文摘

背景。目前的研究集中在子痫前期(PE),一种妊娠临床相关疾病。迄今为止,大多数研究PE是集中在胎盘机能不全。然而,这些过程调节基因,确切的分子机制调节这些过程,仍不清楚。方法。我们从临床上胎盘获得良好组患者子痫前期和妊娠期匹配控制怀孕为了评估同源框基因的表达DLX3通过免疫组织化学染色,实时PCR,西方免疫印迹和确定的功能DLX3利用慢病毒转染HTR-8 / SVneo细胞。结果。在目前的研究中,我们发现DLX3表达式在临床上定义良好的群preeclampsia-affected gestation-matched控制怀孕。而不是控制,DLX3在preeclampsia-affected胎盘。此外,我们发现体外HTR8 / SVneo细胞的细胞生长和侵袭性能力增强是由外生DLX3超表达( )。可以看出DLX3影响HTR-8 / SVneo细胞周期的细胞在体外。结论。DLX3已被证明是高度相关正常胎盘生长以及子痫前期的病理生理学。DLX3可能执行一个积分函数的表达式不平衡在子痫前期的发生和发展。

1。介绍

子痫前期(PE)是临床上重要的妊娠并发症,其功能包括蛋白尿和高血压,清单20周后怀孕。除了加强围产期胎儿异常的风险(如低出生体重、早产,和死亡率),子痫前期妊娠相关风险升高的问题(如肾功能衰竭、脑水肿和癫痫,肝功能衰竭,临床上妊娠综合症,而且很少死亡)(1]。传统上,子痫前期已被报道为自限性疾病,尽管发病率可能是严重的。然而,最近的研究显示,产妇产后内皮功能障碍可以持续多年,和女人经历了PE可能在慢性高血压和冠状动脉疾病的风险增加在未来2]。为了获得一个更好的了解体育,它变得越来越重要的理解疾病的分子基础。

体育主要是血管内皮细胞的一种疾病。怀孕与体育的特点是减少绒毛组织,减少胎盘表面积,和不规则脐动脉血液循环。似乎子痫前期实际上是相关的不平衡循环血管生成因素导致内皮功能障碍。PE是内皮功能障碍的病理生理基础3]。值得注意的是,血管生成和血管生成是胎盘的正常发展的基础。减少入侵和迁移能力和过度的滋养层细胞凋亡早期怀孕可能会导致发育不良的子宫螺旋动脉和胎盘渗透不足,导致内皮应急响应系统和血流动力学的变化,最终引起病理妊娠,如PE (4,5]。

然而,基因调节这些过程,准确的分子机制调节这些过程,仍不清楚。

已经发现越来越多的同源框基因,报告管理一些基因通路参与调节血管的发展,执行一个函数的发展关键在人类胎盘结构组成(6]。我们特别感兴趣的一个亚科称为Distal-less同源框基因。Distal-less (DLX)亚同源框基因包括6个分公司,指定DLX 1 - 6在老鼠和人类的DLX 1 - 6,和转录调节器由6的家庭成员在哺乳动物中,成对排列和同步不同染色体上的基因集群(7,8]。Morasso et al。’s研究侧重于人类DLX3,据报道,执行一个积分函数在小鼠胎盘的形成9]。在转基因小鼠模型中,目标超表达的DLX3表皮导致严重的异常,包括过早或加速表皮分化和停止扩散10]。

所需的一些观测表明,DLX3足够和胎盘生长因子(PGF)表达在人类trophoblast-derived细胞,扮演着重要的角色在人类胎盘形成proangiogenic因素在促进胎盘血管生成和血管通透性11- - - - - -13]。

这些发现表明DLX3基因的正确表达是胚胎生存所必需的。DLX3可以表现出绒毛合胞体滋养层的高表达和细胞滋养层14,15]。胎儿胎盘单位和母亲的脉管系统满足在这一领域,允许营养和气体的流动。DLX3在不同细胞类型的存在表明DLX3势函数的微分,这些细胞和DLX3可能在滋养层细胞入侵的一个函数。

