文摘

目的。为了揭开机制mir - 204 - 5 - p在乳腺癌细胞(BC)。方法。mir - 204 - 5 - p BC细胞系中表达水平测量中存在。假定的结合位点的mir - 204 - 5 - 3 p - - - - - -未翻译区生物信息学预测的方法,验证了PRR11 dual-luciferase方法。蛋白质和mRNA水平PRR11在公元前由免疫印迹和存在。两个基因之间的关系分析了相关性分析。通过CCK8癌细胞功能进行评估,流式细胞术,Transwell方法。结果。mir - 204 - 5 - p差别明显对这些基因在公元前组织和细胞。细胞功能实验表明,抑制mir - 204 - 5 - p细胞行为和细胞周期。PRR11的下游目标mir - 204 - 5 - p。抑制RPP11可以反向的影响mir - 204 -公元前5 - p抑制剂对细胞功能的。结论。我们的研究显示,mir - 204 - 5 - p / PRPP11轴压制BC进展,这可能提供了一个新颖的见解的监管角色mir - 204 - 5 - p。

1。介绍

尽管乳腺癌(BC)研究进展,其发病机理、病理过程,及相关分子机制还远不及理解(1]。microrna在公元前发展起到至关重要的作用[2]。相应地,越来越多的研究试图探索microrna在公元前的调节作用。这项研究的目的是确定是否以及如何mir - 204 -公元前5 - p调节细胞的行为。

mir - 204 - 5 - p进行多样化对肿瘤恶化的影响,在癌症研究仍有不同的观点。指的是许多研究,mir - 204 - 5 - p是总结作为一个肿瘤抑制因子。例如,据报道,mir - 204 - 5 - p减弱肿瘤恶性肿瘤在胃癌不同层次,前列腺癌和肝细胞癌(3- - - - - -6]。然而,一些研究人员观察到相反的结果在其他肿瘤;例如,张先生和他的同事总结肿瘤发生的作用mir - 204 - 5 - p在宫颈癌7]。不同甚至相反mir - 204 - 5 - p的影响在不同的肿瘤可能是由于其多个目标基因。尽管mir - 204 -公元前5 - p被认为是抑制广泛,所涉及的分子机制和下游的显示不同8- - - - - -10]。这些调查阐述了mir - 204 - 5 - p在公元前的潜在生物标志物。因此,深入研究的潜在机制和潜在的目标基因mir - 204 - 5 - p仍急需。

目前的研究调查的影响mir - 204 -公元前5 - p的表达和细胞的功能。进一步,利用生物信息学方法,PRR11被预测为目标的mir - 204 - 5 - p的机制和mir - 204 - 5 - p / PRR11检查。总之,这项研究提供了新的见解的分子机制mir - 204 - 5 - p在公元前,基于这种机制指的是潜在的治疗策略。

2。材料和方法

2.1。微阵列分析

癌症基因组图谱(TCGA)数据库提供了所需的所有数据,包括mRNA(正常肿瘤:1109:113)和microrna(正常肿瘤:1103:104)。mir - 204 - 5 - p表达式根据下载的数据进行了分析。信使rna进行了差异分析( , )通过使用磨边机。生物信息学数据库(miRDB mirDIP和TargetScan)被用来预测的目标mir - 204 - 5 - p,结果是与调节DEmRNAs重叠。最高的信使rna相关的microrna的被选为调查研究公元前的底层机制。GSEA进行目标mRNA。

2.2。细胞系

细胞系本研究采用列举如下:公元前细胞系MCF-7 (BNCC337656) AU565 (BNCC338197), mda - mb - 157 (BNCC338651) BT-20 (BNCC338513)和mda - mb - 231 (BNCC337893)和正常的人类乳腺细胞系MCF-10A (BNCC337734)。希伯来文名字文化收集(中国,北京)提供所有的细胞系,是生长在RPMI - 1640年(罗斯威尔公园纪念研究所)介质(Gibco热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)。中包含的边后卫(10%;HyClone;美国通用电气医疗集团生命科学,洛根,UT)。链霉素和青霉素(来自Gibco;热费希尔科学,Inc .)添加适当(每个100 U /毫升)。常规细胞培养进行恒温培养箱(热科学、HEARCELL150i)。

