文摘

糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病患者的视力丧失的主要原因,不能完全解决典型的血糖控制。炎症影响发展的博士,所以减少炎症反应博士博士患者对预防是至关重要的因此,我们探讨了监管的影响骨髓间充质干细胞(BMSC)液在小鼠博士炎症。为了分析的作用机制,我们使用BMSC exosomal mir - 146 a治疗小鼠博士观察小胶质细胞的细胞和炎症因子的表达变化。发现BMSC exosomal mir - 146 a的水平降低的小胶质细胞增殖细胞抗原和b细胞lymphoma-2老鼠博士和增加Bcl-2-related X半胱氨酸天冬氨酸的protease-3。通过分析炎性因子的表达,我们发现BMSC exosomal mir - 146 -减少肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,il - 6,这表明,mir - 146 a可以减轻炎症小鼠博士。进一步探索发现mir - 146 a TLR4的活动能力降低,增加了MyD88和NF -的活性κb .此外,TLR4的过度扭转了mir - 146 a对扩散的影响,小胶质细胞的凋亡和炎症。我们的研究表明,BMSC exosomal mir - 146 a可以调节炎症反应的中介TLR4 / MyD88 / NF -博士κB通路,为预防和治疗提供实验基础的博士。

1。介绍

糖尿病性视网膜病变(DR)是一种常见的眼部并发症引起的糖尿病。博士患者在早期没有明显的临床症状,但视力受损更严重的疾病进展阶段(1),在此期间,患者体验温柔的眼球,视力模糊,或损失和飞蚊症2,3]。未能得到及时有效的治疗可以导致双眼失明。传统治疗博士的目标是用药物来控制血糖,防止疾病的进一步恶化,改善视力和身体的新陈代谢功能4]。然而,一些临床实践表明,尽管实现有效的血糖控制,有些病人仍然进展博士更严重的阶段,因此,确定新的治疗策略,以防止或减缓疾病的进展博士已成为关注的焦点。博士是糖尿病的微血管并发症,表现为视网膜毛细血管周的损失和增加血管通透性5]。研究已经证实,促进炎症的发展[博士6- - - - - -8]。慢性炎症可引起视网膜内皮细胞的功能障碍,减少对周,并增加血管通透性,导致博士的进展(7]。小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞。在健康的视网膜小胶质细胞主要分布在视网膜内层(9),而在病理条件下,大量激活的小胶质细胞之间的空间可以找到外核和视网膜下层(10]。长期激活小胶质细胞持续增殖的可能会导致大量的炎性细胞因子的分泌,激活凋亡蛋白半胱天冬酶,和视网膜神经细胞凋亡,导致发展的博士(11,12]。因此,有效抑制小胶质激活和扩散是至关重要的减少患者的慢性炎症。

近年来,干细胞疗法为临床治疗提供了新方法的骨髓间充质干细胞(bmsc)博士是一群哺乳动物骨髓基质细胞具有多向分化的潜能。研究已经证实,bmsc可促进神经营养因子的分泌,增加神经纤维的生长速率,抑制炎症(13]。mir - 146 a是一个单链非编码小RNA调节基因表达通过绑定到目标mrna。作为一种重要的先天免疫信号调节器,mir - 146 a参与各种自身免疫性和传染病的免疫反应过程(14]。液是纳米粒子,可以有效地交付microrna的受体细胞。研究表明,通过分泌exosomal microrna bmsc调节肿瘤微环境,从而影响肿瘤细胞的生物学行为(15]。toll样受体4 (TLR4) / 88 (MyD88) /骨髓分化因素核转录因子-κB (NF -κB)信号通路是显示人体的免疫应答密切相关(16]。TLR4信号传输通过MyD88 MyD88适配器蛋白信号通路介导的磷酸化适配器因素结合,并传播下游NF -κB通路,从而导致转录因子的激活(17]。有研究报道,脂肪酶(LPS)可以调解TNF -的生产α、il - 6和引发肝癌患者通过TLR4 MyD88 / NF -κB信号通路激活cyclooxygenase-2 /前列腺素信号轴,从而调节肝癌细胞的增殖(18]。TLR4的激活/ MyD88 / NF -κB途径不仅可以提高抗肿瘤免疫,但也可能导致肿瘤的免疫监视和促进肿瘤发展(19]。因此,本研究旨在研究BMSC exosomal mir - 146 a对microglia-mediated炎症和探索其作用机理是否与TLR4 / MyD88 / NF -κB信号通路。

