文摘

背景。肝细胞癌(HCC)是世界上人类死亡的重要原因。最近,发现咪达唑仑可以调节大鹏参与HCC进展。这个研究项目旨在阐明咪达唑仑的影响和mir - 217肝癌细胞转移和细胞凋亡。方法。人类肝癌细胞菌株(Hep3B和SK-HEP-1)选择和干预咪达唑仑在我们研究不同浓度。mir - 217 -抑制剂干预两个肝癌细胞株,观察细胞迁移的变化,侵袭性和细胞凋亡。mir - 217水平在肝癌细胞被反向transcription-quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)。结果。咪达唑仑浓度也升高,Hep3B SK-HEP-1异常更明显抑制。10μ克/毫升浓度被选为分析因为Hep3B和SK-HEP-1 IC50 10.57μ和9.35克/毫升μ分别g / m。存在结果显示mir - 217肝癌细胞的减少,这是增强尤其是咪达唑仑干预。与空白组相比,侵袭性和迁移(Transwell化验)mir - 217 -抑制剂转染肝细胞明显增强,细胞凋亡率(流式细胞术)明显降低。结论。咪达唑仑可以上调mir - 217肝癌细胞,从而抑制肝癌细胞转移和细胞凋亡。

1。介绍

肝癌(LC)是一种普遍的胃肠道恶性肿瘤(1]。根据调查,每年有超过800000人被诊断为LC和700000死亡2]。蔓延前的肝癌是由肝细胞癌(HCC),胆管癌,混合的主要癌肝脏。临床上,肝癌是信用证的主要类型,占总额的90%信用证情况下(3]。已经取得了一些进展的临床治疗肝细胞癌(4- - - - - -6]。手术与化疗治疗肝癌临床是一个重要的意思,然而,仍然会导致失望5年生存在一些病人7]。鉴于早期HCC的典型临床表现和大多数患者得到及时治疗的失败源于早期诊断肝癌的流行率低8],迫在眉睫的是发现肝癌的潜在治疗靶点,探讨其具体机制。

小分子核糖核酸(大鹏)小,高度保守的非编码RNA分子参与基因表达的调控。大鹏有年龄在18岁至25岁之间的核苷酸,19-25 base-long高度保守的内生非编码发夹核苷酸成绩单。大鹏与靶基因结合的3 UTR通过互补配对,从而降低或抑制靶基因表达(7]。mir - 217,位于2 p16.1人类染色体,microrna是抑制细胞增殖有抑制作用的增长和发展各种不同细胞(9,10]。Downregulation mir - 217减轻动脉粥样硬化的针对sirtuin蛋白1 (11]。和mir - 217还能抑制内皮细胞凋亡针对胞内氯4频道(12]。microrna与减少炎症(13]。由于恶性肿瘤也与炎症有关14)mrna的有益影响癌症可以降低降低炎症负担在肿瘤微环境15]。它已经表明,mir - 217密切与肿瘤细胞的增殖和迁移16]。例如,在研究朱et al ., mir - 217可以抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭性通过调制MAPK1 [17]。另一个研究发现,低mir - 217表达肝细胞癌减少肝癌细胞增殖和抑制细胞凋亡18]。咪达唑仑(MZ),镇静剂和麻醉剂诱导物广泛应用于临床,是苯二氮的导数。在动物实验中,MZ报道损害动物的运动能力和导致肌肉松弛19]。据报道,在最近,MZ诱导细胞凋亡在人类癌症细胞和阻止肿瘤生长在异种移植小鼠20.),以及调节大鹏(21]。尽管如此,没有研究来验证MZ是否能抑制肝癌细胞和调节mir - 217。

