的儿童(2]。基于“增大化现实”技术的典型特点是代鼻粘膜IgE介导的,与高水平的嗜酸性粒细胞。没有有效的预防和根治方法目前,许多基于“增大化现实”技术的患者,尤其是儿童,只能避免或减轻阻塞,松软,发痒的鼻子,避免过敏原(3,4]。

基于“增大化现实”技术与许多因素有关,如不规则的工作和休息,健康的饮食,和滥用或过度使用抗生素,使鼻粘膜变得更加容易和频繁接触外来微生物和抗原(5,6]。事实证明,微生物被视为必要组成部分在基于“增大化现实”技术的出现7]。微生物菌丛失衡的鼻粘膜可以影响免疫系统,使免疫反应的发展不平衡,这很容易引发AR在某种程度上(8,9]。一些研究证明,超级抗原从细菌能够触发高水平的IgE这些超级抗原作为气道炎症因素hyperreaction [10,11]。此外,基于“增大化现实”技术的患者往往有急性鼻感染如急性鼻窦炎鼻粘膜因为破碎带来的是更容易受到细菌的免疫防御活动或T cell-involved炎症反应(12- - - - - -14]。因此,鼻植物为基于“增大化现实”技术的检测和分析帮助诊断以及预防并发症。

目前,常用的细菌检测方法在临床上主要包括涂片检测、细菌培养、血清学检测、细菌核酸检测,和第二代测序,在这项研究中扮演着重要角色的鼻AR患者的菌群分布,但也有一些不足之处。例如,细菌培养一般需要3天,甚至和特殊的植物需要一个星期,这不能满足早期诊断的需要。特异性血清学抗体检测相对较差,容易出现假阳性或假阴性结果。此外,第二代测序技术和PCR扩增可以通过几乎所有的异常在鼻粘膜菌群分布细节通过其高通量检测过程(15,16],但是它比较昂贵和耗时,促进一些快速筛查。因此,更方便和更便宜的快速筛查鼻植物所需的技术无疑会帮助医生了解鼻植物分布在AR患者尽快。在这里,我们创建一个名为Nano-TiO的DNA合成纳米生物传感器₂DNA传感器,可以结合效率高和样品检测某些植物原位提取DNA或RNA序列。通过这种方法,我们可以很容易地检测已知的植物通过观察和量化的释放荧光生物传感器。到目前为止,我们知道,很少有临床研究使用nano-DNA植物的具体检测传感器,和这种技术的出现会带来新的变化的快速检测微生物菌群。

2。材料和方法

2.1。Nano-TiO₂准备和物理化学性质测试

TiO₂纳米颗粒(美国密苏里州13463-67-7,Sigma-Aldrich)准备。这些粒子被用作向量来提高nano-DNA的渗透能力,在这里,我们首先包装颗粒和细菌测试其结合能力。因此,我们首先测试它的绑定能力与细菌耦合异硫氰酸荧光素(FITC)。TiO的₂-FITC与金黄色葡萄球菌混合(美国马萨诸塞州ATCC25923热费希尔科学)由MycoLightRed染色(美国AAT-B22413, AAT Bioquest, CA)。其次,我们需要一个合适的媒介把设计DNA传感器与最大溶解度和一个稳定的储存温度。所以,我们TiO溶解₂-FITC在不同的介质包括蒸馏水,磷酸盐(PBS)、甲醇、乙醇、甲酸和测试沉淀TiO的荧光堕胎₂-FITC站24 h后远离光线。确认后的最佳媒介,溶解TiO₂-FITC在不同级别的存储温度包括−80°C,−20°C, 4°C, 37°C, 58°C,和另一个24小时98°C,和沉淀TiO₂通过荧光堕胎-FITC再次测试。共焦显微镜(SP8徕卡,位于德国)申请荧光图像观察,和SpectraMax (i3X、分子器件、钙、美国)用于荧光定量分析。

2.2。Nano-TiO₂dna传感器结构

首先,纳米DNA设计了以下步骤:(1)两个独立的葡萄球菌aureus-related寡核苷酸的设计。(2)FITC-labeled信标合并在寡核苷酸通过搅拌30分钟60°C,在4°C冷却5分钟。(3)一个荧光-停止信标标签是在对面的寡核苷酸组装孵化后37°C 2 h和60°C 5分钟与甘油的混合物形成的寡核苷酸的关键部分将绑定到目标的候选序列细菌为环形结构,它将停止释放荧光。然后,TiO₂粒子与nano-DNA共轭搅拌混合后37°C 12 h在硼酸缓冲和删除自由nano-DNA通过在3000转离心5分钟。Dioleoyl-trimethy-lammonium-propane (DOTMA, 132172-61-3, Sigma-Aldrich) TiO周围的涂层₂dna来增强样品减少免疫排斥反应的生物相容性,用蒸馏水洗传感器三次在4°C和存储供以后使用(图1)。其他flora-related传感器将建造在必要时按照以上方案。

