文摘

客观的。为膀胱癌症治疗提供新的见解通过研究微- 143 - 3 - p / TBX3轴。方法。差异表达microRNA在膀胱癌提供的数据库找到微rna可能调节TBX3。存在是用来测试TBX3 mRNA水平和微- 143 - 3 - p。他们的结合是dual-luciferase方法验证。恶性肿瘤细胞的行为被细胞功能实验研究。TBX3的蛋白质含量和蛋白质相关epithelial-mesenchymal过渡(EMT)被免疫印迹检测。结果。TBX3膀胱癌细胞中高度表达。微rna - 143 - 3 - p与TBX3最明显负相关,和结合位点。细胞功能实验证明TBX3促进膀胱癌细胞功能和EMT。微rna - 143 - 3 - p证明表达下调TBX3表达式。救援分析进一步阐明,微rna - 143 - 3 - p抑制膀胱癌细胞功能和EMT通过下调TBX3表达式。结论。这些数据都表明,TBX3调制的微rna - 143 - 3 - p和作为一个癌症启动子基因在膀胱癌发展通过影响肿瘤的增殖、迁移、入侵、EMT。因此,微rna - 143 - 3 - p / TBX3网络膀胱癌的可能是一个潜在的目标。

1。介绍

膀胱癌是泌尿系统的常见恶性肿瘤1]。Nonmuscle浸润膀胱癌包含最重要的是膀胱癌症病例(70% - -80%),显示了良好的预后2]。尽管如此,肌肉浸润膀胱癌显示了一个可怕的治疗效果,和复发率高3]。一般来说,膀胱癌病人存活很短的中位数(10 55个月)。患者的不良预后通常结果从远处转移和复发4,5),而epithelial-mesenchymal过渡(EMT)促进膀胱癌细胞的侵袭性和活动(6,7]。因此,它是至关重要的定义的功能机制转移的早期阶段,如移民、入侵、EMT。

T-box蛋白质家族由一群进化保守基因的转录因子调节水平(8]。他们工作作为调节EMT转录抑制剂或活化剂,组织完整性和细胞分化[9- - - - - -11]。Overexpressing T-box TBX3等因素和TBX2可能引发癌症12- - - - - -16),这两个转录因子激活黑素瘤(17,18和膀胱癌19,20.),是肿瘤发生和迁移(证明是必要的20.,21]。此外,以往的研究表明,TBX3表达促进肿瘤EMT TBX3 upregulation直接抑制粘附分子钙粘蛋白表达,从而增加黑色素瘤的侵略性22]。钙粘蛋白是一种重要的媒介和信息交互,验证在EMT是重要的,和损失的钙粘蛋白是EMT发生的最重要的标志(23]。TBX3证明促进增殖和入侵和抑制大鼠膀胱癌细胞的凋亡24]。明显表示TBX3函数作为一个底层指标膀胱癌诊断和/或预后[19]。一个有趣的调查也支持这个结果通过识别TBX3 / TBX2作为主要的有利标志pTaG1/2膀胱癌(25]。所有这些数据的重要性,注重TBX3作为一个潜在的生物标志物。尽管如此,TBX3如何运行在膀胱癌的恶性进展一直不知道。

TBX3被预测为目标的微rna - 143 - 3 - p通过生物信息学方法。因此,该调查涉及微rna - 143 - 3 - p / TBX3膀胱癌和异常表达在肿瘤生物功能的影响。我们的结果可能奠定基础寻找潜在的膀胱癌的分子治疗靶点。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类膀胱癌细胞株T24 (BNCC311582) - 87 (BNCC100982),国际和人类膀胱上皮细胞永生化细胞系SV-HUC-1 (BNCC100273)买了从希伯来文名字文化集合(BNCC)(中国)。人类膀胱癌细胞系UMUC3写明ATCC®(crl - 1749™)是美国类型文化集合(写明ATCC)(美国)。T24和国际- 87细胞系rpmi - 1640年治疗中加上10%胎牛血清的边后卫。UMUC3细胞系是放置在DMEM 10%的边后卫。SV-HUC-1 CM7-1中包含培养 。所有的细胞系培养在温度孵化器有限公司为5%2在37°C。

2.2。建筑的向量和转染的细胞

微rna - 143 - 3 - p模仿,模仿数控,si-TBX3, si-NC, oe-TBX3, oe-NC由广州RiboBio设计的。Lipofectamine 2000(热费希尔科学,Inc .)应用于瞬变把合成序列或质粒转染膀胱癌T24细胞或国际- 87。细胞培养在相应的媒体公司为5%2在37°C使用。瞬时转染前,所有细胞培养至少24小时,需要用磷酸盐(PBS) (pH值7.4)。