因此,本研究主要探讨了MZ对肝癌细胞生长和发展的影响,进一步探讨可能的监管MZ和mir - 217之间的联系。

2。方法和材料

2.1。细胞来源

37°C和5%的公司2孵化器,Hep3B SK-HEP-1人类肝细胞肝癌细胞株和THLE-2行写明ATCC(维吉尼亚州,美国)所提供的都是沉浸在10% FBS-containing EMEM (Gibco)文化。细胞被转移到新的培养基时每两天,通过细胞融合了80 - 90%。细胞对数生长期后观察2 - 3次文化进行进一步的研究。

2.2。细胞处理

对数增长逐步Hep3B和SK-HEP-1选择使用Lipofectamine 2000转染试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)。mir - 217的抑制剂和空白控制提供GenePharma(苏州、中文)。转染是2000 Lipofectamine Opti-MEM(表达载体,卡尔斯巴德,CA) 100 pmol mir - 217 -抑制剂或控制当细胞融合到大约60%。Hep3B和SK-HEP-1收获转染后24 - 48 h。

2.3。分组

MZ从罗氏公司购买,瑞士巴塞尔。根据实验要求,肝癌细胞在不同浓度被MZ干预。的半抑制浓度(IC50) 10μg / mL被选为最优浓度实验干预研究之间的联系MZ, mir - 217和肝细胞癌。我们进一步将两组细胞分成八组,即空白组(细胞进行没有任何治疗),MZ, mir - 217 -抑制剂组和MZ + mir - 217 -抑制剂集团进一步观察细胞生理功能改变。

2.4。中存在的实验

细胞被试剂盒提取的总RNA(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。OD值和RNA浓度测定的紫外光谱和NanoDrop2000(热费希尔科学、马);RNAA260 nm / A280 nm的价值在1.8和2.0之间表明RNA纯度。由北京Transgen,提供中文,TransScript绿色microrna的两步中存在SuperMix (AQ202-01)被用来reverse-transcribe提取的总RNA所指示的设备说明。PCR扩增实验的合成cDNA收集。(20 qPCR放大系统μL)是由1μ0.4 L的cDNA、μL上游和下游引物,10μL (2 x TransTaq®尖端绿色qPCR SuperMix, 0.4μL被动参考染料(50 x)和适当的ddH240 o . qPCR放大参数(周期):94°C, 30年代;94°C, 5 s;60°C, 30年代。样品和复制被设定在1:3,一式三份的测试运行。感觉和反义底漆mir - 217和U6 5 - - - - - -TACTCAACTCACTACTGCATCAGG-3 ,5 - - - - - -TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3 ,和5 - - - - - -CGCTTCGGCAGCACATATAC-3 ,5 - - - - - -CAGGGGCCATGCTAATCTT-3 。数据分析是由2- - - - - -ΔΔct(22]。

2.5。MTT检测

细胞与胰蛋白酶消化,沉浸在DMEM(10%的边后卫)细胞悬液做准备。然后,细胞( 细胞/毫升)种植在96 - 100孔板μL细胞悬液/。24小时后的主要媒介是丢弃的种植,但取而代之的是90年μL空白细胞培养基/好,5、10和20μg / mL MZ,分别。接种细胞培养在37°C 4 h和培养10μ5-dimethylthiazol-2-yl g[3 -(4日)2、溴化5-diphenyltetrazolium] (MTT)解决方案4 h。计算光密度(OD)值在450海里每组进行比较MTT值。在确定的最佳浓度MZ影响HepG2细胞,进行后续实验。

2.6。Transwell检测

Transwell试验被用来评估每组细胞侵袭性的变化和迁移。侵袭性实验:在无菌24-well盘子,每个Transwell室与100年了μL基底膜基质(稀释与预冷高糖DMEM(血清)1:10)24小时的培养在37°C。转染的细胞悬液稀释了FBS-containing介质无血清培养基和10%,分别。这时,一个细胞悬液( 细胞/毫升,与无血清培养基稀释)放入顶舱,和600年μL (10% FBS-containing介质放入基底外侧区域文化在一个孵化器。24小时后,这些细胞被处理的多聚甲醛(4%)固定20分钟,结晶紫染色(0.1%),和两个用清水冲洗。最后,在显微镜下观察细胞的侵袭性。迁移测试基本上是一样的侵袭性测试除了Transwell没有添加人工基底膜。在显微镜下八个随机领域选择(放大:×200)细胞计数,入侵和迁徙细胞在每组平均。