2。材料和方法

2.1。动物、试剂和仪器

实验老鼠,6 - 8周大雄性C57BL / C,是由广西提供动物实验中心。链脲霉素是由大连Meilun生物技术有限公司提供有限公司胎牛血清是由杭州四季青生物工程材料有限公司,有限公司杜尔贝科的修改鹰Hycilne提供的介质(DMEM),美国。(3)- 4 5-Dimethylthiazole-2 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴化(MTT)和二甲亚砜(DMSO)都是由Sigma-Aldrich。高速离心机提供了由湖南相依离心机有限公司有限公司流式细胞分析仪是由美国BD公司提供。提供的酶联免疫吸附试验装备是Rapibio实验室,美国。

本研究机构批准的动物保健和使用委员会长海医院附属于海军医科大学,上海,中国,是严格按照指南进行的视觉和眼科学研究协会(下午)的使用动物。

2.2。隔离、文化和bmsc的识别

实验小鼠牺牲使用全骨髓法和放置在75%的酒精10分钟。在无菌操作表,鼠标被切断的下肢皮肤无菌剪刀,大腿和小腿肌肉分离完全暴露两下肢的胫骨和腓骨。髋关节和膝关节的关节被切断,胫骨和腓骨被拆除,冲洗以磷酸缓冲盐(PBS)的三倍。删除干骨后端后,骨髓冲洗出来,转移到50毫升无菌在2000×g离心管,离心5分钟。获得的细胞被播种在DMEM和放置在一个孵化器亚文化。当培养到第三段,用流式细胞仪检测细胞表面抗原,和合格的bmsc整除和存储在−80°C,供以后使用。

2.3。提取BMSC Exosomal mir - 146 a

bmsc培养第三通道被播种在10厘米细胞培养皿,和上层清液。离心(300×g, 10分钟)然后进行去除细胞。上层清液被获得和离心机先后两次的速度2000×g和10000 g×,分别用离心10分钟的时间。上层清液中提取,离心两次在100000 g×60分钟。与200年获得沉淀保留,稀释μL PBS溶液,并存储在−80°C,供以后使用。

2.4。博士建立鼠标模型

28小鼠随机分为对照组( )和一个实验组( );前基础饲料喂养,后者高糖和高脂肪饲料喂养。喂养8周后,所有的实验小鼠禁食12小时。实验组当时注射60毫克/公斤链脲霉素产生一个1型糖尿病小鼠模型。注入持续了5 d,小鼠的血糖水平测量7天。一个 表示成功建立糖尿病小鼠模型。成功的糖尿病小鼠建模通常是美联储为4周。4周后,毛细管扩张、视网膜出血和动静脉畸形出现在眼底的老鼠,这表明博士模型成功建立。

2.5。小胶质细胞的制备和组干预

16个博士小鼠随机分为模型组和mir - 146 -一组,每组8只老鼠。每组小鼠的视网膜小胶质细胞提取。博士的老鼠在75%的酒精浸泡10分钟,然后脖子被迅速删除。每个动物的大脑皮层被去除脑膜和血管。获得组织被切割成碎片,悬架是通过移液和过滤一场空。暂停加入DMEM含有10% PBS和放置在一个恒温培养箱贴壁培养。文化达到第三通道时,被播种在培养瓶中,固定的,动摇了在恒温瓶250×g为30分钟,和离心机(1500×g, 5分钟)收集的上层清液接种24-well板。mir - 146 a组注射2.5毫克/公斤的BMSC exosomal mir - 146 a,模型组注射生理盐水(2.5毫克/公斤),对照组并没有治疗。pcDNA-CON和pcDNA-TLR4转染入鼠小胶质细胞,并设置为pcDNA-CON博士和pcDNA-TLR4组,分别。控制质粒(pcDNA 3.0)和3.0 pcDNA tlr4取自Hanbio(上海,中国)。 After transfection of pcDNA-CON and pcDNA-TLR4, they were treated with BMSC exosomal miR-146a and were recorded as 集团和 组,分别。

2.6。MTT检测小胶质活动

亚文化的小胶质细胞被播种在24-well玻璃板块,进一步培养48 h。两天之后,20μL (MTT的解决方案是添加到每个孵化。孵化后4 h, 150μL的DMSO溶液添加到每个。反应是动摇了10分钟,吸光度测量在490海里。

2.7。通过流式细胞仪检测小胶质细胞凋亡

后不同转染的细胞组织培养48 h,他们与预冷PBS冲洗两次,在PBS resuspended绑定缓冲,并与膜联蛋白添加V-FITC (10μL)孵化的10分钟。五μL(π添加10分钟前通过流式细胞仪检测细胞凋亡。

