文摘

客观的。探索的影响纤维母细胞生长因子3 (FGF3)增殖、细胞周期和细胞凋亡的舌鳞状细胞癌SCC-9细胞系(SCC-9)。方法。我们测量了扩散SCC-9细胞对照组,FGF3干预组和纤维母细胞生长因子(FGFR)抑制剂干预组缩胆囊素八肽(CCK-8)实验。我们研究的影响FGF3舌癌细胞的细胞周期和细胞凋亡使用流式细胞仪。我们进一步探讨IRS1 / PI3K / AKT信号通路通过测量bcl - 2和bcl - 2相关X-protein(伯灵顿)mRNA和蛋白水平与rt - pcr和免疫印迹,分别。结果。CCK-8实验的结果显示,对照组细胞的存活率,FGF3干预组和FGFR抑制剂干预组 , %, 分别为%;SCC-9细胞的存活率在所有三组统计学意义( )。与对照组相比,在G0 / G1期细胞的比例FGFR抑制剂干预组高( )在G2 / M期较低,而FGF3干预组显示相反的结果( )。舌癌细胞的凋亡率显著不同FGFR抑制剂干预和控制之间的组( )。IRS1 mRNA和蛋白表达水平,PI3K和bcl - 2都增加了FGF3干预组( ),而BAX mRNA和蛋白表达水平降低( )。蛋白激酶B的信使rna表达水平(一种蛋白激酶)显示组之间没有差异。p-AKT蛋白过表达,而AKT蛋白的总量保持稳定( )。结论。FGF3有助于SCC-9细胞的增殖增加G2 / M期细胞的比例。因此,恰当的FGF3可能促进肿瘤细胞凋亡的抑制IRS1 / PI3K / AKT信号通路。我们的结果证明FGF3的角色在舌鳞状细胞癌的肿瘤微环境SCC-9细胞并提出新的治疗靶点。

1。介绍

舌鳞状细胞癌是最常见的头颈部恶性肿瘤,和患者预后不良。舌鳞状细胞癌患者容易发生肿瘤复发和转移,影响生活质量(1,2]。因此,治疗有兴趣找到基因影响舌鳞状细胞癌的增殖和细胞凋亡。纤维母细胞生长因子(FGF)是一类结构相关的蛋白多肽和FGF基因家族编码的3]。许多研究已经证实,fgf高度表达的多种肿瘤,如肺癌(4,5),胃癌6],和乳腺癌[7),促进肿瘤的进展。然而,很少有研究报道fgf的角色在细胞癌(8]。在这里,我们发现FGF3 40例舌鳞状细胞癌和对应的相邻组织的免疫组织化学,发现FGF3表达水平高90%在肿瘤和周围组织的12.5% ( )。证明FGF3明显高于在舌癌相对于邻近组织。各种细胞内生物过程监管PI3K / AKT信号通路,包括细胞增殖、凋亡、迁移、和增长;所有这些过程都与肿瘤发生密切相关。本研究旨在探索FGF3对舌鳞状细胞癌的影响和在理解FGF3的作用在疾病的发展提出新的目标口腔恶性肿瘤的诊断和治疗。

2。材料和方法

2.1。材料

人舌鳞状细胞癌细胞SCC-9购自上海Yaji生物技术有限公司有限公司;胎牛血清(的边后卫)从上海Ikesai生物制品有限公司有限公司;CCK-8细胞增殖/毒性检测设备从北京Quanshijin生物技术有限公司有限公司;膜联蛋白V PE / 7 aad工具包和π/核糖核酸酶染色缓冲区从Becton,迪金森和公司在美国;人类FGF-3蛋白质从研发系统在美国,PD173074 (FGFR抑制剂)MedChemExpress在美国;并从Abcam初级和二级抗体在美国。