2.7。细胞凋亡检测

细胞凋亡检测使用pi染色,前面描述的方法(23]。短暂,收集细胞转染48 h后然后用胰蛋白酶消化了 ,其次是一夜之间固定在4°C与预冷乙醇(70%)。然后他们被种植在37°C水浴与核糖核酸酶混合后30分钟(10μg / mL),然后在4°C培养后30分钟的π(最终浓度10μg / mL)。30分钟后细胞凋亡染色法观察了FACSCalibur流式细胞术。凋亡细胞百分比估计正常化细胞总数增至100%,然后计算归一化总细胞的凋亡细胞。

2.8。统计处理

GraphPad PRISM 6.0和SPSS 20.0已经被用来分析数据。独立样本 - - - - - -测试和单向方差分析( )和LSD - 事后测试是用来实现群际和多个组比较。multitime点的表达谱采用重复测量方差分析( )和Bonferroni事后测试。数据代表的意思(SD),图中所示的尝试都是一式三份的传奇。作为显著性水平 。

3所示。结果

3.1。MZ肝癌细胞生存能力的影响

MZ对肝癌细胞的生长的影响进行评估。HepG2细胞与不同浓度的cocultured Hep3B SK-HEP-1肝癌。发现肝癌细胞生存能力更抑制MZ浓度增加(数据1(一)和1 (c))。的半抑制浓度(IC50) 10μg / mL被选为实验干预的最佳浓度,研究之间的联系MZ, mir - 217和肝细胞癌。IC50结果表明Hep3B和SK-HEP-1 IC50 10.57μ和9.35克/毫升μg / mL,分别为(数字1 (b)和1 (d)10),所以我们选择的浓度μ通过计算g / mL,以备后续分析。结果瓦解,MZ能明显抑制肝癌细胞的生存能力,和对照组之间存在显著性差异的组织细胞与不同浓度的Hep3B SK-HEP-1治疗肝细胞癌。

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图1
咪达唑仑对肝癌细胞生存能力的影响。(一)咪达唑仑对Hep3B细胞毒性的影响。(b)咪达唑仑Hep3B IC50。(c)咪达唑仑对SK-HEP-1细胞毒性的影响。(d)咪达唑仑SK-HEP-1 IC50。的半抑制浓度(IC50) 10μg / mL被选为实验干预的最佳浓度,研究之间的联系MZ, mir - 217和肝细胞癌。数据提出了意味着(SD)和尝试是一式三份。
3.2。MZ对肝癌细胞的转移和细胞凋亡的影响

先前的研究表明,MZ在低浓度可以诱导神经母细胞瘤细胞凋亡,而在高浓度诱导细胞坏死(24]。然而,MZ对肝癌细胞的转移和细胞凋亡的影响还不清楚。通过毒性试验,我们证实了MZ抑制肝癌细胞生存的能力。此外,我们观察到MZ对肝癌细胞的转移和细胞凋亡的影响。我们使用Transwell测试和流式细胞分析仪分析肝癌细胞侵袭性的改变,迁移,细胞凋亡后10μg / mL MZ干预。实验结果MZ显示明显减少侵袭性和迁移(数据2(一个)- - - - - -2 (c), )和明显增强细胞凋亡(图2 (c), )肝癌细胞后MZ干预与空白组相比。这表明MZ有能力抑制肝癌细胞转移和诱导细胞凋亡。