2.8。免疫印迹

总蛋白质含量从细胞中提取使用radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲(σ,美国)。离心后,蛋白质样本从上层的孤立。蛋白质浓度是由直流试验(美国BioRad)。然后,获得的蛋白质样本电泳和转移到膜。之后,膜在4°C孵化12 h与以下主要抗体:PCNA (1μg / ml, ab29, Abcam,英国),bcl - 2(1: 1000年,ab32124 Abcam,英国),伯灵顿(1:1000年,ab32503 Abcam,英国),Caspase-3(1: 500年,ab32042 Abcam,英国),TLR4(1: 1000年,ab13556 Abcam,英国),MyD88(1: 1000年,ab133739 Abcam,英国),NF -κAbcam ab288751 B(1: 1000年,英国),和β肌动蛋白(1μg / ml, ab8226 Abcam、英国)。与TBST洗膜后,孵化与HRP-labeled二级抗体(1:2000年,ab6721 Abcam,英国)90分钟的37°C。膜清洗TBST和发达的ECL发光的解决方案。蛋白质的灰度值乐队是使用一个软件的数量来衡量的。

2.9。血清肿瘤坏死因子-α,il - 1β和il - 6检测

酶联免疫吸附试验方法被用来检测肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,在小胶质细胞il - 6。具体步骤如下:首先,特殊抗体球蛋白与涂料稀释缓冲。涂层解决方案当时沉浸在被3小时37°C水浴以及3次清洗的清洗缓冲。测试样本加入了含有抗原,enzyme-labeled特定抗体孵化和洗涤后添加。添加底物是为了开发另一个孵化和洗涤后颜色,并观察结果。

2.10。统计分析

我们使用SPSS 23.0分析本研究的数据。所有实验测定3次。定量数据符合正态分布表示 。组间比较进行使用单向方差分析(方差分析),和一个SNA-Q用于两组之间的两两比较。对所有数据的比较,我们使用一个统计显著性水平 。

3所示。结果与讨论

3.1。BMSC识别

结果表明,细胞表面抗原CD29、CD44是积极的,积极的利率分别为96.44%和98.17%。CD31和CD117是负的。这表明,bmsc培养细胞。流式细胞术结果如图所示1。

3.2。BMSC Exosomal mir - 146 a对小胶质细胞增殖

方差分析发现,增殖细胞抗原(PCNA)水平明显不同的三组( , ),这表明小胶质细胞的增殖率高于控制老鼠。老鼠博士在小胶质细胞治疗BMSC exosomal mir - 146 a, PCNA的表达细胞活性显著降低( , ),如表所示1和图2。

3.3。BMSC Exosomal mir - 146 a对小胶质细胞凋亡

方差分析显示明显不同的表达差异伯灵顿,bcl - 2, Capase-3和三组细胞凋亡率( )。与对照组相比,小胶质细胞的凋亡率和水平的伯灵顿博士和Capase-3老鼠明显减少,而bcl - 2显著增加的水平( )。mir - 146 a治疗后,小胶质细胞的凋亡率和伯灵顿和Capase-3水平显著增加,而bcl - 2减少的水平( ),如表所示2和数字3和4。

3.4。BMSC Exosomal mir - 146 a对TNF -α,il - 1β,il - 6

我们发现,与未经处理的小鼠相比,肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β博士,il - 6的小胶质细胞小鼠生理盐水处理显著增加( )。然而,mir - 146治疗后,这些水平显著降低( ),如表所示3和图5。

3.5。BMSC Exosomal mir - 146 a对TLR4 / MyD88 / NF -κB通路

与未经处理的小鼠相比,在博士的小胶质细胞TLR4的表达小鼠生理盐水处理显著增加,和MyD88和NF -的活性κB蛋白显著下降( )。mir - 146治疗后,小胶质细胞TLR4水平显著降低,而MyD88和NF -的水平κB蛋白显著增加( ),如图6。

3.6。PcDNA-TLR4对小胶质细胞的变化处理mir - 146 a

pcDNA-CON集团与PCNA bcl - 2 pcDNA-TLR4组的水平显著增加,而伯灵顿和Capase-3水平显著降低了( )。这表明TLR4过度增加小胶质细胞的增殖能力和减少细胞凋亡能力。相比 组织PCNA和bcl - 2的水平 组显著增加,而伯灵顿的水平和Capase-3下降( )。这表明超表达TLR4的逆转mir - 146 a的影响对小胶质细胞的增殖和凋亡,如表所示4和图7。

3.7。PcDNA-TLR4对TLR4 / MyD88 / NF -κB途径在小鼠接受mir - 146 a

与空白相比,转染细胞,细胞转染与TLR4的TLR4水平明显增加,和MyD88和NF -的水平κB显著下降( )。在比较 组织TLR4的水平 组显著增加,而MyD88和NF -的水平κB显著下降( ),如表所示5和图8。