2.2。细胞的准备

人舌鳞状细胞癌SCC-9细胞生长在杜尔贝科的修改鹰介质high-glucose介质penicillin-streptomycin抗生素和10%的边后卫和生长在37°C公司为5%2。confluency当细胞达到70%至85%,他们消化和通道,对数生长期的细胞用于后续实验。

2.3。制备FGF3干预

SCC-9细胞达到90% confluency被播种 细胞/毫升96 -孔板完全培养基(100μ信用证或者 细胞/)。培养后37°C和5%的公司224小时坚持良好的媒介是丢弃,四组设置:空白对照组和三个其他组织,100年μL FGF3溶液在不同浓度(10、50和100 ng / ml)是补充道。每组有5复制和3集合时间点(24小时、48小时和72小时)。总共有100μ包括10 L完全培养基μL CCK-8试剂添加到每个好,和细胞培养1 h。光密度(OD)在450 nm使用标仪测量。分析数据,我们计算SCC-9细胞的存活率的三种不同浓度下FGF3在三个不同的时间点。

2.4。组和干预措施

在对照组,SCC-9细胞培养72 h。在FGF3干预组,他们培养了72 h和100 ng / ml FGF3介质。FGFR抑制剂干预组,他们培养了72 h和100海里FGFR抑制剂PD173074介质。

2.5。细胞增殖实验

SCC-9细胞培养high-glucose介质溶液中含有的边后卫和penicillin-streptomycin抗生素和体外测试。SCC-9单细胞悬浮体( 细胞/毫升)在96孔板接种。细胞被安置在孵化24小时允许细胞粘附,细胞和组织准备如上所述。总共有100μCCK-8 L中含有10%的解决方案是添加到细胞,细胞培养1 h和450海里的OD使用标仪测量。SCC-9细胞的存活率计算不同浓度下FGF3干预组。

2.6。细胞周期分析

细胞每组使用胰蛋白酶消化和洗磷酸盐(PBS)。细胞被resuspended在500年μL(预冷PBS,添加到3.5毫升预冷的80%乙醇,一夜之间被固定在4°C。细胞颗粒状在2000转离心5分钟。上层清液被丢弃,在PBS和细胞被洗了两次,每次都浮在表面的丢弃。细胞被resuspended在500年μL(π/核糖核酸酶染色缓冲区,经过200 -网格尼龙单细胞悬液,并在4°C孵化在黑暗中30分钟。流式细胞分析仪是用于检测红色荧光的激发波长488 nm和测量光散射。细胞DNA含量和光散射进行了分析。

2.7。细胞凋亡检测

细胞培养介质是吸气,附着在PBS洗两次,使胰蛋白酶化,在1000转离心5分钟。上层清液被丢弃,细胞与预冷PBS洗两次,每次洗后与上层的丢弃。准备单细胞悬浮体,500年μL ( 被添加到细胞,和悬浮液过滤200 -孔筛。总共5μL膜联蛋白V-PE和10μL 7-AAD被添加到每个小组,样本在黑暗中轻轻混合,放置在4°C 10分钟。细胞凋亡率SCC-9细胞后,流式细胞仪检测30分钟。

2.8。rt - pcr检测mRNA

利用rt - pcr检测IRS1, PI3K (PIK3CA),一种蛋白激酶,bcl - 2,和伯灵顿基因在空白,FGF3干预,FGFR抑制剂干预组,肌动蛋白作为内部参考。使用的引物如表所示1。目标基因的相对表达水平表示为2−ΔΔCt。

表1
列表用于rt - pcr引物。
2.9。免疫印迹

后组细胞准备如上所述,细胞离心,收集上层的丢弃,和细胞洗后用5毫升无菌PBS。抗体的浓度1:使用1000年。提取总蛋白、变性和sds - page分离,转移到膜上。膜被封锁和孵化一夜之间在初级抗体溶液然后孵化二级抗体溶液获得的表达目标蛋白质。实验重复三次,结果是加工ImageJ使用β肌动蛋白是一个积极的控制。