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图2
咪达唑仑对转移和肝癌细胞的细胞凋亡的影响。(一)咪达唑仑对入侵的影响通过Transwell肝癌细胞的能力。(b)咪达唑仑对迁移的影响通过Transwell肝癌细胞的能力。(c)咪达唑仑对肝癌细胞的细胞凋亡率的影响通过流式细胞术。数据提出了意味着(SD)和尝试是一式三份。 和 。
3.3。MZ mir - 217上的影响肝癌细胞

mir - 217密切与肿瘤进展和预后不良。我们已经证实MZ抑制肝癌细胞转移的能力,通过实验诱导细胞凋亡,但具体机制尚不清楚。在早期的研究中,人们发现MZ可以调节米尔表达参与肿瘤的发展。本文分析了MZ和mir - 217之间的联系。存在了明显下降mir - 217肝癌细胞(图3(一个), ),MZ干预后明显升高mir - 217(图3 (b), )。因此,MZ可以上调mir - 217肝癌细胞。

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图3
咪达唑仑增强mir - 217肝癌细胞的表达。(a)的相对表达水平mir - 217肝癌细胞中存在。(b) mir - 217的相对表达水平的变化在肝癌细胞后咪达唑仑干预中存在。数据提出了意味着(SD)和尝试是一式三份。 和 。
3.4。逆转MZ差别mir - 217对这些对肝癌细胞生长和转移的影响

据报道,mir - 217可以抑制致癌作用和发展各种癌症(25,26]。近年来,一些研究发现,MZ可以减少米尔在肿瘤转录,从而抑制肿瘤的发展。然而,MZ在肝癌细胞生长和转移的影响尚未得到证实。最后,mir - 217 -抑制剂-转染肝细胞(图4(一), )与MZ cocultured进一步观察肝癌细胞生长和转移的变化,以确定MZ和mir - 217之间的联系。和mir - 217的侵袭性和迁移-抑制剂转染肝细胞显著增强,而mir - 217 -抑制剂+ MZ-transfected肝癌细胞没有表现出明显的差异,比空白组(图4 (b), )。基于流式细胞术分析细胞凋亡率mir - 217 -抑制剂干预肝癌细胞明显降低而mir - 217 -抑制剂+ MZ肝癌细胞显示无明显差异,相对于空白组(图4 (c), )。上述结果表明,MZ可以抑制肝癌细胞的转移和通过增加mir - 217细胞凋亡。

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图4
咪达唑仑对肝癌细胞的生长和转移通过调节mir - 217。(a)中存在的相对表达水平检测mir - 217肝癌细胞转染和mir - 217 -抑制剂。数据提出了意味着(SD)和尝试是一式三份。(b)咪达唑仑+ mir - 217 -抑制剂对肝癌细胞的入侵能力Transwell化验。(c)咪达唑仑+ mir - 217 -抑制剂对Transwell测定肝癌细胞的迁移能力。(d)咪达唑仑+ mir - 217 -抑制剂对肝癌细胞的凋亡率通过流式细胞术。第四季度代表pi-stained细胞凋亡细胞。数据提出了意味着(SD)和尝试是一式三份。 和 。

4所示。讨论

肝癌是最多发的消化道恶性肿瘤,近年来发病率不断增强与快速发作,严重的恶化,五年存活率较低(27- - - - - -29日]。尽管综合治疗如手术切除、化疗已经应用于临床,病人的预后仍不宜由于各种因素(30.]。之前的研究表明,造成的不利影响的恶性肿瘤细胞生长失控的机理,增殖和凋亡。例如,当抑制癌基因被激活而antioncogenes时,它将导致连续癌细胞扩散和日益严重的疾病31日,32]。

最近的研究表明,麻醉药物对肿瘤细胞生长和转移有抑制作用。例如,通过Rab11-mediated dexmedetomidine加速乳腺癌细胞迁移的分泌exosomal TMPRSS2 [33)和调节卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移,并通过mir - 155 / HIF-1侵袭性α轴(34]。除此之外,通过调节lncRNA-MEG3 / mir - 421 / BTG1轴,利多卡因抑制宫颈癌细胞增殖和增强了细胞凋亡35]。

