文摘
目标。本研究试图检查是否川芎嗪能抑制磷酸二酯酶(PDE)活动和改善肺功能在哮喘大鼠模型。方法。老鼠最初使用卵白蛋白致敏(卵子),然后与雾化卵开始挑战每天14天后(30分钟/天)来生成一个哮喘大鼠模型。改变气道功能后乙酰甲胆碱(MCh)注入被监测肺阻力(评估 )和动态肺遵从性( )值使用AniRes2005分析系统。此外,血清IgE通过ELISA测定,PDE表达式计算时通过qPCR和免疫印迹。重要发现。川芎嗪显著受损allergen-induced肺hyperresponsivity哮喘模型系统和炎症。川芎嗪治疗也与减少的表达pd包括PDE4这些老鼠的肺。结论。川芎嗪抑制气道炎症和支气管hyperresponsivity鼠模型系统,和这些变化与减少PDE表达的蛋白质和mRNA水平。
1。介绍
哮喘是一种常见的呼吸道疾病中免疫功能障碍可导致慢性气道炎症,导致异常的气道狭窄,粘液生产,影响个人的呼吸困难。全球有超过3亿人受到哮喘,哮喘和数据从全球行动(吉娜)表明,将有多达4亿例2025年投入使用。个人影响哮喘,在某些情况下,患有严重气道狭窄,可危及生命(1,2]。哮喘和相关的炎症与炎性细胞的浸润密切相关包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的航空公司。这种炎症伴随炎症活动与营退化(3)和生产特点2型辅助T细胞产生的细胞因子(Th2细胞)4]。哮喘的症状通常可以使用糖皮质激素的组合和有效管理β2受体激动剂,但没有治疗这种情况目前可用。这使得许多研究人员探索的潜在价值治疗哮喘中药(TCM)。事实上,建立中医日益纳入治疗方案作为补充和替代医学(CAM)的方法。然而,这种方法已经导致了一个相对有限的科学基础,许多中医的药用配方。这样,越来越感兴趣的追求更多的循证研究中医,以缩小信息差距有关这些疗法,从而提供病人潜在的治疗可能产生更好的治疗结果(5- - - - - -7]。
磷酸二酯酶(pde)是关键酶水解营地和cGMP,导致核苷酸失活(8]。pde抑制时,营地和cGMP水平大幅上升,导致一些表型变化包括减少免疫介导的炎症和气道平滑肌的松弛。相比之下,低水平的营地被认为有助于哮喘发病机理(9- - - - - -11]。药物能够诱导的生产营因此经常在哮喘治疗的背景下,研究了包括β2肾上腺素能受体受体激动剂和茶碱12,13]。许多不同的细胞外刺激能促进细胞内营生产针对PDE抑制或腺苷酸环化酶(AC)激活。化合物能够针对这些酶可能具有治疗价值治疗哮喘。符合这种模式,PDE4抑制剂已被证明降低气道炎症和增加阵营的水平,这种机制是与一个抑制Th2细胞功能和相关的炎性细胞因子分泌(14- - - - - -18]。
川芎嗪是一种生物碱衍生物Chuanxiong粉末(当归Chuanxiong长的矮)。它已被证明具有抗炎,数组antifibrotic,抗氧化和免疫调节活动。值得注意的是,最近的研究表明,川芎嗪可以诱导营地cAMP-dependent的方式生产和调节分泌il - 4 (19]。因此,我们推测,川芎嗪能防止allergen-induced哮喘大鼠通过调制PDE活性,从而改变cAMP-related信号。为此,我们敏感Sprague-Dawley (SD)大鼠使用卵白蛋白(OVA)之前挑战他们雾化卵巢建立哮喘动物模型。这些老鼠注射川芎嗪,气道炎症和反应性进行了分析。此外,我们评估的影响川芎嗪治疗肺Th1 / Th2细胞因子水平和PDE哮喘模型表达系统。
2。材料和方法
2.1。过敏原模型