2.10。统计分析

数据预处理在Excel中,分类变量表示为频率(%)和连续变量表示为(标准差(SD))或中位数(四分位范围(差))。一个 测试被用于多个组之间比较差异,和卡方测试被用来分析分类数据。一组统计显著性水平为0.05。所有在SPSS统计分析软件20.0版。

3所示。结果

3.1。测定FGF3浓度和时间

100 ng / ml的FGF3浓度72 h的选择是基于SCC-9细胞生长曲线和结果SCC-9细胞存活率(图1)。


图1
影响纤维母细胞生长因子3 (FGF3)干预鳞状细胞癌的增殖SCC-9细胞系(SCC-9)细胞在不同时间点(100×)。注意: 而FGF3 (0 ng / mL), ;#与FGF3 (10 ng / mL), ;&而FGF3 (50 ng / mL), 。 。
3.2。FGF3对SCC-9细胞的增殖的影响

CCK-8化验的结果显示,对照组细胞的存活率,FGF3干预组和FGFR抑制剂干预组 ,分别。基于之间的细胞存活率的比较FGF3 FGFR抑制剂之间的干预组和对照组,干预组和对照组,我们发现低表达FGF3抑制舌癌细胞(扩散 )。这些结果表明,FGF3促进舌癌细胞的扩散(图2)。


图2
缩胆囊素八肽(CCK-8)分析确定影响纤维母细胞生长因子3 (FGF3)鳞状细胞癌的增殖SCC-9细胞系(SCC-9)细胞(100 x)。注意: 与对照组相比, ; 。
3.3。FGF3对SCC-9细胞周期和细胞凋亡率的影响

的影响FGF3 SCC-9细胞周期和凋亡率评估使用流式细胞仪。的比例在G0 / G1期细胞FGF3干预组低于对照组( ),和G2 / M期细胞的比例高于对照组( )。的比例在G0 / G1期细胞FGFR抑制剂干预组高于对照组( ),和在G2 / M期细胞的比例低于对照组( )(图3(一个))。细胞凋亡率在对照组,干预组FGF3, FGFR抑制剂干预组 %, %, 分别为%。无显著差异被发现在SCC-9细胞的凋亡率FGF3干预组和对照组( ),虽然SCC-9细胞的凋亡率FGFR抑制剂干预组明显高于对照组( )。这些数据表明,低表达FGF3促进舌鳞状细胞的凋亡和FGF3抑制细胞凋亡的SCC-9(图3 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
纤维母细胞生长因子3 (FGF3)对细胞周期(a)和(b)细胞凋亡率的鳞状细胞癌SCC-9细胞系(SCC-9)细胞用流式细胞术。注意: 与对照组相比, ; 。
3.4。激活FGF3 SCC-9 PI3K / AKT通路
3.4.1。rt - pcr检测结果

与对照组相比,IRS1的信使rna表达水平,PI3K和bcl - 2 FGF3干预组的增加( ),伯灵顿(减少 ),和AKT没有显著差异。FGFR抑制剂干预组,信使rna表达水平PI3K和bcl - 2减少( ),而伯灵顿增加了( ),还有IRS1和AKT(图中无显著差异4)。


图4
分析每个基因的mRNA水平每组的细胞。注意: 与对照组相比, ; 。
3.5。免疫印迹结果

与对照组相比,bcl - 2蛋白表达IRS1, PI3K和FGF3干预组的增加( ),和伯灵顿表达下降( )。FGFR抑制剂干预组,IRS1蛋白表达下降( ),PI3K和bcl - 2蛋白水平显示出下降的趋势,和伯灵顿蛋白表达增加( )。虽然p-AKT水平没有变化,p-AKT蛋白质的表达显示一个下降的趋势(图5)。


