文摘
废弃的骨质疏松症是一种骨质疏松症,一种常见的老年性疾病。神经系统疾病是主要的骨质疏松症的危险因素。虽然有许多研究废弃骨质疏松,遗传机制之间的关系在成骨细胞谷胱甘肽代谢和ferroptosis废弃骨质疏松症仍不清楚。本研究的目的是探索的关键基因和其他相关机制ferroptosis和谷胱甘肽代谢在成骨细胞分化和废弃骨质疏松症。通过加权基因coexpression网络分析(WGCNA),成骨细胞的过程在GSE30393 differentiation-related基因进行了研究。和相关功能通路被发现通过基因和基因组的京都百科全书(KEGG)路径分析。通过结合GSE1367和GSE100933关键基因,分别与谷胱甘肽代谢和ferroptosis所在地。这些关键基因的相关性由皮尔森相关系数进行了分析。GSTM1基因靶向受体激动剂谷胱甘肽(GSH)被连接地图城市规划机构(CMap)分析被用来干扰成型废弃的骨质疏松过程MC3T3-E1细胞。rt - pcr和细胞内活性氧(ROS)进行。 Two important pathways, glutathione metabolism and ferroptosis pathways, were found. GSTM1 and TFRC were thought as key genes in disuse osteoporosis osteoblasts with the two mechanisms. The two genes have a strong negative correlation. Our experiment results showed that the expression of TFRC was consistent with the negative correlation with the activation process of GSTM1. The strong relationship between the two genes was proved. Glutathione metabolism and ferroptosis are important in the normal differentiation of osteoblasts and the process of disuse osteoporosis. GSTM1 and TFRC were the key genes. The two genes interact with each other, which can be seen as a bridge between the two pathways. The two genes participate in the process of reducing ROS in disuse osteoporosis osteoblasts.
1。介绍
骨质疏松症是最常见的一种骨科疾病在全球范围内与年龄有关的神经紊乱是其主要危险因素(1]。停止使用骨质疏松症属于继发性骨质疏松症,这是主要由骨机械力的减少造成的。脊髓损伤,半身不遂,骨折,长期卧床休息,太空飞行的原因是不用骨质疏松症[2]。停止使用骨质疏松症的具体机制目前还不清楚。骨重建的过程是基于两个主要机制的动态平衡:osteoclast-related骨吸收和osteoblast-related骨形成,伴随着各种刺激体内和体外的影响(3]。机械应力刺激中扮演一个重要的角色在维持骨代谢的稳定和维持正常功能(4]。成骨细胞模拟微重力研究表明,50%的细胞将失去活力文化[6周后5]。这些表明,细胞死亡发生在成骨细胞是一个重要的致病机制,停止使用骨质疏松症。
细胞死亡是由多种机制引起的。包括自噬,细胞死亡模式pyroptosis,沃勒变性,会引起,ferroptosis [6- - - - - -8]。Ferroptosis nonapoptotic细胞死亡模式,明显不同于其他程序性细胞死亡(9]。的一般过程ferroptosis可以决定两个步骤:(1)转铁蛋白受体1传输循环铁细胞内部和(2)二价铁离子释放铁池属于溶酶体(10]。这种机制的远程原因通常是由于细胞内谷胱甘肽合成和代谢相关功能的下降,导致活性氧的过量11]。许多基因如TFRC、P53和GPX4已经被证明是参与ferroptosis[的发生和发展12- - - - - -15]。作为一种机制与细胞内的代谢有关,它吸引了广泛关注在各种免疫疾病、恶性肿瘤、骨质疏松症(16,17]。Ferroptosis不仅发生在骨质疏松症也影响骨髓间充质细胞的分化和发育。英足总互补群D2 (FANCD2)被证明减少铁和活性氧的积累在骨髓间充质细胞的分化18]。活性氧的增加将引起线粒体等细胞器的损伤和细胞死亡通过各种信号通路(19,20.]。因此,ferroptosis的过程可以被调节活性氧间接监管。作为一种抗氧化剂,谷胱甘肽可以通过谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽S-transferases发挥multiantagonistic作用[21]。在动物实验相关的肠外营养,增加谷胱甘肽被证明显著降低高氧化应激引起的各种器官这营养22]。与铁代谢,细胞内谷胱甘肽的浓度逐渐恢复,1运铁素的表达(Fpn-1)减少了使用1毫米apocynin SHSY5Y细胞(23]。