2.3。中存在

从细胞总RNA分离使用试剂盒工具包(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。RNA浓度是2000年由NanoDrop系统(热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)。设备指令后,miScript IIRT工具包(美国试剂盒)被用来反对地抄写小分子核糖核酸互补,相反和mrna转录成cDNA利用PrimeScript RT大师混合(豆类生物有限公司、大连、公关中国)。miScript SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒、德国)是用于检测微rna表达和SYBR®预混料交货Taq™II(豆类生物有限公司、志贺、日本)应用于检测mRNA的表达。存在应用生物系统公司进行®7500实时PCR系统(热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,MA)。表1提供了使用的引物都是购自Sangon生物技术(上海,中国)。U6,β肌动蛋白的内部引用作为微rna - 143 - 3 - p和TBX3,分别。之间的差异相对表达组相比,2- - - - - -ΔΔCt价值。

表1
存在引物列表。
2.4。免疫印迹分析

细胞细胞溶解radioimmunoprecipitation分析缓冲区(Sigma-Aldrich)含有蛋白酶抑制剂。总蛋白测定bicinchoninic酸(BCA)方法(Sigma-Aldrich)。蛋白质分离通过10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳,然后转移到一个聚偏二氟乙烯膜(Sigma-Aldrich)。被屏蔽后5%脱脂牛奶在室温下1 h,一夜之间膜是孵化主要抗体。主要抗体是兔子anti-TBX3(1: 1000年,ab154828 Abcam,英国),兔子anti-E-cadherin(1: 10000年,ab40772 Abcam,英国),兔子anti-N-cadherin(1: 5000年,ab76011 Abcam,英国),兔子anti-Vimentin(1: 1000年,ab92547 Abcam,英国),和兔抗β肌动蛋白(1:1000,ab8227 Abcam,英国)。洗后用PBS渐变20 3次(每次10分钟),膜与二次抗体反应山羊anti-rabbit免疫球蛋白g h和l加上辣根过氧化物酶(合)(英国Abcam ab205718)在室温下1 h。增强化学发光(Solarbio,北京)的发展了。分析使用的凝胶成像仪(美国Bio-rad凝胶Doc XR)和灰度值被ImageJ处理。

2.5。细胞计数工具包(CCK -) 8和集落形成试验

在CCK-8, 转染肿瘤细胞被放在96 -孔板与每个(100μl介质)。在0、24、48、72和96 h, 10μl CCK-8 (Dojindo、东京、日本)添加另一个1 h的孵化。吸光度测量标在450海里。

集落形成试验,转染膀胱癌细胞接种到6-well板块在每个(1×104)细胞。接下来,每个细胞培养在2毫升中一个星期。之后,细胞与PBS洗两次,用4%多聚甲醛和0.1%结晶紫为20分钟。 (直径:0.3 mm - 1毫米)被定义为殖民地。

2.6。迁移和入侵的检测

细胞迁移和入侵检测通过Transwell细胞迁移室和BioCoat Matrigel-coated Transwell细胞入侵室(美国纽约康宁)。转染24小时后,T24或国际- 87细胞悬浮在200年μ无血清培养基。细胞悬液添加到参议院,众议院在500年覆盖着μl rpmi - 1640含15%的边后卫。此后,在37°C细胞孵化24 h。接下来,细胞在参议院被移除。细胞在众议院接受4%的多聚甲醛固定和0.5%结晶紫染色。5随机选择领域的显微镜下(100 x),迁移和入侵细胞,分别统计。

2.7。Dual-Luciferase记者检测

确定之间的绑定微rna - 143 - 3 - p和TBX3 3 - - - - - -UTR,突变体(傻瓜)(通过网站突变),和野生型(WT) TBX3 3 - - - - - -UTR构造。其次,序列插入psiCHECK荧光素酶报告质粒(Sangon有限公司、上海、中国)。接下来,膀胱癌细胞(T24)接种在48-well盘子和培养24小时的37°C。T24细胞转染与微rna - 143 - 3 - p模仿或模拟数控和WT / MUT-TBX3质粒。最终,通过荧光素酶测定荧光素酶活性测定工具包(美国WI Promega,菲奇堡)。

2.8。统计分析

数据表现出的 (SD)和加工利用GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad Inc .)、圣地亚哥、钙、美国)。分析了两组之间的差异 - - - - - -测试和分析了以上两组间方差分析。所有独立实验重复3次。 被定义为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。TBX3明显膀胱癌中高度表达