出土,microrna的表达异常与发展以及相关肿瘤发生在人类癌症36]。有一个最近的研究证明microrna的表达和潜在功能通路在肝细胞癌(37),microrna与肝癌之间的关系已经确定。MZ,γ-氨基丁酸(GABA)受体激动剂和麻醉剂广泛应用于苯二氮卓类,最近发现对肿瘤产生抑制作用38]。MZ和其他麻醉剂显示,神经元凋亡诱导活性和神经细胞毒性,造血,外胚层的,间充质细胞39]。已经证明,在低浓度MZ可以诱导神经母细胞瘤细胞的凋亡,而在高浓度诱导细胞坏死(24]。然而,目前尚不清楚是否MZ有相同的促进其他肿瘤细胞凋亡的影响。这里,我们观察到肝细胞活性明显抑制了MZ浓度的增加,并通过计算,我们发现MZ抑制肝癌细胞活性在10 50%μ克/毫升。因此,肝癌细胞转移的变化和细胞凋亡在10μg / mL MZ被观察到。通过实验,我们确定10μg / mL MZ可以有效地抑制肝癌细胞转移和诱导细胞凋亡,表明MZ也在肝细胞癌肿瘤抑制效果。

米尔是一个可以调节的内源性小分子RNA和蛋白质丰度mRNA的表达。它还可以有多个甚至几百个信使rna目标绑定和可能参与各种生物过程(40]。作为非侵入性肿瘤的生物标记,此外,米尔等各种临床价值的诊断和预后预测,发挥监管作用的发生、转移,发展,和其他肝癌的分子机制和具有潜在的治疗效果26,41]。mir - 217密切与肿瘤进展和预后不良。据报道,mir - 217会抑制致癌作用和胃等发展(25)和肝脏癌(42]。近年来,一些研究发现,MZ可以减少米尔在肿瘤转录,从而抑制肿瘤的发展。然而,MZ能否调节mir - 217相关研究尚未得到证实。在这项研究中,我们证实了MZ可以上调mir - 217肝癌细胞。此外,coculture MZ和mir - 217 -抑制剂逆转mir - 217 -抑制剂的影响肝癌细胞转移促进和抑制细胞凋亡,表明MZ抑制肝癌细胞的转移和通过增加mir - 217细胞凋亡。七等人发现MZ可以抑制肝癌细胞增殖和促进细胞凋亡43),这与我们的研究结果是一致的。他们还发现,MZ抑制肝癌细胞的发展通过提高mir - 124 - 3 - p;而在我们的研究中,人们发现MZ有能力调节mir - 217除了mir - 124 - 3 - p,这表明MZ可能参与肝癌细胞生长调节多个大鹏展翅。符合这一结果,mir - 124的积极影响——3 - p在鼻咽癌细胞凋亡已报告在现有研究[7]。此外,张等人也发现mir - 124 - 3 p的超表达有能力抑制细胞凋亡和细胞周期阻滞通过调节NRP-1多形性成胶质细胞瘤(7]。

更重要的是,MDZ能明显抑制肝癌细胞的生长。同样,专制MDZ对肝癌细胞的影响已经确认在其他研究7]。更重要的是,其他liver-related MDZ疾病的影响,如肝恶性肿瘤,肝硬化已经澄清了7]。

基于上述研究,我们基本上证实了MZ能抑制肝癌细胞的转移和通过增加mir - 217细胞凋亡。然而,在我们的研究有一些限制。首先,进一步验证是保证检查mir - 217是否有同样的效果在动物模型在活的有机体内实验缺席在这个研究。第二,这项研究并没有深入探讨,mir - 217是否监管HCC进展通过下游靶基因或信号通路。因此,我们希望在未来做更多的实验研究来改善我们的结论。

集体,MZ可以上调mir - 217肝癌细胞,从而抑制肝癌细胞转移和诱导细胞凋亡。

数据可用性

标签数据集用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

沈千夏和Yanqiong做出同等贡献的研究。