人类孕期DLX3基因的表达,以及病理性疾病之间的关系和突变基因,将在未来的研究是至关重要的。我们使用胎盘的临床定义preeclamptic病人和妊娠期匹配control-pregnant女性确定DLX3表达和慢病毒转染HTR-8 / SVneo细胞确定DLX3的功能作用。

2。材料和方法

2.1。患者数据和组织样本

本研究通过济南市孕产妇和儿童保健医院,山东。告知病人同意和批准授予。本研究包括来自孕妇的胎盘有PE ( )和怀孕妊娠匹配研究参与者( )。劳动妇女凯撒的部分没有提供所有的胎盘用于这项研究。胎盘从32-37收集与正常妊娠妇女孕周。妊娠时间的计算根据女性的末次月经的日期(LMP),然后经由早期产前超声。胎盘在此前获得PE患者孕周。两组有类似的母亲年龄和生育模式,没有显著差异。子痫前期是使用一组严格的诊断标准,包括开始的晚期妊娠高血压过程中对两次(140/90毫米汞柱)和可追踪的尿蛋白的存在(≥1 +试纸或≥300毫克/ 24 h)。PE和控制妊娠的临床特征,包括在我们的调查中列出表1。preeclampsia-affected和控制怀孕被基于以下标准:多胎妊娠,胎儿先天性缺陷,疑似宫内病毒感染,长期的细胞膜破裂,母亲吸烟、药物依赖、糖尿病、自身免疫性疾病、胎盘早剥。

胎盘组织样本被切割子叶从随机选择核心胎盘的位置。交付后的胎盘,所有样本处理在不到30分钟。任何被附着的蜕膜精心删除。新鲜的胎盘组织样本被切成小块,妥善清洗在磷酸盐0.9%生理盐水(PBS)减少血液感染的可能性。每一个胎盘样本随机分为两个部分。具体地说,基于一部分蛋白质和RNA进行了隔离,保持在80°C,而另一部分样品固定在4%多聚甲醛对免疫组织化学。

由于胎盘是一个庞大而多样化的器官,潜在的抽样偏差可能是一个问题。在目前的研究中,没有相当大的差异在样本来自不同胎盘网站DLX3表达(免疫组织化学分析,数据没有说明)。后,只有一个样品从每个胎盘被用来检查DLX3的表达。

2.2。RNA提取和cDNA准备

RNA的提取进行了胎盘收获从怀孕复杂化体育以及gestation-matched控制。试剂盒试剂(美国英杰公司)是用于从细胞和组织中提取总RNA。完整性、纯度和产量的RNA都通过分光光度分析和凝胶电泳。PrimerScript RT试剂盒(豆类、日本)采用纯化RNA逆转录的互补。

2.3。实时聚合酶链反应

实现放大,罗氏实时PCR设备结合使用SYBR绿色染料从组织和细胞总RNA孤立使用试剂盒试剂(美国表达载体)。纯化是相对地转录成RNA cDNA使用PrimerScript RT试剂盒(豆类、日本)。这个调查是内部参考β肌动蛋白。验证结果,实验重复3次。感觉5 - - -CTTACTCGCCCAAGTCGGAA-3和反义5 - - - - - -TCTTGGGCTTCCCATTCACC-3引物被用于DLX3,和5 - - - - - -TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3和反义5 - - - - - -AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3引物被用于β肌动蛋白。

