文摘
Sirtuin-1 (SIRT1)有抗炎和抗氧化效果和被报道参与脊髓损伤(SCI)。Wnt /β连环蛋白信号已被证明慢性疾病的发病机制中发挥重要作用,它参与了SCI后神经功能的恢复。然而,它们之间的具体联系在SCI尚不清楚。此外,针对创伤后星形胶质细胞凋亡对改善神经变性和运动功能是至关重要的。因此,在本文中,我们研究的关系β连环蛋白和SIRT1使用SCI大鼠模型和主要星形胶质细胞过氧化氢处理(H2O2)或氯化锂(氯化锂)。结果表明,SCI后,SCI区域和运动功能恢复随着时间的推移,和β连环蛋白逐渐增加到第七天,然后依次减少到4周,积极与细胞凋亡有关。SIRT1的表达和下游FOXO4逐渐增加,和β连环蛋白与SIRT1表现负相关。此外,治疗H2O2主要培养的星形胶质细胞显著增加β连环蛋白和Caspase-3表达式,同时减少了SIRT1和Forkhead盒O - (FOXO -) 4。免疫荧光结果是一致的。氯化锂管理进一步加剧上述结果。这些发现表明,SIRT1是负相关的β在SCI连环蛋白,促进运动神经元细胞的细胞凋亡,这可能是有关FOXO4的参与。
1。介绍
脊髓损伤(SCI)是一种严重的神经障碍的特点是完全或部分的运动功能障碍导致运动功能丧失,造成慢性损伤和残疾(1,2]。SCI包含主要和次要伤害。我们不能把主要损伤,所以我们主要关注二次伤害。二次损伤的病理过程包括以下:一系列的线粒体功能异常的变化,感染,炎症,氧化应激损伤和细胞凋亡3,4]。因此,当前的主要治疗方法是减少或减缓上述病理损伤继发损伤。对于二级SCI,神经元凋亡可能提供一种很有潜力的治疗目标5]。细胞凋亡是一种基因控制的细胞死亡(6]。它涉及一系列基因的激活、表达和调控的作用,β连环蛋白(7)和Sirtuin-1 (SIRT1) [8)参与监管。然而,还没有一份报告关于SIRT1和之间的关系β在SCI连环蛋白。
SIRT1是蛋白脱乙酰酶的第三类依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) [9]。SIRT1蛋白质已被证明具有抗炎和抗氧化作用,它有一个广泛的生物功能增长监管、应激反应、肿瘤形成,细胞凋亡,延长寿命10,11]。它可以减轻细胞损伤。此外,SIRT1被报道能显著抑制炎症response-induced神经元损伤(12]。研究表明,SIRT1在调节中发挥着关键作用中枢神经系统损伤后神经炎症,可能是一个新的治疗目标post-SCI [13]。Yu et al。12)表明,SIRT1抑制细胞凋亡在活的有机体内和在体外SCI模型通过mir - 494。也有研究表明,白藜芦醇能保护SCI通过激活SIRT1 / AMPK pathway-mediated自噬信号和抑制细胞凋亡14]。
Wnt /β连环蛋白信号通路参与神经系统的发展,影响细胞模式和增殖,神经连接和生存、细胞粘附、细胞活性和极性,轴突指导(15,16]。最近的研究发现了一个分子机制:β连环蛋白在神经元细胞凋亡与SIRT1负相关。他们发现upregulation SIRT1的可以抑制过氧化氢(H2O2-)诱导成骨细胞凋亡在Forkhead盒O (FOXO) 1 /β连环蛋白通路(17]。可以通过访问SIRT1 Wnt /β连环蛋白信号调节细胞凋亡和细胞外基质降解骨关节炎软骨细胞的白藜芦醇处理(18]。本研究旨在深入研究之间的关系β连环蛋白和SIRT1以及它的作用和潜在机制在SCI后调节细胞凋亡,这可能有助于制定科学有效的治疗方案。
2。材料和方法
2.1。动物
共有90个成熟男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(180 - 220克)是获得辽宁医科大学实验动物中心。和老鼠关在一个房间温度控制的周期12 h光/暗周期曝光。所有实验过程住实验室动物保健和使用的由美国国立卫生研究院发布。
老鼠被分离到5组随机( 每组):假,SCI后3天组(3 dsci), SCI后7天组(7 dsci), SCI后14天组(14 dsci),后28天SCI组(28 dsci),椎板切除术虚假的组,另一组使用修改后的大鼠模型锤法(直径2毫米,体重10 g;艾伦的方法)。
2.2。科学的建设模式
SCI模型建成之后,艾伦的方法(1]。老鼠首先由戊巴比妥钠麻醉注射3%(0.2毫升/ 100 g, i.p。)。T8-T11 SD大鼠的皮毛从后面刮和消毒。皮肤被削减,肌肉分离,用夹板固定程序T9-T10拿出一双眼科和剪刀。切除椎板完全暴露脊髓损伤硬脑膜。我们放弃了撞击器重10克(直径:2毫米)在25毫米的距离到脊髓,然后立即删除,而不会破坏硬脑膜的完整性。肌肉和皮肤层与无菌生理盐水冲洗后缝合。下面是一个成功的SCI模型:血肿发生的战斗位置,后肢的快速收缩,尿失禁,尾巴摆动反射的出现。失败不会被包括在这个实验模型。收集脊髓组织模型的在不同的时间点。