2.3。Nano-TiO₂dna传感器渗透测试

纯nano-DNA传感器和nano-TiO₂dna传感器分别与金黄色葡萄球菌混合比较渗透能力。反应过程为1分钟95°C, 62°C 3分钟,5分钟72°C。因此,荧光强度是由荧光显微法检测10分钟后(BX51、奥林巴斯、东京、日本)。这个传感器是设计用来快速观察,不再需要等待一分钟。此外,荧光强度检测每12 h和执行持续了72 h测试荧光稳定性。

2.4。临床AR患者包容和传统鼻菌群检测

60 AR患者以及相同数量的健康人群进行健康检查包括在我们医院,所有衰老从5到65年。对于AR患者,血清IgE和嗜酸性粒细胞百分比从血液进行评估和相关数据收集从临床实验室。所有患者参与本研究自愿签署知情同意,批准的研究是医学伦理协会的大学。我们计划创建一个快速方法确认共同的或典型的AR患者鼻植物,在这里,我们需要执行传统的鼻植物检查,证实了这些典型的分布范围。因此,鼻分泌物收集从AR患者和控制人。后总DNA提取(magmax - 96™DNA多示例包,4413021,热费希尔科学、美国),16 s rRNA引物在V1和V2地区包括27个f - 338 r用于PCR扩增。 double-terminal PCR测序产品都使用了Hiseq第二代高通量测序平台(Illumina公司)。

2.5。Nano-TiO₂dna传感器检测AR患者鼻在典型的植物

确认后典型的鼻植物在AR患者中,我们选择了前三种植物分别AR患者和健康人群作为目标进行测试。在执行测试之前,某些特定的传感器相关分布范围将合成基于相同的协议之上,然后混合的样本来自患者和健康人鼻分泌物的基于“增大化现实”技术的迅速。10分钟后可以评估结果,阳性结果是否符合传统的鼻植物日期是已知的。

2.6。相关分析鼻菌群IgE和嗜酸性粒细胞

支持通过DNA传感器和测试结果为AR预测提供一些有用的信息,我们进一步分析了相关的鼻植物IgE和嗜酸性粒细胞,为了获得最相关的和基于“增大化现实”技术的植物。

2.7。统计分析

采用SPSS 22.0和MedCalc软件统计分析。描述的定量数据(%),被量化数据 。一个 - - - - - -试验采用组间比较。皮尔森相关分析是用来检测鼻植物之间的相关性IgE和嗜酸性粒细胞。 代表显著的区别。

3所示。结果

3.1。TiO的渗透测试和物理化学特征₂

当我们选择TiO₂的向量来提高传感器的渗透能力,在这里,我们测试它的渗透植物区系的特征。显然,TiO₂可以直接渗透到金黄色葡萄球菌(数据2(一)2 (i)),提出了一个好的colocalization金黄色葡萄球菌共焦图像。此外,我们测试TiO的溶解度₂在一些候选人媒体和发现酒精溶解TiO的最佳媒介₂解决方案后,最少的沉积物站在24 h(图2(j))。此外,TiO₂有最好的稳定状态被存储在−80°C和−20°C,所以构建传感器可以存储在−20°C维持稳定(数据吗2(k) 2 (n))。

3.2。比较Nano-DNA传感器和Nano-TiO渗透能力₂dna传感器

尽管我们可以合成纯纳米DNA,这是无法渗透效率高的植物;因此,我们打包TiO₂和外DOTMA DNA传感器Nano-TiO₂dna传感器,基于TiO的更好的渗透能力₂DOTMA和良好的生物相容性。这是证明了TiO₂DNA传感器有更好的渗透能力比纯DNA传感器(数字3(一)3 (f)),它可以在目标植物的呆只要60 h(图3(g))。

3.3。临床资料和常规鼻AR患者的菌群分析

在这里,我们提出了基于“增大化现实”技术的患者的年龄分布和控制患者无显著差异(图4(一)(图)和性别比例的基于“增大化现实”技术的病人4 (b))。包括AR患者血清IgE的更高的层次(图4 (c))和嗜酸性粒细胞比例(图4 (d))。确认我们的设计传感器的敏感性和特异性,我们首先分析了鼻植物类别包括AR患者的传统测序方法和发现一些相当高的植物在AR组患者,其中前三种植物金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯菌,草绿色链球菌,而Coagulase-negative葡萄球菌,棒状杆菌属,丙酸菌属曼秀雷敦是健康人的前三名(图4 (e))。因此,我们测试了这些分布范围由我们设计传感器确认可用性的快速筛查。