2.3。寡核苷酸和质粒转染

miR-mimic (50 nM),模拟-控制(模拟数控50 nM), miR-inhibitor (50 nM),和抑制剂数控(50 nM)从GeneCopoeia购买(广州)。慢病毒载体是用来创建si-PRR11和si-NC。质粒转染Lipofectamine 2000使用的工具包(表达载体,卡尔斯巴德,加州)。随后的分析是进行转染细胞48 h后。

2.4。中存在

这个工具包用于总RNA提取试剂盒试剂(热费希尔科学,Inc .)。NanoDrop 2000(热费希尔科学,Inc .)是用于检测浓度的RNA (1 - 2μg)。信使rna / microrna是转录cDNA使用PrimeScript RT大师混合(豆类、公关中国)/ miScript II RT工具包(美国试剂盒)。存在运行7500年ABI实时PCR(应用生物系统公司;热费希尔科学,Inc .)。热循环条件如下:5分钟的初始变性在95°C,紧随其后的是40 30秒的周期在95°C, 60°C, 72°C。见表1引物信息。内部引用U6 (microrna)以及GAPDH (PRR11)。结果量化和标准化 价值。

表1
引物序列。
2.5。蛋白质检测

工具包用于蛋白裂解是radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(Beyotime、上海、中国),这是添加蛋白酶抑制剂(bios,北京)。蛋白质浓度检查中使用的工具是BCA试剂盒(热费希尔科学,Inc .)。蛋白质的数量(30μg) 12% sds - page分离(钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳)。样本然后安装到聚乙二烯二氟化物膜(微孔、Billerica MA)。然后,一夜孵化进行5%脱脂奶powder-blocked膜(1 h)以及主要抗体。使用抗体是PRR11(英国Abcam ab237526)和GAPDH(英国Abcam ab9485)。3洗后与PBST (10 min /时间),治疗膜受到1 h(二次抗体孵化(英国ab6721, Abcam山羊anti-rabbit免疫球蛋白,horseradish-labeled)。3洗后PBST(10分钟/时间),薄膜在光学扫描照明器(美国通用电气)。

2.6。细胞生存能力考试

AU565和mda - mb - 231细胞( / 100μL)接种到无菌96孔板后24小时的日常文化。转染后细胞在表示时间点收集。细胞增殖是由CCK8化验的方法(C0037 Beyotime,中国)。CCK8试剂添加到板,和细胞培养常规检测前4 h。吸光度测量是使用SpectraMax M5(分子设备,医学博士,美国)在24 h, 48 h, h, 72和96 h(450海里)。

2.7。细胞周期分析

细胞转染48 h。洗涤用的附着和漂浮细胞聚集1毫升PBS。然后,洗细胞resuspended使用500年μL PBS + 50μg / mLπ(碘化propidium)。之后,0.2% Triton x - 100和核糖核酸酶(100μg / mL)细胞,加入一定量的细胞培养在黑暗中30分钟在4°C。然后,FACSCalibur (Becton, Dickinson和公司,CA)是用于细胞计数。细胞百分比在G2 / M、S和G0 / G1阶段进行了分析。

2.8。Transwell方法

正常Transwell钱伯斯和Matrigel-coated Transwell室,分别使用。过滤器清洗无血清DMEM和放置在一个24-well盘子。低Transwell室包含DMEM 10%的边后卫。然后, 公元前细胞接种到参议院增加200μL DMEM, 0.1%牛血清白蛋白,2毫克/毫升Matrigel-coated电影。一样的一般条件,Transwell室培养24小时。文化后,剩余的细胞上用棉签膜表面被移除。细胞在膜表面固定在10%甲醇温度为30分钟,结晶紫沾0.5%。六个随机选择的字段是使用倒置显微镜图。移民检测转染细胞( 细胞/室)在顶端接种室,如上所述,没有人工基底膜。

2.9。Dual-Luciferase报告基因分析

在dual-luciferase报告基因分析,3 - - - - - -UTR PRR11的包含野生型(WT)或变异(傻瓜)结合位点mir - 204 - 5 - p被克隆到psiCHECK向量。PRR11-WT和PRR11-MUT记者质粒测序进行构建和验证。PRR11-WT和PRR11-MUT质粒分别转染miR-mimic或模拟数控AU565。Renilla荧光素酶的表达载体pRL-TK(豆类,大连,中国)作为内部参考。转染后36 h,荧光素酶活性测定的dual-luciferase报告基因检测(WI Promega,麦迪逊,美国)。