一些研究还集中在ferroptosis-related机制,发生在骨质疏松症。2型糖尿病患者往往伴随着骨质疏松症。高葡萄糖可以诱导ferroptosis MC3T3E1成骨细胞活性氧积累基金和消费细胞内谷胱甘肽。2型糖尿病骨质疏松症大鼠的骨组织,谷胱甘肽过氧化物酶的水平4视为ferroptosis标记是减少了,而它将恢复到相对正常水平后去铁胺干预(24]。这项研究表明FtMt基因的低表达导致hFOB1.19随后的亚铁离子积累细胞ROS / PINK1 /帕金通路。后继干预调节的基因表达的抑制ferroptosis和成骨的能力。这些结果显示针对特定基因的潜在价值规范ferroptosis过程。
废弃的骨质疏松症,很少有研究ferroptosis及其相关机制和生物标志物。最近的研究发现,DNA的upregulation methylation-related DNMT1和组蛋白methylation-related EHMT2基因会导致废弃的骨质疏松症(25]。基于GSE100933过去的研究发现,GSNAS1 SNHG12, EPB41LA4A-AS1可以被视为潜在的监管机构停止使用骨质疏松症(26]。谷胱甘肽和ferroptosis成骨细胞已被证明是重要的,而关键的监管和潜在相关基因仍然未知。我们的研究旨在探索谷胱甘肽和铁代谢通路之间的关系在正常成骨细胞和废弃骨质疏松造骨细胞。
在我们的研究中,我们发现谷胱甘肽的作用和铁代谢途径在成骨细胞的发展。然后,我们把两个废弃骨质疏松症数据集在一起,发现这两种机制发挥了重要作用在废弃的骨质疏松症的发生。最重要的相关调控基因,GSTM1基因和TFRC的两种机制被发现,有很强的相关性。在细胞实验中,谷胱甘肽添加检测其治疗效果和两个关键基因之间的关系。
2。材料和方法
2.1。数据收集
我们的整体工作流程如图1。三个数据集从GEO数据库下载。相关的基因表达谱GSE30393 MC3T3-E1从GEO数据库获得的细胞(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),包含12个样品,包括成骨细胞分化的不同阶段。GSE1367,有关2 t3 preosteoblasts,包含静态样本(对照组)和3微重力样本。另一个数据集,GSE100933,侧重于骨髓间充质干细胞,preosteoblasts的祖先。这个数据集包含四个样品在标准培养基培养在国际空间站(ISS)和其他三个样品在标准培养基培养。RStudio软件基于R语言首先被用来处理这些数据。基因芯片平台的三个数据集分别GPL3108(杜克大学微阵列设备操纵子鼠标益生元,2.0版),GPL6244 Illumina公司HumanWG-6 v3.0表达式,GPL1219 Amersham生物科学CodeLink联合装置我Bioarray鼠标。Ferroptosis-associated基因从FerrDb下载数据库(FerrDb (zhounan.org))。谷胱甘肽代谢pathway-related基因从大卫数据库下载。
2.2。数据集WGCNA分析
coexpression GSE30393网络是由WGCNA R包天,MC3T3-E1细胞的分化阶段。WGCNA R包是一个开源和R语言中广泛使用的方法,可用于建立公司表达网络(27]。15301个基因的基因表达数据在12个样本MC3T3-E1细胞不同分化阶段及其相应的差异化特点和分化阶段(天)引入R软件基本信息。首先,我们通过hclust集群这些样本的方法来检查集群程度和删除不好的离群值。随后,皮尔逊相关分析帮助我们评估基因对之间的关系。相似矩阵构造。这些准备工作后,WGCNA开始执行。最好的软阈值是选择集群中的基因coexpression模块确保独立是规模超过0.85,平均连通性接近0。动态树切割算法定义了模块通过削减组件集群的树枝,然后分配模块为可视化不同颜色。
2.3。筛选度
limma R包应用是基于经典的贝叶斯 - - - - - -测试。GSE100933数据集, 和 被认为是识别重要度的阈值。 和 GSE1367显著度的标准。热图和火山情节利用可视化的表达水平显著度。