我们获得雄性SD大鼠(220 - 240 g)从上海BK实验动物有限公司(上海,中国)。老鼠被安置在一个标准的专用动物设施( , 湿度、12 h光/暗周期)提供免费食物和水的访问。食物是保留从动物实验开始前8 h。的动物保健机构安徽中医药大学批准所有动物研究。鼠敏感化是通过1毫升的氢氧化铝(10%)包含0.2%卵子(σ,密苏里州,美国):皮下注射大鼠与0.5毫升10分(0.05毫升每一点)颈部(1分),脚架(4分),返回(左,中心,三分),和双边腹股沟(两个点)和腹腔注射大鼠与剩余0.5毫升。0天执行敏感,在先前的研究中(20.,21]。开始14天postsensitization,动物暴露对7天每天一次雾化卵子在盐水(1%)30分钟使用喷气喷雾器(主;帕里GmbH,施塔恩贝格,德国;液滴直径:1 - 5μ米)(图1)。
2.2。动物治疗
老鼠被分为6组( )。盐是用于控制动物的致敏和挑战,而所有其他模式动物卵子。川芎嗪组大鼠使用卵子是敏化和挑战,之后,他们每天腹腔注射一次40或80毫克/公斤川芎嗪(哈尔滨三联药业有限公司,哈尔滨,中国,79 h1505)从14至21天,在先前的研究中(22]。茶碱(40毫克/公斤,上海Xinyijinzhu制药有限公司,有限公司,上海,中国)或地塞米松(1毫克/公斤,浙江仙居制药有限公司有限公司,杭州,中国)是腹腔内注入积极的对照组动物使用相同的剂量计划对于动物用川芎嗪治疗。所有这些化合物剂量选择的初步数据和之前的研究(20.- - - - - -22]。茶碱被选为非选择性PDE抑制剂(23),而使用地塞米松,因为它可以作为预防哮喘治疗(24]。21天postsensitization,我们实施安乐死的动物,收集他们的肺组织,snap-froze它们,并存储在-80°C。
2.3。分析了气道高反应
肺阻力( )和动态肺遵从性( )评估基于气道功能改变后静脉注射乙酰甲胆碱(MCh)注射25]。老鼠先麻醉;之后,他们被定位在一个有机玻璃全身体积描记器在仰卧位。airway-connected费舍尔管的压力传感器用于监测呼气流速,而肺容积的变化也评估基于plethysmographic腔内的压力变化。胸膜压力评估通过插入一根针与多个孔在顶部进入胸膜腔通过端口连接到一个压差传感器。胸膜之间的差异和嘴的压力被用来确定transpulmonary压力,与所有压力传感器信号不断加工(AniRes2005动物肺功能分析系统、北京、中国)基于拟合压力,流量和体积数据的运动方程。MCh-associated变化和评估使用剂量反应曲线,以应对妇幼保健剂量为0.5 8 g / L(吸入),因为这些剂量被发现引起气道代但不是死于初步实验。川芎嗪、茶碱和地塞米松影响这些气道反应确定基于比较的和药物治疗后变化意味着妇幼保健反应在同一个老鼠之前和连续控制时期。
2.4。血清IgE测量
血清分离器管被用来收集血液样本个体的老鼠。允许30分钟后凝血发生,管在旋转 10分钟。血清被收集并维持在-80°C。分析血清IgE水平,血清样本第一次旋转30分钟 在4°C,之后分析了上层清液与一只老鼠IgE-specific酶联免疫试剂盒(13015 r,原液生物技术有限公司)。
2.5。支气管肺泡灌洗液(BALF)分析
在24小时后最终的卵子的挑战,聚氨酯(1克/公斤,i.p。)是用来麻醉大鼠。这些动物的肺被清洗三次使用5毫升量包含1% BSA和5000 IU肝素生理盐水。这些洗胃样本然后汇集和旋转10分钟 在4°C,颗粒状细胞在哈佛商学院resuspended进行计算和分析。简单地说,使用Wright-Giemsa每样200个细胞被染色,之后,细胞在这些样本通过光学显微镜进行了评估。数据表示为每升BALF细胞。
2.6。组织学检查
集合后,肺部都使用neutral-buffered 10%福尔马林固定的7天。组织被paraffinized,切成5μ米部分,用苏木精和伊红染色(圆))前光microscopy-mediated评估炎性细胞浸润。