2.10。统计分析

化验的结果上处理Graphpad Prism 6.0(美国圣地亚哥,CA)。所有的分析化验3次。结果表现为 。方差分析和学生的 - - - - - -分别测试,用于比较和团体之间的关系。 小于0.05被认为显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。mir - 204 - 5 - p表达式是在公元前表达下调

许多调查提到mir - 204 - 5 - p对肿瘤的发展是至关重要的(11- - - - - -13]。基于生物信息学分析,mir - 204 -公元前5 - p是表达在低水平(图1(一))。生存分析证明了糟糕的低水平的患者的生存结果mir - 204 - 5 - p(图1 (b))。如图1 (c),癌症细胞系表现出明显低水平的mir - 204 - 5 - p,这正好与早些时候的调查和生物信息学的结果。AU565和mda - mb - 231,分别有最高和最低水平mir - 204 - 5 - p的申请功能实验。

(一)
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(c)
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图1
低水平的mir - 204 -公元前5 - p: (a)小提琴的情节TCGA mir - 204 - 5 - p水平,用蓝色显示正常,黄色显示肿瘤;(b)患者的生存分析;(c)水平mir - 204 - 5 - p细胞( 意味着 ,相比之下,MCF-10A)。
3.2。mir - 204 - 5 - p诱导细胞周期阻滞和阻碍细胞功能

mir - 204 - 5 - p中,分别在AU565和mda - mb - 231。存在时建议mir - 204 - 5 - p模仿转染,mir - 204 - 5 - p的表达显著调节两个细胞系(图2(一个))。然后,转染细胞的生物学行为验证了功能实验。公元前CCK8结果表现出明显减少增生性的潜力细胞(图2 (b))。与此同时,基于Transwell化验,公元前能力迁移和入侵细胞显著减少在mir - 204 - 5 - p过度(数字2 (c)和2 (d))。细胞周期在G0 / G1期被捕后mir - 204 - 5 - p超表达(图2 (e))。总之,mir - 204 - 5 - p可能作为肿瘤抑制BC。

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图2
mir - 204 - 5 - p诱导细胞周期阻滞和阻碍细胞功能:(a)转染效率mir - 204 -公元前5 - p细胞;(b)细胞活性CCK8化验;(c)公元前细胞的迁移能力(×100)由Transwell试验测试;公元前(d)入侵能力的细胞(×100)由Transwell分析化验;(e)的细胞比例在每个细胞周期阶段( 意味着 )。
3.3。PRR11直接mir - 204的目标——在公元前5 - p

完全,2162 DEmRNAs被获得。其中,有1405个调节mrna和757年下调mrna(补充表1)。mir - 204 - 5 - p的目标被发现使用生物信息学数据库。结果与1405年调节DEmRNAs,和11个目标基因具有结合位点和mir - 204 - 5 - p(图得到3(一个))。PRR11与microrna的研究体现了强烈的负相关,因此以下(图使用3 (b))。公元前PRR11显著高表达的组织(图3 (c))。PRR11水平与患者的生存和细胞周期(数字3 (d)和3 (e))。

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图3
PRR11直接的目标mir - 204 -公元前5 - p: (a)筛选目标mRNA的维恩图;(b)皮尔森相关分析的结果;(c)小提琴的情节PRR11 TCGA水平正常和黄色瘤(蓝色);(d)生存分析PRR11水平和生存;GSEA (e)的结果;(f)之间潜在的绑定区域2的基因;(g)之间的绑定2基因;(h) PRR11水平在不同细胞中;(i, j)的结果中存在和免疫印迹( 意味着 )。

潜在的两个基因是由TargetScan发现结合位点(图3 (f))。然后,3 - - - - - -UTR PRR11包含傻瓜或WT结合位点mir - 204 - 5 - p被克隆到psiCHECK向量。dual-luciferase方法被用于针对验证。荧光素酶强度明显减弱时AU565细胞cotransfected mir - 204 - 5 - p模仿和PRR11-WT(图3 (g))。

正常乳腺细胞相比,在公元前PRR11 mRNA的表达细胞显著调节(图3 (h))。然而,中mir - 204 - 5 - p明显减少PRR11 mRNA和蛋白表达的癌细胞(数字3(我)和3 (j))。总之,PRR11直接mir - 204 - 5 - p的目标。