2.4。度的功能途径分析
度从GSE10933和基因属于关键模块与官员利用G基因符号:档案网站(http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/convert)。KEGG通路的分析度进行的帮助下大卫数据库和Cytoscape软件。气泡图ggplot通过R包”。“Cluego插件单位Cytoscape软件被用来画路径之间的关系。
2.5。Ferroptosis相关基因和蛋白质网络(PPI)网络建设
从Ferrdb获得Ferroptosis-related基因数据库。Ferrdb数据库是世界上第一个总结ferroptosis相关基因司机、抑制和标记28]。通过使用Venn-related网站(画维恩图,结果(ugent.be)),我们可以分别获得ferroptosis-related之间的交叉基因基因和基因和GSE100933 GSE1367微分微分基因。字符串数据库被用来创建一个PPI网络。网络是进口Cytoscape软件。程度的这些基因网络的计算是通过插件cytoHubba(0.1版)(29日]。 被认为是重要的基因。选择的共同ferroptosis-related基因维恩的方法。关于两种机制的共同度从GSE100933 GSE1367被维恩选择方法。
2.6。选择谷胱甘肽代谢Pathway-Related度和PPI网络建设
谷胱甘肽代谢pathway-related基因从大卫获得数据库(https://david.ncifcrf.gov/)。维恩网站(画维恩图,结果(ugent.be))被用来使谷胱甘肽代谢pathway-related GSE100933度。然后,我们选择glutathione-related基因出现在两个数据集。网络建立完成后以同样的方式与前面的部分。
2.7。皮尔森相关分析
R包“ggpubr”是用于执行之间的皮尔逊相关分析glutathione-related基因和ferroptosis-related基因(30.]。 被认为是强烈的相关性。和值< 0.05被认为是具有统计学意义。
2.8。目标化合物的选择,提出分析
我们预测的目标化合物GSTM1基因和通过使用提出TFRC在线工具(http://broadinstitute.org/cmap)[31日]。这个数据集的工具可以预测受体激动剂或拮抗剂对一个特殊的基因。
2.9。PCR验证和ROS测试
MC3T3E1细胞获得CYAGEN公司。细胞培养中αmem培养基和正常孵化环境。试剂盒试剂用于提取总RNA,然后PrimeScript RT试剂盒有助于反转录。旋转式细胞培养系统(信用社)系统和外植公司被认为是有效的建筑废弃骨质疏松模型使用(32]。MC3T3-E1细胞首先培养的微载体表面。这些细胞在微载体转移在旋转式细胞培养系统(信用社)系统的速度为2天15 r / min。我们分别培养这些细胞与正常MEM和添加谷胱甘肽DMEM 5米。更换正常MEM和5米谷胱甘肽添加介质成型前已经完成。DCFH-DA探针(Sigma-Aldrich公司),可以发现通过共焦显微镜,用于观察MC3T3-E1细胞的活性氧。GraphPad棱镜软件和 - - - - - -测试被用来处理相应的数据。
2.10。统计方法
R包(版本操作)和GraphPad棱镜软件被用来执行统计分析。多个组合使用的统计分析分析度。 - - - - - -测试执行过程PCR数据。
3所示。结果
3.1。识别基因Coexpression模块
总在我们的研究中计算了15301个基因。层次聚类分析进行了R WGCNA包”。“确保无标度网络,我们选择最接近的值, ,软阈值显示在图2(一个)。显示的系统树图(图2 (b))表明,样品在这个数据集具有良好的聚类,和无意义的灰色模块不占据很大比例。从图2 (c),我们发现可以站的无标度拓扑是0.84。这意味着 是适合我们的分析。总筛选(图24个模块2 (d))。其中,黑色模块显示最强的正相关与天分化阶段。所以,我们主要集中在基因在dark-orange模块。在黑色的模块,我们执行一个分析GS和MM。在我们的分析(图3(一个)), ,显示,GS和毫米之间有很强的相关性非常显著的相关性。同时,我们选择 和 作为参考。总498个基因。后续功能分析的基础上也进行了498个基因。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
3.2。筛选度
根据我们的标准,两个数据集的度如图4(一)和4 (c)。60度调节和111度下调GSE1367数据集。表达下调1226度和959度调节GSE100933数据集。50度的两个数据集是如图4 (b)和4 (d)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。功能性浓缩和度的途径分析