4所示。讨论

糖尿病影响全球超过5亿名成年人,是一个全球性的公共卫生问题。研究报道,大约三分之一的糖尿病患者经历不同程度的视力下降或失明,由于博士(20.]。因此,博士的治疗是糖尿病研究的焦点。目前,博士的发病机理尚未完全清楚,但被认为是相关的异常视网膜微血管系统,是受多种因素影响21,22]。有越来越多的证据表明炎症的发展是一个重要的贡献者(博士23- - - - - -25]。博士的病人更容易发炎反应,因为高葡萄糖在体内环境,形成一个恶性循环。博士期间的发展,小胶质细胞活化增殖和迁移,从而导致糖尿病视网膜神经退化和微血管循环障碍(26]。博士的一项研究发现,在患者,小胶质细胞积聚在受伤的神经区域和周围的新的和扩大血管,微血管周围炎症的加重(27]。间充质干细胞液,自然分泌纳米囊泡,已经被证明能够有效地降低氧化应激反应和修复肝脏,肾脏和神经损伤患者的肝损伤(28- - - - - -30.]。然而,间充质干细胞的作用机制液小胶质细胞在患者仍然了解甚少,博士和博士的液在临床治疗中的应用目前是有限的。因此,它是非常重要的机制进行深入研究小胶质细胞凋亡诱导BMSC液,可提供实验依据液治疗博士。

在这项研究中,小胶质细胞PCNA bcl - 2水平下降后MBSC exosomal mir - 146 a治疗,而伯灵顿和Capase-3水平增加。此外,mir - 146 a治疗后,肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,il - 6在小胶质细胞减少。肿瘤坏死因子-α是一个由巨噬细胞分泌的小分子蛋白质,其表达受NF -κB信号通路。王等人表明,肿瘤坏死因子的水平α在博士的眼泪病人与疾病的严重程度成正比(31日]。il - 1β主要是由巨噬细胞,促进中性粒细胞的释放从骨髓和本地诱导单核细胞释放溶酶体酶,导致炎症。动物研究表明,注射il - 1β到老鼠玻璃可引起变性的视网膜毛细血管内皮细胞(32]。虽然il - 6, multieffect因素与广泛的功能,可以直接调节各种细胞的生长,促进新血管形成(33]。此外,il - 6产生新血管的形成通过促进血管内皮生长因子的分泌。因此,我们建议mir - 146 a减少小胶质细胞的激活和增殖,增加细胞凋亡。

TLR4 MyD88 / NF -κB是一个经典的炎症信号通路,维护体内炎症因素的平衡。TLR4 TLR4受体可以识别,快速响应入侵身体的危险信号,并激活途径绑定通过MyD88 TLR域(34]。大量积累IkB激酶信号分子介导的复杂,而磷酸化IkB导致蛋白酶降解。反过来,NF -κB二聚体进入细胞核,调节靶基因的表达,从而诱导炎症反应(35]。TLR4 / MyD88 / NF -的监管κB通路报道减少炎症因子的释放,从而减少结肠组织的炎症反应(36]。在其他老鼠实验,TLR4 / MyD88 / NF -的刺激κB在脊髓通路促进il - 1的生产β和肿瘤坏死因子-α,触发一个器官过敏反应(37]。在这项研究中,超表达TLR4的增加细胞活性,增强扩散,减少细胞凋亡。治疗后mir - 146 a,在小胶质细胞TLR4的表达减少,而MyD88和NF -的活性κB增加,这表明,mir - 146 a可以减少TLR4的活动/ MyD88 / NF -κB通路。此外,TLR4的过度扭转的影响mir - 146 -小胶质细胞的增殖和凋亡,减轻炎症小鼠博士。

5。结论

激活小胶质细胞的数量在视网膜上博士的老鼠显著增加,增加了小胶质细胞释放炎性发射器和加剧了视网膜血管损伤。治疗后mir - 146 a,小胶质细胞的增殖能力下降,细胞凋亡增加,而炎症因子水平降低了。进一步调查发现,过度的TLR4增强的细胞增殖、细胞凋亡的减少,减少的MyD88活动和NF -κb .此外,超表达TLR4的逆转mir - 146 a的影响小胶质细胞增殖、细胞凋亡、炎症博士的老鼠。因此,本文认为BMSC exosomal mir - 146 a抑制小胶质细胞的增殖抑制TLR4 / MyD88 / NF -κB通路,促进细胞凋亡,减少炎症因子的释放,最终降低视网膜损伤。

数据可用性

仿真实验数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

曹谷和张Hongjun同样这个工作和co-first作者。

确认

这项研究是由上海自然科学基金(19 zr1456300)和科研项目的长海医院附属于海军军医大学(2018 qnb006)。