2.7。定量PCR (qPCR)
试剂盒(σ)是用于组织总RNA提取基于提供方向,之后cDNA合成装备(上海Sangon生物工程技术服务有限公司、上海、中国)被用于cDNA准备。接下来,qPCR是在20进行的μL反应卷包含2 x金星TaqMan混合物(10毫升),引物(F + R;每个在10毫米0.4毫升),探测器(10毫米,0.4毫升),互补脱氧核糖核酸(2毫升),nuclease-free dH2O (6.8μL)。Thermocycler设置如下:10分钟在95°C, 40 15秒的周期在95°C, 1分钟60°C。引物和探针序列如表所示1。
2.8。蛋白定量
coomassie蓝染色蛋白质分析工具包(南京建成生物工程研究所、南京、中国)被用来评估通过布拉德福德蛋白质含量的方法,与BSA作为参考标准。
2.9。西方墨点法
总共40μg蛋白从肺中提取样本electrophoretically分离(10% sds - page)和转移到硝化纤维膜。这个污点在TBST然后使用5%脱脂牛奶阻塞1 h与初级anti-PDE隔夜孵化前(1:500;Santa Cruz), anti-PDE4 (1: 500;圣克鲁斯)和反β肌动蛋白(1:1000;σ)。与二次抗体的屁股被探测,蛋白质乐队通过化学发光检测暴露在光密度分析。β肌动蛋白用于规范化蛋白表达(任意单位),与所有值在个人实验规范化与对照组样本。
2.10。统计分析
数据是 使用非参数测试和双尾和比较 - - - - - -测试,适当的。相对mRNA表达评估使用2- - - - - -△△Ct的方法。 意义阈值,所有数据都是代表两个或两个以上独立的实验。
3所示。结果
3.1。川芎嗪抑制大鼠哮喘模型气道代答
在目前的研究中,我们利用过敏性哮喘大鼠模型在敏化显著减少、显著提高相对于控制动物( )。当这些动物使用川芎嗪治疗,他们表现出减少气道代敏化和妇幼保健有关和值,但这些差异并不显著( )(图2(一个))。相比之下,与茶碱和地塞米松治疗显著降低这些OVA-sensitized老鼠气道代( )(图2 (b))。这可能表明,川芎嗪可以减少在一个哮喘模型气道高反应系统通过抑制炎症与卵子敏感和随后的雾化卵子的挑战。
(一)
(b)
3.2。川芎嗪降低哮喘大鼠的血清IgE水平
IgE的关键驱动因素支气管哮喘模型代答,这样,测量血清总IgE可以提供洞察哮喘疾病状态。因此,我们下一个测量血清总IgE不同的鼠治疗组(图3)。我们发现卵子敏感和挑战是与这些大鼠血清IgE水平升高有关,而川芎嗪(40毫克/公斤)和茶碱治疗与显著减少这些血清IgE水平。
3.3。川芎嗪抑制Allergen-Induced肺部炎性细胞浸润
allergen-induced哮喘使用相同的模型,我们下一个收集大鼠BALF样本在24 h postfinal卵子的挑战。不同的炎症细胞的数量在这些BALF样本然后计算。相对于控制大鼠( 细胞/ L),哮喘模型大鼠表现出增加4倍的总数在这些BALF细胞样本,而川芎嗪治疗(80毫克/公斤),在这些细胞数量显著减少,尽管茶碱和地塞米松对炎症影响更显著抑制细胞渗透进入肺部(图4(一))。相对于从控制大鼠BALF中 中性粒细胞/ L, 嗜酸性粒细胞/ L, 淋巴细胞/ L 单核细胞和巨噬细胞/ L, BALF OVA-challenged样本模型大鼠表现出130 - 15 - 2 - 7倍数量的增加,这些细胞类型,分别为(图4 (b))。川芎嗪(80毫克/公斤)治疗与嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数量显著降低BALF中这些动物相对于样本车辆control-treated模型动物(图4 (b))。这表明,川芎嗪能抑制炎症细胞进入肺部的涌入对过敏原致敏和随后的挑战在这只老鼠模型系统。