2.3。主要星形胶质细胞文化
主要从新生SD大鼠的脊髓星形胶质细胞准备(产后第三天)。新生儿鼠脊髓被逐出脊柱,0.25%胰蛋白酶处理(美国Gibco T4549) 15分钟,其次是机械磨碎DMEM heat-inactivated(美国σ)+ 10%胎牛血清(的边后卫,σ)。在800转离心5分钟后,细胞在DMEM停牌,含有青霉素、链霉素的边后卫和1% (19]。文化是保持在一个大气含5%二氧化碳在37°C。
2.4。评价运动神经元的功能恢复
我们使用的运动等级量表Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) [20.)来评估行为的复苏0,1、3、7、14和28天之后罢工。BBB的分数范围从0(完全瘫痪)21分(正常的运动)。平均BBB评分是用来评估SCI后功能恢复。
2.5。免疫印迹
里帕裂解缓冲(Beyotime,中国)是用于溶解准备组织,紧随其后的是最终的量化蛋白质浓度(2 g / L) BCA试剂盒(Enogene,中国)。被sds - page分离后,蛋白质(30μg)被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。在室温下,细胞膜被与Tris-buffered脱脂牛奶5%盐水TBST 2 h,然后,在4°C的环境中与主在一夜之间抗体。中包含以下主要抗体是杂交的解决方案:反β连环蛋白(1:1000;8480年,细胞信号技术,美国),anti-FOXO4 (1: 1000;9472年,细胞信号技术)、anti-Caspase-3 (nb100 - 56708;罗福斯1:1000年,美国),anti-SIRT1 (1: 1000;8469细胞信号技术)。TBST用于冲洗膜三次,当时孵化与二级抗体(1:10000;美国Earthox)在室温下2 h。ChemiDoc-ItTMTS2成像仪(UVP LLC,旱地、钙、美国)来开发免疫反应性的乐队,和ImageJ软件(美国马里兰州贝塞斯达国家健康研究所)是应用分析。上面的步骤是重复三次。
2.6。苏木精和伊红染色
与苏木精染色后10年代,我们很快洗肖像的5μm与去离子水然后把幻灯片在盐酸/ 100%酒精(1:50)为5秒分化,这已经被伊红染色与去离子水清洗后了一个小时的一半。再次,片冲洗,在梯度酒精脱水。在最后,片晶莹剔透,固定与二甲苯上中性香脂。
2.7。尼氏小染色
我们的冠状切片浸5μm的氯仿溶液和乙醇(1:1)和冻干片通过减少酒精的浓度(100%的酒精,95%的酒精和水)为了承认神经元的数量和注意在不同组织形态的变化。甲苯基紫色溶液的0.1%被用来冲洗浸泡40分钟的片40°C,然后切片用95%的乙醇和去离子水冲洗和应用为分化、100%酒精脱水,二甲苯透明5分钟。最后,使用DPX盖玻片覆盖在片。
2.8。免疫荧光(如果)
在室温下,4%的初级神经元被PFA固定预处理30分钟。横向片5μm是干在室温空气2 h,紧随其后的是5%的孵化与正常山羊血清2 h在室温和细胞治疗。主要的抗体如下:反β连环蛋白(1:200;8480年,美国细胞信号技术)和anti-SIRT1 (1: 200;8469、细胞信号技术)和二级抗体如下:FITC山羊anti-mouse免疫球蛋白g (1: 300;bios、中国)和Cy3山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 300;bios,中国)。在最后,DAPI解决方案(1:800)是用于restain核,和上面的图片都是由荧光显微镜捕获(德国徕卡)。
2.9。统计分析
数据都是由SPSS 22.0软件进行分析。T测试是用于比较两组,和单向方差分析被用于多个组之间的比较。的表达之间的相关性β连环蛋白和SIRT1 Caspase-3使用斯皮尔曼相关分析进行。数据被表示为 ,和 被认为是一个重要的区别。
3所示。结果
3.1。SCI大鼠后运动功能恢复
)和尼氏小染色完成的3、7、14、21、28天SCI后评估神经系统自动复位。结果表明,大鼠的脊髓结构与正常细胞形态完整的骗局。在SCI后3天,中央灰质和白质背明显受损,坏死和大面积蛀牙出现,一些神经细胞的核固缩,大量炎症细胞的渗透。受损区域,但随着时间的推移(图中恢复过来1(一))。运动神经元的数量在脊髓前角是由尼氏小SCI后染色。这些结果表明,神经元变性发生SCI后3天,和一些神经元坏死出现后7天,然后在28天(图中恢复过来1 (b))。它表明SCI大鼠可能是一个自我修复的过程,减少了运动神经元损失和科学。