结合参考分析,TBX3超表达是许多癌症相关,如肝癌、胰腺癌、卵巢癌和头颈部鳞状细胞癌(26]。然而,很少报道的机制TBX3调节膀胱癌症,因此,我们选择TBX3进行研究。基本T24 TBX3水平、国际- 87 UMUC3, SV-HUC-1先测试。是公布TBX3癌细胞的表达高于正常细胞在信使rna和蛋白质水平(数字1(一)和1 (b))。因此,我们认为TBX3在膀胱癌显著调节。T24 - 87国际细胞有显著的差异TBX3表达式被用于以下实验。

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图1
在膀胱癌TBX3明显高。(a)中存在检测TBX3 mRNA的表达。(b)免疫印迹检测TBX3蛋白质表达水平。所有的实验进行了一式三份,结果被表示为 。统计学意义是什么时候 表示 , 表示 ,和 表示 。
3.2。TBX3促进膀胱癌细胞增殖、迁移、入侵、EMT

自TBX3明显高表达在膀胱癌细胞中,这部分是旨在验证其对膀胱癌细胞的生理功能的影响。与TBX3细胞低表达和TBX3高表达是由瞬时转染si-TBX3 (si-NC控制)成T24细胞和oe-TBX3 (oe-NC控制)为国际- 87细胞,分别。检测转染效率(图中存在应用2(一个))。CCK-8和集落形成试验表明,沉默TBX3显著抑制T24细胞增殖,而中TBX3促进- 87细胞增殖(国际数据2 (b)和2 (c))。

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图2
TBX3促进EMT在膀胱癌和细胞功能。(a) TBX2 T24细胞转染效率和si-NC国际- 87细胞,si-TBX3, oe-NC, oe-TBX3组。(b) CCK-8试验表明,沉默TBX3显著抑制T24细胞生存能力,而中TBX3促进国际- 87细胞的可行性。(c)集落形成试验表明,沉默TBX3显著抑制T24细胞增殖,而中TBX3促进国际- 87细胞增殖。(d) Transwell化验建议拒绝TBX3表达抑制T24细胞迁移和入侵,而中TBX3增加国际- 87细胞迁移和入侵(100 x)。波形蛋白,(e)免疫印迹检测TBX3 N-cadherin,粘附在每个转染组蛋白表达。 表示 , 表示 ,和 表示 。

开展后续的分析来确定TBX3癌症入侵和迁移的影响。Transwell试验表明,拒绝TBX3表达抑制T24细胞迁移和入侵,而中TBX3增加国际- 87细胞迁移和入侵(图2 (d))。此外,EMT-related蛋白质在不同转染组的免疫印迹。钙粘蛋白水平增加而减少N-cadherin和波形蛋白在si-TBX3-transfected T24细胞,和TBX3-overexpressed国际(图- 87细胞表现出相反的情况2 (e))。

3.3。微rna - 143 - 3 - p会使TBX3表达式

进一步确定TBX3如何影响膀胱癌的恶性进展,我们预测它的上游小分子核糖核酸。预测小分子核糖核酸的生物信息学数据库与差异表达的小分子核糖核酸(DEmicroRNAs) TCGA收购候选小分子核糖核酸(图73(一个))。之后,进行了相关分析7小分子核糖核酸和TBX3,显示,微rna - 143 - 3 - p与TBX3最显著负相关(图3 (b))。同时,它是预测,结合位点(图3 (c))。dual-luciferase方法证实,微rna - 143 - 3 - p WT TBX3 3的超表达荧光素酶强度下降 - - - - - -UTR记者质粒,暗示他们的直接绑定(图3 (d))。之后,发现存在明显微rna - 143 - 3 - p含量低(图在癌症细胞3 (e))。此外,我们构建的微rna - 143 - 3 - p过表达T24细胞和数控T24细胞。TBX3表达两组比较。结果显示,TBX3信使rna和蛋白质水平微rna - 143 - 3 - p模仿转染T24细胞显著下调(数字3 (f)和3 (g))。总体而言,微rna - 143 - 3 - p不表达在膀胱癌与TBX3消极监管的关系。

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图3
微rna - 143 - 3 - p降低TBX3表达式。(a)的表达下调microrna在膀胱癌和小分子核糖核酸与TBX3结合位点。磨边机软件使用( , )差分析。七个小分子核糖核酸。(b) 7小分子核糖核酸和TBX3之间的相关分析。(c)两个基因之间的结合位点。(d)微rna - 143 - 3 - p TBX3目标绑定。(e)中存在检测微rna - 143 - 3 - p的表达水平。(f)微rna - 143 - 3 - p过度抑制TBX3 mRNA的表达。(g)微rna - 143 - 3 - p超表达拒绝TBX3蛋白质表达水平。 表示 , 表示 ,和 表示 。
3.4。微rna - 143 - 3 - p限制EMT通过TBX3中介和细胞功能