KEGG分析的结果对成骨细胞differentiation-related基因表明,核糖体,溶酶体,谷胱甘肽代谢和ferroptosis的几种主要途径(图3 (b))。度GSE1367,我们还发现谷胱甘肽代谢也更重要的途径(图之一4 (e))。
3.4。Ferroptosis——谷胱甘肽代谢相关的基因
用维恩图与ferroptosis找到共同的基因(图4 (f))。从表列出GSE1367五度1。六十八度列在表中1从GSE100933被选择。和普通基因TFRC ENBB2。PPI网络的建立(图68度5(一个))。和中心基因表所示1用红色标注的。只有TFRC属于中心的基因。度选择从谷胱甘肽代谢GSE100933形成了PPI网络包含4基因(图5 (b))。谷胱甘肽代谢的共同基因GSTM1基因(图5 (c))。这个基因也可以位于PPI网络。所以,GSTM1基因的关键基因被认为是谷胱甘肽代谢相关。TFRC被认为ferroptosis-related关键基因。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。两个基因的相关性
皮尔森相关的结果对两个基因表达水平是如图5 (d)。在GSE30393,是-0.93 (值= 1.6 - - - - - -05)。在GSE100933,是-0.82 (值= 0.046)。在GSE1367,是-0.92 (值= 0.0097)。这两个基因的表达具有很强的负相关在两种数据集,有显著的统计学意义。
3.6。预测的目标化合物
通过输入数据库中的基因符号,我们有相应的基因的靶向药物。谷胱甘肽是筛选GSTM1基因的唯一已知的受体激动剂(表2)。然而,我们并没有得到相应的复合TFRC基因。因此,在随后的细胞实验中,我们通过添加谷胱甘肽刺激GSTM1基因来观察其对废弃的影响成骨细胞模型和随后的TFRC的表情。
3.7。谷胱甘肽和Ferroptosis-Related基因的验证和ROS测试
添加谷胱甘肽之后,细胞培养在信用社系统15转/分的速度为2天。通过共焦图像(图6(一)),我们可以发现大量的活性氧产生建模过程后成骨细胞谷胱甘肽。在图所示的建模细胞6 (b)。rt - pcr结果(图6 (c)谷胱甘肽干预后)显示,GSTM1基因调节。TFRC的表达下调。在中含有谷胱甘肽,成骨细胞产生的活性氧显著降低。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
细胞内活性氧参与骨内稳态的过程,通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化。过多的活性氧的生产将防止成骨细胞的分化和矿化33]。减少细胞内谷胱甘肽可以参与调节细胞内ROS。一项研究关注低分子量蛋白质酪氨酸磷酸酶(LME-PTP)透露,减少谷胱甘肽的浓度增加而LME-PTP浓度的增加成骨细胞成骨诱导的前21天。这种趋势符合成骨细胞的快速增殖和矿化34]。在我们的研究中,谷胱甘肽代谢pathway-related基因都是调节。这是与增加细胞内谷胱甘肽的内容一致。谷胱甘肽代谢途径的功能是与胞内还原谷胱甘肽的作用密切相关。铁代谢也在成骨细胞分化起着重要的作用。铁离子对成骨细胞很重要。人们普遍认识到,铁过载或缺铁会抑制成骨细胞的功能(35]。一项研究使用铁螯合剂去铁胺(柴油)表明,柴油降低成骨基因和碱性磷酸酶的表达,同时降低细胞内铁离子的浓度(36]。在某种程度上,这些都是我们发现ferroptosis通路密切相关研究中起着重要的作用。这个途径涉及到细胞内外铁离子的交换和铁离子在细胞的新陈代谢。造骨细胞能维持细胞内铁稳态期间通过这个途径分化。
需要持续的能源供应在成骨细胞发育和功能的所有阶段。在成骨细胞生长和分化的过程中,通过糖酵解产生活性氧和线粒体氧化磷酸化来满足能源需求的成骨细胞37]。线粒体的正常功能可以维持细胞内ROS的正常水平38]。然而,细胞内ROS的不平衡发生在不同osteoblast-related疾病。太阳et al。39)目睹了成骨细胞的活性氧积累能显著诱导细胞凋亡MC3T3E1的概率。间变性大细胞淋巴瘤引起的另一项研究3全身的细胞MC3T3-E1骨质疏松症发现活性氧清除剂可以减轻mitophagy和细胞凋亡的程度,恢复细胞的正常功能(40]。因此,活性氧的作用在骨质疏松症的发病机理和治疗应该被广泛关注。多种基因参与活性氧已被证明是与骨质疏松症的发生密切相关。这个GPX7的缺失将导致成骨细胞成骨能力下降的活性氧的积累(41]。在骨质疏松症与2型糖尿病有关,过量的铁积累在细胞可以诱导活性氧积累,然后引起成骨细胞的减少osteogenesis-related能力。