(一)
(b)
(c)
SCI后,我们测量了BBB评分(0)1、3、7、14、21、28天来评估功能恢复。结果在图1 (c)SCI后表明,运动成绩BBB的老鼠下降直 来 。几天后,渐渐地,老鼠逐渐恢复从SCI和BBB评分逐渐恢复。
3.2。SIRT1和之间的关系β连环蛋白在SCI大鼠
为了研究之间的关系β连环蛋白和SIRT1在不同时间点SCI及其与星形胶质细胞凋亡的关系后,我们用免疫印迹和免疫荧光测量的表达变化β连环蛋白,SIRT1, FOXO4 Caspase-3蛋白质。数据的结果2(一个)和2 (b)显示,β连环蛋白蛋白增加,然后降低,而蛋白质SIRT1呈逐渐上升趋势(数据2(一个)和2 (b))。和免疫印迹显示相同的结果(数据的趋势2 (c))。SCI后和FOXO4蛋白质也逐渐增加。然而,凋亡标记Caspase-3先增加然后减少,峰值也在SCI后7天(图2 (c))。此外,相关分析显示β连环蛋白表达与SIRT1表达式(图负相关3(一个)(图),但积极与Caspase-3表达式3 (b))。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
3.3。激活β连环蛋白减少SIRT1的表达和细胞凋亡的表达增加
此外,我们建立了一个由暴露神经胶质细胞损伤和细胞凋亡模型H2O2,这是用于结晶的机理β连环蛋白与SIRT1参与损伤后神经保护。同时,我们使用Wnt /β连环蛋白通路激活剂氯化锂(20 mM)澄清Wnt /之间的关系β连环蛋白通路和SIRT1 FOXO4。结果表明,H诱导细胞凋亡2O2增加proapoptotic蛋白质Caspase-3表达式,氯化锂的水平显著提高β连环蛋白蛋白表达。相比之下,SIRT1蛋白质及其下游FOXO4显著下调后的氯化锂和H2O2感应(图4(一))。免疫荧光结果与免疫印迹(图一致4 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
本研究主要表明,蛋白质β连环蛋白和蛋白质SIRT1是负相关在SCI大鼠模型的二次伤害。氯化锂,Wnt通路激活的表达增加β连环蛋白抑制SIRT1的表达和FOXO4。
Sirtuins蛋白是第三类组蛋白去乙酰酶抑制剂(21]。七sirtuins蛋白,SIRT1调节多种生理过程,包括细胞凋亡、DNA修复、炎症反应、新陈代谢,癌症,和压力(22,23]。近年来,大量研究表明,SIRT1在SCI(有保护作用14,24]。陈等人。13]表明受体激动剂SIRT1减少神经炎症和促进脊髓损伤后神经元生存。一些研究显示25],SIRT1是负相关的βSCI后连环蛋白表达。与这些研究相一致的是,在目前的研究中,我们发现β连环蛋白在SCI大鼠和SIRT1的表达呈负相关β连环蛋白表现出正相关与Caspase-3凋亡蛋白的表达。
规范化Wnt通路在细胞发育和分化有着重大影响(5]。细胞凋亡是由Wnt /控制β连环蛋白通路,包括在人类疾病、肿瘤和胚胎发育26]。然而,Wnt信号的最终结果是由基因的活动是由TCF和控制β连环蛋白。当它被激活,β细胞质中的连环蛋白积累将进入细胞核激活TCF转录因子参与DNA转录(27,28]。因此,β连环蛋白是Wnt通路的关键调节器。最近,已经证明是一个锂Wnt信号通路激活在动物和细胞模型的神经退行性疾病和肿瘤29日- - - - - -31日]。在我们的研究中,β连环蛋白显著调节相比,SIRT1的减少下游的蛋白表达后FOXO4 lithium-treated胶质细胞。符合这一观察,之间存在负相关β连环蛋白和SIRT1在大鼠神经细胞凋亡的调节。一些报道报道,SIRT1激活降低β通过磷酸化连环蛋白表达间充质干细胞(32,33]。这与本文的结果是一致的。
在本文中,我们发现SIRT1,β连环蛋白显示在SCI大鼠细胞凋亡成反比关系,和有一个监管之间的关系。这些结果表明,我们提出了一个新的分子机制的潜在临床应用SIRT1对待SCI通过激活或抑制β连环蛋白,虽然复杂interregulatory SIRT1的机制β连环蛋白对我们还不清楚。然而,它为我们的下一步研究奠定了基础。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委;格兰特。81671907和81671907)。