(一)
(b)
3.4。川芎嗪变弱气道炎症
肺组织样本收集来自所有老鼠在24 h后最后的卵子的挑战。分析这些组织样本显示,哮喘模型动物表现出显著的炎症细胞浸润(图5 (b))、嗜酸性粒细胞浸润到血管周的支气管旁空间(箭头所指)尤其增强相对于控制老鼠(图5(一个))。川芎嗪(图5 (c)和5 (d))或茶碱和地塞米松(数字5 (e)和5 (f))治疗,反过来,显著减少在这个OVA-induced肺嗜酸性粒细胞浸润的这些模型动物相对于车辆控制治疗。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.5。川芎嗪抑制PDE表达式在哮喘模型大鼠的mRNA水平
我们下一个评估通过qPCR PDE基因表达不同的鼠治疗组肺组织样本。我们确定卵子敏感和挑战在PDE(图与显著增加6(一))和PDE4(图6 (b)相对于控制老鼠)mRNA的表达。当老鼠与川芎嗪治疗,然而,他们表现出减少肺PDE和PDE4表达相对于车辆control-treated模型动物(数字6(一)和6 (b))。茶碱和地塞米松治疗也显著抑制这两种pd的表达在肺部卵子敏化和挑战(数字6(一)和6 (b))。
(一)
(b)
3.6。川芎嗪抑制PDE哮喘模型大鼠在蛋白质表达水平
最后,我们评估PDE在蛋白质水平表达这些哮喘模型大鼠的肺。我们发现,模型动物表现出显著的PDE和PDE4水平在肺部后卵子的挑战相对于控制动物(数字7(一)和7 (b))。相比之下,川芎嗪治疗与显著减少的水平这两个pd模型大鼠的肺相对于车辆控制治疗(数字7(一)和7 (b))。茶碱和地塞米松显著降低PDE和PDE4蛋白质含量在这些动物的肺相对于车辆控制治疗(数字7(一)和7 (b))。这些研究结果也验证了通过光密度分析(图7 (b))。在一起,我们的研究结果表明,川芎嗪可以通过一种机制减弱过敏反应与PDE和PDE4表达减少。
(一)
(b)
4所示。讨论
哮喘是一种潜在的严重的疾病,其特征是慢性肺部炎症和代答,从而导致重大的发病率和死亡率。哮喘患病率在最近几十年已经变得异常明显。目前,哮喘是主要使用吸入激素(ICS)和治疗β2肾上腺素能受体受体激动剂,但这些化合物通常表现出众多的副作用(26- - - - - -28]。因此需要新的哮喘治疗的发展,功能更有效率而导致更少的副作用。在华人社区,中医治疗策略通常采用替代的方法治疗儿童哮喘(29日]。为了更好地理解《中医药创新发展规划纲要哮喘治疗的治疗效果,我们设计了本研究专注于识别的机械基础川芎嗪治疗功效哮喘大鼠模型。川芎嗪是一种血管活性的当归的导数Chuanxiong长的矮,表现出一系列的antifibrotic,抗氧化,抗炎和免疫调节活动30.]。通常用于治疗癌症、心血管疾病、脑血管疾病,哮喘病人,通常与糖皮质激素相结合。中药单体准备川芎嗪和草药组成的单体被发现显著抑制(气道高反应31日]。川芎嗪也被先前显示减少嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞肺浸润在哮喘小鼠模型,这种效应是与变化Th1 / Th2和Treg / Th17细胞因子资料在这些动物32]。川芎嗪进一步被证明能够促进内皮细胞一氧化氮的生产,推动endothelium-dependent放松大鼠主动脉环的(33]。因此,我们推测,川芎嗪将函数作为一个有益的治疗哮喘。与此一致的是,我们发现川芎嗪治疗(40和80毫克/公斤)减少气道代鼠OVA-induced模型通过抑制哮喘炎症与卵子敏感和随后的雾化卵子的挑战。我们的结果与之前的工作表明川芎嗪能抑制OVA-induced气道高反应性,嗜酸性粒细胞,杯状细胞增生,气道重塑,Th2细胞因子的生产(22,31日,32,34- - - - - -36]。