我们的建模过程模拟失重环境,为细胞提供了强劲的外部刺激。检测活性氧水平后,我们发现很多ROS确实是建模后产生。清除氧化应激产品作为主要酶,谷胱甘肽S-transferases由GSTM1基因编码可以维持正常的骨矿物质密度通过抑制氧化应激的负面影响。谷胱甘肽S-transferases可以使用谷胱甘肽减少有毒物质在细胞转化为无毒的化合物,以及谷胱甘肽也可以被视为一个GSTM1基因基因的受体激动剂(42]。GSTM1基因的表达是调节后添加减少谷胱甘肽。添加谷胱甘肽作为对这种基因兴奋剂。与此同时,我们可以看到显著降低ROS和细胞形态的改善。另一方面,ferroptosis有关线粒体铁蛋白(FtMt)可以抑制ferroptosis过程通过减少氧化应激的积累在hFOB1.19细胞(24]。在多种疾病,如镰状细胞性贫血和乳腺癌,GSTM1基因的删除已经目睹了密切相关的细胞内铁浓度的增加(43,44]。在一项研究中对骨矿物质密度(BMD)大联合,运营商GSTM1基因纯合缺失的基因片段与低BMD值密切相关,这些联合网站(45]。
在铁代谢相关方面,TFRC是一个重要的参与者在细胞内铁运输(46]。转录和翻译的蛋白质根据这个基因可以帮助转移细胞外铁3 +细胞内(47]。在骨髓瘤,TFRC的高表达会引起铁浓度在细胞的积累。的积累可能导致异常激活破骨细胞和随后的严重骨吸收(48]。枸橼酸铁铵TFRC mRNA过度影响的人类成骨细胞细胞可以减少Runx2的osteogenesis-related mRNA表达,α1型胶原链通过刺猬信号通路(49]。TFRC可能诱发过度摄入的铁,然后导致过度释放活性氧的NADPH氧化酶1信号途径[50]。生物信息学分析表明这两个基因,GSTM1基因和TFRC的显著相关性,可能互相影响。在我们的研究中,GSTM1基因调节,TFRC下调在培养包含介质在信用社系统相比,MEM谷胱甘肽。细胞内谷胱甘肽的减少可能会结合谷胱甘肽S-transferases自由和减少细胞内活性氧的生产(51]。我们的研究表明,添加谷胱甘肽可以激活GSTM1基因在建模的过程中。同时,TFRC的表达下调,可能一起在减少细胞内ROS扮演的角色。当然,这还需要进一步的研究。的两个重要途径,ferroptosis谷胱甘肽代谢途径,也应该得到更多的关注。
5。结论
我们的研究首先透露,谷胱甘肽代谢和ferroptosis通路都扮演了一个重要的角色在成骨细胞微分过程和废弃骨质疏松症。两个关键基因与这两种机制,GSTM1基因和TFRC,相互作用和相互影响。这些可以被看作是分子生物学依据谷胱甘肽代谢和ferroptosis之间的通信。谷胱甘肽、GSTM1基因受体激动剂被证明有效降低成骨细胞的过度ROS。同时,GSTM1基因基因和TFRC基因之间的敌对的关系也被证明。
缩写
| WGCNA: | 加权基因coexpression网络分析 |
| KEGG: | 京都基因和基因组的百科全书 |
| 提出: | 连接图 |
| 度: | 差异表达基因 |
| PPI: | 蛋白质相互作用 |
| 谷胱甘肽: | 谷胱甘肽。 |
数据可用性
所有生成的数据或分析在当前研究包括在发表的这篇文章。GSE30393可以下载:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE30393。GSE1367可以下载:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE1367。GSE100933可以下载:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE100933。
伦理批准
使用的数据在我们的数据集涉及人类间充质干细胞从公共数据集通过道德在最初的研究中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
概念化是由Yuanlin王、玉茎徐。数据管理和正式的分析是由Yuanlin王、翳明佳。软件和方法是由必应,郑王,杨Liu Xingkun刘。最初的草案是由所有作者的写作。编写和审查和编辑被刘骏完成。所有作者阅读和批准最终的手稿。许Yuanlin王、翳明佳和茎的贡献同样这项工作。
确认
这个工作是由6目前基金:天津的基础健康委员会(ZC20192),天津科学技术支持项目基金会(18 yfzcsy00890),天津主要特殊基金会(18 zxsgsy00010),天津市自然科学基金(20 jcqnjc01170),天津市重点实验室开放基金的骨植入体界面功能化和个性化(sy - 04 - 202101)和中国国家自然科学基金青年基金(82102639)。