3.4。mir - 204 - 5 - p诱导细胞周期阻滞和阻碍癌细胞通过PRR11抑制功能

我们已经介绍了PRR11在肿瘤发展的重要作用,虽然它仍是一个谜PRR11作为分子目标的功能抑制的发展引起的公元前mir - 204 - 5 - p。因此,进行了以下分析。抑制mir - 204 - 5 - p明显减少mir - 204 - 5 - BC细胞中表达,增加了PRR11表达式。此外,同时使转染si-PRR11和mir - 204 - 5 - p抑制剂减少PRR11表达式(数字4(一)和4 (b))。CCK8化验的结果显示,使转染mir - 204 - 5 - p抑制剂进入细胞可以促进BC细胞的增殖。当si-PRR11和mir - 204 - 5 - p抑制剂cotransfected到癌细胞,癌细胞扩散引起的低mir - 204 - 5 - p的表达可以抑制(图4 (c))。Transwell是用来检测细胞迁移和入侵。mir - 204 - 5 - p抑制剂显著增强的迁移和入侵AU565和mda - mb - 231,而si-PRR11逆转它(数据4 (d)和4 (e))。此外,细胞周期分析的结果表明,抑制mir - 204 - 5 - p降低肿瘤细胞的比例在G0 / G1,虽然si-PRR11增加这个比例(图4 (f))。总之,mir - 204 - 5 - p诱导细胞周期阻滞和阻碍癌细胞通过PRR11抑制功能。

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图4
mir - 204 - 5 - p诱导细胞周期阻滞和阻碍癌细胞功能通过PRR11抑制:(a)表达mir - 204 - 5 - p和PRR11 mRNA在公元前细胞;(b)蛋白水平的评估了PRR11免疫印迹;(c)转染细胞的细胞活性;(d)转染前细胞迁移能力由Transwell试验(×100);公元前(e)入侵能力的转染细胞由Transwell试验(×100);(f)细胞比例在每个细胞周期阶段( 意味着 )。

4所示。讨论

我们发现mir - 204 -公元前5 - p是低表达的组织,其次是验证在细胞水平上的趋势。接下来,我们验证了其对癌细胞的抑制影响函数由overexpressing mir - 204 - 5 - p,其结果与先前的研究一致(8,9,14]。研究表明由香港et al ., mir - 204 - 5 - p作为肿瘤抑制会使PIK3CB表达式,这会减慢肿瘤生长,抑制转移通过PI3K / AKT通路(8]。此外,我们预测下游目标mir - 204 - 5 - p的生物信息学和找到一个结合位点的mir - 204 - 5 - p PRR11 3 - - - - - -UTR使用dual-luciferase分析和验证了预测。这是第一次研究的机制mir - 204 -公元前5 - p / PRR11轴工作,这是一个新奇的从我们的研究。

基于文献回顾,PRR11过度影响细胞周期,促进肺癌进展(15]。有趣的是,一个类似的结果在我们的研究观察细胞周期评估。此外,肿瘤耐药性也积极与PRR11表达水平根据李等人的研究(16),这可能会导致患者的不良预后。PRR11已经证明持有预后价值,作为一种致癌因素在公元前17)(我们的生物信息学预测显示,患者的高表达PRR11遭受不良预后)。最重要的是,的肿瘤抑制作用mir - 204 - 5 - p / PRR11监管轴BC似乎是可靠的。

总的来说,我们发现mir - 204 - 5 - p的影响和PRR11 BC。值得注意的是,PRR11是一个至关重要的下游调节因子在公元前的发展。mir - 204 - 5 - p诱导细胞周期阻滞和阻碍癌细胞通过PRR11抑制功能。临床组织收集和在活的有机体内实验是未来安排提供一个理由BC疗法。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

同意是不适用的。

的利益冲突

作者没有任何可能的利益冲突。

作者的贡献

QX和HS作出了实质性的贡献的概念和设计工作。BG负责数据的采集和解释。QX起草文章。新西兰修订它至关重要的知识内容。所有作者阅读和批准最终的手稿。Qunxue苏和郝沈了同样工作。

补充材料

补充表1:2162 DEmRNAs通过微分分析列表。(补充材料)