3.4。TiO₂dna传感器的快速筛查前鼻植物AR患者和健康人

这里,我们应用TiO而设计的₂dna传感器有单独的序列信息对各类植物快速测试鼻腔粘膜样本AR患者和健康人。传统测序方法一致的结果,我们的传感器可以检测到Coagulase-negative葡萄球菌(图5(一)),棒状杆菌属(图5和(b))丙酸菌属曼秀雷敦(图5(c))和更高的荧光但很少数量的金黄色葡萄球菌(图5(d)),肺炎克雷伯菌(图5(e))草绿色链球菌(图5(f))在健康人AR患者提出了完全相反的结果(数据5(g) 5 (l))。因此,我们的传感器能够被用于快速筛查鼻植物在AR患者更高的灵敏度和效率。

3.5。相关分析鼻菌群IgE和嗜酸性粒细胞

接下来,我们分析了上述相关鼻植物IgE水平和嗜酸性粒细胞,旨在找到一些线索为更好的预防和治疗AR。最后,我们发现变形最强烈的正相关与基于“增大化现实”技术而放线菌最大的负相关,如表所示1和图6。

4所示。讨论

在这项研究中,我们关注的是在AR患者鼻腔植物这些证据将有助于基于“增大化现实”技术的诊断和预防并发症引起的基于“增大化现实”技术(17- - - - - -19]。快速屏幕鼻在鼻粘膜菌群,这将提供更多方便门诊医生,我们开发一种新方法,这是鼻粘膜菌群Nano-TiO原位检测₂dna传感器。这种纳米合成DNA的工作原理是“开启和关闭”过程的荧光灯塔。在预备考试的情况下,荧光信标被停止沉默后形成一个圆在DNA序列结构。这个沉默的结构没有荧光,所以我们不能发现任何信号之前与样品混合传感器。在测试过程中,生物传感器将混合样品和发现他们的互补序列在一定反应条件下如果他们存在。在这个过程中,环形结构将打开了,沉默的荧光将再次发布。因此,如果存在某种植物的鼻样本,我们可以检测荧光信号,荧光强度反映了某些目标的数量。因此,我们可以确定某些植物定性和定量。

这种传感器具有以下优势。首先,这个传感器是非常容易使用。它可以掉在样本收集鼻粘膜表面的直接和简单的反应温度下循环没有DNA提取、PCR过程,并测序。因此,传感器检测方法可以实现一个门诊部门的助理没有发送临床实验室甚至第三方检验公司。这将节省工作时间为医生和病人显然省钱。第二,结果是容易。读出的荧光信号,所以它是容易的判断没有太多的假阳性或假阴性结果。

通过这个传感器,我们成功地检测一些高水平的植物在AR患者包括金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌,草绿色链球菌。Yoo et al。20.应用一个nano-TiO₂生物传感器的检测大肠杆菌,有效地改善了目标和大肠杆菌检测的特异性,与本研究结果一致。据我们所知,上述组成中发现AR患者有很多相关的身体包括急性鼻窦炎,急性或亚急性感染肺炎,所以我们猜测这可能是一个解释为什么一些基于“增大化现实”技术的专利会从这两种传染病21,22]。相关分析也给出了强有力的证据,这些组成与疾病的联系。因此,由我们设计的生物传感器,我们可以快速预测发生鼻窦炎,急性或亚急性肺炎和给建议病人在相对预防。然而,存在明显的短缺传感器应用程序;,这些传感器的设计是基于已知的不正常菌群在鼻子,这是证实了传统测序技术。就像被显示在我们的论文,我们首先利用传统的序列第二代技术筛选相对正常菌群在AR患者中,与植物健康的人。清楚地识别植物的信息后,我们可以设计相应的植物根据已知的引物序列。因此,这些纳米合成DNA无法检测未知的人口,和上下检查是不可用的。最好的使用应该快速筛查已知的植物。理解这种短缺将帮助我们确定何时使用方法在诊所。

本研究主要讨论了纳米传感器的灵敏度的检测典型的鼻植物,但样本量相对较小,和AR的发病机理引起的植物不是研究,后续研究中应该改进。

5。结论

在这项研究中,我们开发了一个名为TiO的DNA合成纳米₂dna传感器。这个传感器能够检测某些鼻植物原位快速没有DNA提取、PCR过程,传统的测序技术。我们已经成功地使用这种传感器来检测金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯菌,草绿色链球菌AR患者这将帮助这些患者在预防急性鼻窦炎,急性或亚急性肺炎。该方法将帮助一个门诊医生更快速筛选某些AR患者鼻植物和提高AR-related并发症的预防。

数据可用性

仿真实验数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。