2.4。西方免疫印迹

有必要冻结胎盘组织(50毫克)利用液态氮之前将其磨成粉。利用里帕PMSF缓冲区包含1%,蛋白质从样品中恢复过来。bicinchoninic酸(BCA)技术被用来确定样品的蛋白质含量。5×蛋白样品缓冲溶液添加到每个样本,其次是孵化在100°C水浴10分钟调整浓度回到相同的水平。花了两个小时使用10% sds - page分离每个样本。在一段60 - 90分钟,蛋白质片段被加载到PVDF膜。转移后,屏蔽膜的百分比是使用2 - 5执行干燥脱脂牛奶在TBS-T环境温度为90分钟。随后,PVDF膜受到孵化的温度在4°C /初级抗体针对DLX3的晚上,包括GAPDH(1: 1000)和(1:500)(Abcam) (GoodHere,中国)。之后,膜进行再次的孵化环境温度90分钟利用HP-labeled山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L) (1: 2000) (Beyotime,中国)。惠普的止动剂™西方化学发光底物(美国微孔σ,伯灵顿,MA)来检测化学发光。

2.5。免疫组织化学

随机选择的条款preeclampsia-affected胎盘和控制胎盘在4%多聚甲醛固定。部分被切成5μ部分浸入石蜡后。微波抗原在EDTA (pH值9.1)进行检索后石蜡包埋标本deparaffinization和补液。屏蔽解决方案(包含血清白蛋白稀释的磷酸盐(PBS))是应用于部分三次每次5分钟,其次是孵化的部分主要的抗体在潮湿的孵化器在4°C的温度。本调查的目的,使用了下面的抗体:兔子DLX3多克隆抗体(1:1000 (v / v), Abcam)。三个5分钟洗PBS,辣根过氧化物酶(合)polymer-linked二级抗体被介绍给他们孵化前的样品为另一个15分钟的温度37°C。苏木精复染色是利用部分,和可视化是利用diaminobenzidine (DAB)。

2.6。细胞系

HTR-8 / SVneo细胞系(提供慷慨的捐赠的妇产科,山东大学齐鲁医院,济南,中国)是培养rpmi - 1640年(HyClone实验室,Inc .,洛根,UT)增强10%的边后卫。孵化器含5%二氧化碳和温度37°C是用来维持文化。细胞被播种到6-well盘子,紧随其后的是RNA和蛋白质分析集合。

2.7。慢病毒生产质粒,转染

的慢病毒质粒转移到upregulation GeneChem提供的DLX3和负控制公司(上海,中国)。转染是由GeneChem公司(上海,中国)符合制造商规定的指导方针。当稳定转染细胞受到孵化puromycin-containing媒体,puromycin-resistant殖民地的存在被发现转染后大约4天。

2.8。MTT测定细胞生存能力

HTR-8 / SVneo细胞在记录阶段被播种在2000细胞/ 96孔板。前面描述的程序后,进行质粒的转染和孵化。在0、24、48、72、96、和120 h posttransfection,细胞生存能力估计利用MTT试剂(DH343-2,中国),和吸光度( )读490海里。

2.9。Transwell和入侵检测

消化和resuspended细胞收获72 h质粒转染后,和200年μl整除transwell被放置。总共有750μl 30%的边后卫被引入底部。12小时的入侵实验是在37°C。入侵时间后,细胞仍在仔细被消除,而那些通过底部受到固定使用甲醇和染色使用染色方案。借助显微镜,入侵细胞的数量在每个五个随机选择的视觉领域的统计。入侵细胞的细胞样本的数量反映了细胞的侵袭性。

2.10。用流式细胞分析仪测定细胞凋亡

超过 细胞被添加到5毫升管和离心1300 rpm和4摄氏度的温度。随后,我们消除了上层清液。之后,冲洗的细胞做了两次预冷PBS两次,随后在200年再悬浮μ预冷的l l绑定缓冲。之后的10μl的膜联蛋白V-APC,细胞被保存在冰。在下一步中,这些细胞被放置在黑暗中10分钟,其次是400年的加法和混合μl l绑定缓冲。在15分钟内,检查结果。测试进行了一式三份。