在上述背景下,我们证实微rna - 143 - 3 - p可能下调TBX3表达式。此后,进一步审视微- 143 - 3 - p / TBX3轴,我们安排救援化验。微rna - 143 - 3 - p模拟是利用恢复TBX3表达式(图4(一))。所揭示的CCK-8和集落形成方法,超表达仅TBX3明显刺激肿瘤细胞增殖和集落形成,而overexpressing和微rna - 143 - 3 - p同时能够抵消这种促进影响(数据4 (b)和4 (c))。Transwell也证明了微rna - 143 - 4 - p导致减少TBX3-triggered癌细胞迁移和入侵(图4 (d))。仅基于免疫印迹,TBX3过度钙粘蛋白表达下降而提高波形蛋白和N-cadherin表达,暗示这些上皮细胞获得间充质属性。然而,这些属性是由微rna - 143逆转3 - p模拟(图4 (e))。完全,microrna - 143 - 3 - p抑制膀胱癌细胞功能和EMT通过下调TBX3。

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图4
微rna - 143 - 3 - p压制EMT在膀胱癌和细胞功能通过抑制TBX3表达式。(a)中存在检测TBX3 mRNA表达在每组。(b) CCK-8发现癌细胞生存能力在每个转染组。(c)集落形成实验检测肿瘤细胞增殖。(d) Transwell试验检测细胞迁移和入侵(100 x)。(e)免疫印迹检测TBX3 EMT-related蛋白质表达水平在每个转染组的肿瘤细胞。 表示 , 表示 ,和 表示 。

4所示。讨论

肿瘤侵袭转移是一个非常复杂的过程,涉及许多基因和步骤(27]。EMT是肿瘤转移的重要行为之一(28,29日]。EMT是一个生物过程,大大增加恶性肿瘤的浸润和转移30.]。EMT主要发生在上皮细胞癌症,因此,它也调节膀胱癌。在这种背景下,我们研究了分子生物标志物,可以帮助我们进一步了解膀胱癌的转移和入侵。

有研究证明,TBX3不同调节在膀胱癌20.]。TBX3表示在任何类型的组织在胚胎发育和功能作为一个转录抑制剂(31日]。TBX3也参与各种致癌过程,如增殖、迁移和入侵32- - - - - -34]。此外,TBX3 EMT(密切相关35]。TBX3可以通过刺激EMT促进乳腺癌细胞蔓延前的进展和移植蛞蝓35]。TBX3表达水平是调节在许多癌症,但大多数引用关注乳腺癌而不是膀胱癌(36- - - - - -38]。因此,TBX3选择进行研究。EMT-related蛋白质表达水平和细胞生物学行为被发现通过免疫印迹和细胞功能实验,结果验证了促进TBX3膀胱癌细胞迁移,入侵,EMT。这表明一个好的协议上面的实验和引用,TBX3作为发起人和相关EMT膀胱癌。

进一步确定TBX3调节膀胱癌症恶化,我们预测其上游microRNA并进行相关分析。最后,微rna - 143 - 3 - p的结合位点,并与TBX3负相关。微rna - 143 - 3 - p影响各种癌症的发展作为一个肿瘤抑制(39]。微rna - 143 - 3 - p表达式是非常低,抑制细胞增殖在结肠癌40]。在乳腺癌,microrna - 143 - 3 - p是低表达,抑制乳腺癌的增殖,促进细胞凋亡41]。在膀胱癌中也发现了类似的现象。SNHG1能够从内部骗取微rna - 143 - 3 - p在膀胱癌细胞的细胞质影响细胞增殖和运动能力42]。同样,我们证明了微rna - 143 - 3 - p明显更少的表达和抑制TBX3表达式在膀胱癌实验。此外,救援分析进一步提出,微rna - 143 - 3 - p过度表达下调TBX3表达式来调解癌细胞迁移,入侵,EMT。EMT允许配备癌细胞间充质属性逃离原发肿瘤(43]。钙粘蛋白介导信号转导化合物,损失的不良预后的临床指标和转移(27]。提出,微rna - 143 - 3 - p / TBX3轴阻碍EMT阻碍膀胱癌迁移和入侵。首次验证了这样的分子机制。

在上面,微- 143 - 3 - p / TBX3轴与膀胱癌迁移密切相关,侵略,EMT就是明证生物信息学、分子、细胞分析。在未来,我们打算进一步证实我们发现动物和临床试验,希望提供更坚实的和完善的理论支持膀胱癌诊断和治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称他们没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

所有作者导致数据分析、起草和修改文章;最终批准的版本发布;并同意负责所有方面的工作。所有作者同意提交出版的手稿。

确认

本研究从台州科技支持的资金局+ 1801 ky76类。