图5
免疫印迹检测每组中表达不同的蛋白质。注意: 与对照组相比, ; 。

4所示。讨论

舌癌容易局部复发和区域淋巴结转移,与高度恶性肿瘤对患者预后不良。了解舌癌细胞的增殖和细胞凋亡的机制可以指导预防和治疗。FGF家族由22配体。FGF11-14被称为细胞内的fgf,因为他们并没有激活FGFRs FGFRs独立和功能。剩下的fgf依赖FGFRs (FGFR1、FGFR2, FGFR3和FGFR4)产生生物效应。结合配体受体可以促进受体二聚作用和激活下游信号通路,包括RAS / MAPK和FRS2 / PI3K / AKT,等等(9- - - - - -12]。FGF3函数绑定到FGFR1和FGFR2受体。FGFR抑制剂(PD173074)能有效地抑制FGFR1-3受体,从而阻止FGF3下游的影响(13]。

一些研究表明,FGF3参与恶性肿瘤的增殖和迁移。然而,很少有研究关注FGF3和口腔鳞状细胞癌的扩散。体内和体外张等人的研究显示,击倒的FGF3结肠癌HT-29细胞显著减慢结肠癌细胞的迁移与对照组相比。他们观察到FGF3击倒老鼠的肿瘤体积明显小于对照组。此外,击倒FGF3抑制结肠肿瘤的生长。在目前的研究中,我们过表达和抑制FGF3舌鳞状细胞癌的细胞。从我们的功能实验结果表明,高表达水平的FGF3促进舌癌扩散,符合FGF3其他恶性肿瘤的作用。我们的数据表明,FGF3促进SCC-9舌癌细胞的增殖。

黄等人的以前的工作表明,在结肠癌HT-29细胞,当FGF3抑制由质粒向量,G0 / G1期的比率和G2 / M期明显改变,和更多的被封锁在G2 / M期细胞。与untransfected组相比,在S期细胞的数量明显减少。我们的研究表明,FGF3也显著改变在G0 / G1期细胞的比例和G2 / M期。与对照组相比,G0 / G1期细胞的比例在FGF3干预组较低( ),和G2 / M期细胞的比例较高( )。的比例在G0 / G1期细胞FGFR抑制剂干预组高于对照组( ),和G2 / M期细胞的比例低于对照组( )。这些数据表明,FGF3参与调节细胞周期的舌癌SCC-9细胞。

一些研究表明,治疗结肠癌HT-29细胞的凋亡率为0.22%,但随着FGF3抑制,这变成了3.88%,这表明抑制FGF3可以显著促进肿瘤细胞凋亡。我们目前的研究还表明,抑制FGF3可能增加肿瘤细胞凋亡。阐明如何FGF3调节肿瘤细胞凋亡,我们进一步研究了IRS1 / PI3K / AKT信号通路。IRS1基因表达水平表明mRNA表达增加,PI3K和bcl - 2 FGF3干预组( )。伯灵顿mRNA的表达水平降低( ),并没有显著差异AKT mRNA的表达水平。分析蛋白表达水平表明,IRS1 PI3K和bcl - 2增加FGF3干预组( ),和伯灵顿蛋白质表达水平降低( )。在缺乏AKT蛋白总量的变化,p-AKT蛋白表达增加( ),表明FGF3可以促进一种蛋白激酶的磷酸化蛋白质。总之,这些结果表明,细胞凋亡可能是受IRS1 / PI3K / AKT信号通路。proangiogenic因素,fgf是由肿瘤细胞和巨噬细胞或释放细胞外基质和行为在一个自分泌或旁分泌的方式(14]。然而,需要进一步的研究来确定FGF3参与舌鳞状细胞癌的发病机理。

这项研究的结果表明,FGF3促进舌癌的增殖SCC-9细胞,增加细胞的比例在G2 / M期。抑制FGF3能促进肿瘤细胞凋亡,机制可能是通过IRS1 / PI3K / AKT信号通路。FGF3参与发生、发展和舌癌的致病过程。这些结果提供了一种新颖的目标的精确治疗舌癌的作用机制,需要进一步的研究。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有任何利益冲突。