2.11。数据分析

怀孕复杂化PE的所有因素和相应的控制表示为 。学生的 - - - - - -测试或卡方测试,如适用,适用于确定的意义区别患者妊娠的临床特征复杂的PE和控制。DLX3 mRNA表达之间的相关性和怀孕复杂化子痫前期和控制胎盘是利用多元线性回归建模。在确定如果DLX3 mRNA表达之间的相关性和妊娠preeclampsia-complicated和控制胎盘之间实质上不同,利用似然比检验。DLX3中的差异蛋白表达在preeclampsia-affected和对照组决心利用学生的 - - - - - -测试。一个概率小于0.05倍被认为是重要的。功能测试的结果是利用学生的检查 - - - - - -测试。

3所示。结果

3.1。中过表达DLX3 Preeclampsia-Affected胎盘

实时PCR的mRNA表达DLX3对preeclampsia-complicated胎盘( )和妊娠期匹配控制( )。图1(一)演示了一个定性的高程观测在水平的DLX3 preeclampsia-complicated胎盘样品而不是gestational-matched控件( )。

DLX3表达项控制随机选择( ),和preeclampsia-affected胎盘( )是在蛋白质水平检查。图1 (b)描绘了一个典型的DLX3蛋白免疫印迹preeclampsia-complicated胎盘与gestational-matched项控制胎盘。在蛋白质水平,DLX3蛋白质显示更高水平preeclampsia-complicated胎盘的价格相比之下gestational-matched控制队列。

免疫组织化学定位的免疫反应性的DLX3蛋白质提供实证证明DLX3可能发现原子核的残留细胞滋养层,内皮细胞,和合胞体滋养层preeclampsia-affected胎盘与术语控制胎盘。如图2DLX3水平显著升高,preeclampsia-complicated胎盘与控制胎盘形成鲜明对比。

3.2。DLX3促进HTR-8 / SVneo细胞基底细胞体外生长

我们使用HTR-8 / SVneo细胞系模型检查的功能分化的DLX3人类绒毛细胞滋养层。DLX3是调节HTR-8 / SVneo细胞系通过与慢病毒转染表达(图3(一个)),导致海拔相对DLX3蛋白质和信使rna表达水平预期(数字3 (b)和3 (c))。如图4,在基础条件下,细胞生长显著升高后的DLX3 upmodulation HTR-8 / SVneo细胞系( )。

3.3。DLX3促进细胞迁移和侵袭性能力HTR-8 / SVneo细胞体外

滋养层是用来调查的影响overexpressing DLX3能力入侵他们的环境。通过拍摄和测量基底膜基质细胞入侵,我们发现细胞的百分比渗透膜OE组(DLX3-overexpressing HTR-8 / SVneo细胞)是高得多,而不是在转染后的NC组(控制单元)(数据5和6, )。研究结果表明,DLX3可能增加HTR-8 / SVneo细胞的体外侵袭性。

3.4。细胞凋亡NC和OE组之间差异不显著

如图6在转染后48 h,细胞凋亡 数控组 OE组(图7, )。每组的凋亡率低于5%,表明没有明显的细胞凋亡发生。

4所示。讨论

preeclampsia-complicated怀孕的队列包含在这个调查是临床精确定义。PE的临床发现只有在孕妇被观察到;因此,我们的结论是,胎盘是必要的。体育是一种疾病,与系统性血管内皮功能障碍有关,表明血管内皮功能紊乱的重要性。胎盘是母亲和胎儿所需的气体交换,营养,和浪费。此外,胎盘滋养层的迁移和变化提供孕产妇的小直径阻力动脉血液向大尺寸电容胎盘血管,使足够的产妇血液到达胎盘(1,16]。然而,这个过程可能在PE、中断和胎儿滋养层无法有效地渗透孕产妇螺旋小动脉和子宫肌层。体育的主要后果是子宫螺旋动脉重塑和缺血性胎盘损伤(9]。

可能无法螺旋小动脉将导致长期的胎盘机能不全,可能进步孕产妇内皮功能障碍,表现为PE的临床综合征。在未来,似乎研究专注于血管生成基因的调制以及它们的功能在胎盘血管生成和系统性血管健康将有助于更好的理解病理生理学的PE、以及提高疾病的治疗策略。

Distal-less家族的成员之一,同源框基因已被证明积累的人类怀孕的问题,越来越多的研究显示[17- - - - - -20.]。我们的研究表明,胎盘与PE DLX3相当高。先前的研究发现DLX3主要表达在绒毛细胞滋养层和syncytio滋养层(21]。DLX3这些细胞类型的本地化是暗示DLX3角色的绒毛细胞滋养层细胞分化。DLX3的管制表达式可能过早耗尽的增殖细胞滋养层有利于分化和可能反映在增加syncytialisation终端分化的影响,如合胞体滋养层脱落和细胞凋亡22]。在我们的研究中,免疫组织化学分析显示海拔DLX3表达的强度在preeclampsia-complicated胎盘与gestational-matched控制。因此,额外的量化和敏感测试,比如RT-qPCR和免疫印迹分析,利用验证DLX3表达式的更高层次preeclampsia-complicated胎盘与gestational-matched相比对照组。

在老鼠身上,DLX3基因已成功进行有针对性的突变(23),说明DLX3是胎盘在老鼠身上的自然形成的关键。发现DLX3基因表达在人类胎盘滋养层主要文化,,这个表达式的模式被证明是连续的,而不是断断续续(24]。这些发现支持了假设DLX3的表达在人类可以持续在怀孕的过程中。尽管如此,DLX3胎盘和胚胎的意义和其功能仍不清楚。减少滋养层入侵和扩散是体育的特征。在preeclampsia-affected胎盘,大大DLX3信使rna表达水平升高的观察与妊娠对照组相比,这意味着DLX3的调制可以滋养层细胞分化的关键。DLX3表达式已被证明是与细胞凋亡在越来越多的研究,有些人认为它有一个调节的作用在这一过程中(24,25]。在目前的研究中,利用HTR-8 / SVneo细胞系作为一个模型,我们可以分析的功能DLX3人类绒毛细胞滋养层细胞分化。慢病毒设置DLX3表达降低的是用来评估是否DLX3是分化所必需的。正如预测的那样,治疗HTR-8 / SVneo细胞导致海拔DLX3信使rna和蛋白质的比例。结果,细胞生长后被提拔的DLX3 upregulation HTR-8 / SVneo细胞系,转移和入侵的能力增加。似乎不平衡水平的DLX3可能表明异常细胞分化,增殖,或侵入性能力,这表明DLX3可能作为基底转录调制器与滋养层细胞来源。然而,由于实验样本大小或统计方法,DLX3没有统计上显著的对细胞凋亡的影响。

从当前研究DLX3,建议DLX3可能施加各种可能至关重要的功能在人类胎盘的自然增长,,可想而知,高架DLX3表达妇女的胎盘子痫前期会有实质性的负面影响。此外,许多潜在的关键功能DLX3人类胎盘的形成过程中假设,包括基本的调制滋养层分化。

这项工作的结果增强我们的知识分子的滋养层调制过程的背景下体育。有证据表明同源框基因转录因子水平的改变发生在preeclampsia-complicated胎盘,而这些变化可能有一个聚乙烯的分子过程的重要功能。鉴于DLX3强烈与胎盘的自然发展和PE的致病机制,进行额外的同源框基因的功能作用的分析,尤其是DLX3,将帮助我们placenta-related疾病的分子机制研究和开发治疗方法。然而,尽管DLX3在滋养层celldifferentiation调查,监管的DLX3 PE的作用也将是未来的研究的兴趣。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

此外,我们没有商业或其他个人股份的任何产品中使用的研究。此外,表达意见和发表题为《表现评估同源框基因DLX3表达增加人类与子痫前期胎盘没有受到任何服务或公司可能会是这样。

的利益冲突

我们和我们的伙伴都没有任何个人或金融协会与其他个人或组织,对目前的研究可能带来不公平的影响。