此外,我们发现卵子敏化和挑战与这些大鼠的血清lgE水平增加有关,而川芎嗪和茶碱治疗与这些血清lgE水平显著降低。通过分析川芎嗪对肺部炎症细胞的影响,我们发现川芎嗪能抑制炎症细胞进入肺部的涌入应对过敏原致敏和随后的挑战在这只老鼠模型系统。与此同时,这些组织样本的分析从所有老鼠在24 h后,最终卵子挑战表明,川芎嗪或茶碱和地塞米松治疗显著降低这个OVA-induced肺嗜酸性粒细胞浸润的这些模型动物相对于车辆控制治疗。
在患有哮喘、肺营水平降低(21,37],cAMP-inducing试剂如茶碱、PDE4抑制剂β2受体激动剂可以提高肺功能而抑制炎症在动物和哮喘患者38- - - - - -40]。β2受体激动剂能促进cAMP-dependent MAP激酶磷酸酶(MJP) upregulation,从而促进bronchodilation和抑制炎症。以前的工作表明,MKP-1表达式是由营地,和PDE4是主要的PDE必要formoterol分解在ASM细胞反应(41]。在兔子,川芎嗪可以诱发阴茎海绵体平滑肌放松通过机制独立的一氧化氮和内皮,但这是由营cGMP的磷酸二酯酶抑制磷酸二酯酶(36]。这是类似于PDE5抑制剂西地那非,是有效的治疗哮喘和慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺病)除了用作勃起功能障碍药物(42,43]。与许多相关的副作用,但是,西地那非的使用仍有争议的治疗肺部疾病(44]。
PDE的家人的酶(PDE1-11)能够水解营地和/或cGMP的生化和药物不同的礼仪。PDE抑制可以调节许多不同的炎症和免疫反应相关的哮喘。PDE4抑制剂,值得注意的是,已被证明抑制气道代和炎症在哮喘动物模型(45,46]。与这些结果一致,PDE4激活被发现与与哮喘有关的炎症,和PDE4函数作为哮喘发病机制的关键中介(47,48]。某些PDE4抑制剂包括roflumilast cilomilast被翻译和成功在第二和第三阶段试验,与roflumilast (Daxas;奈科明)收到营销授权欧盟委员会作为维持治疗的严重慢性阻塞性肺病结合支气管扩张剂(49,50]。在此,我们发现川芎嗪治疗能抑制PDE和PDE4 mRNA的表达和蛋白质的水平,从而抑制水解。之前有明确的证据表明,增加营水平或细胞内营/ cGMP比率可以受益个人患有哮喘。因此,我们假设这样的PDE抑制可能是一种机制,川芎嗪抑制气道对过敏原代和炎症反应。PDE4抑制剂的临床使用,然而,限制他们可以造成严重的恶心和呕吐。pde主要调解他们的生物效应通过营地/ PKA途径。这些环核苷酸调解机制,不同的细胞内信号活动依赖于不同的组合支架蛋白(如激酶锚定蛋白(akap),β-arrestin,窖蛋白)、效应器(如环化酶,cAMP-dependent蛋白激酶(pka) cGMP-dependent蛋白激酶(pkg),直接交换蛋白激活营(EPACs)和蛋白质磷酸酶(PPs)),和监管效应物如extracellular-regulated蛋白激酶(erk) [51]。某些PDE或组pd函数作为所谓的“signalosomes”,和我们的研究结果表明,川芎嗪能抑制PDE和PDE4表达在肺部后卵子的挑战。我们都知道,选择性PDE4抑制剂如roflumilast和cilomilast有严重的胃肠道副作用,中枢神经系统的不良反应。川芎嗪几乎没有副作用根据长期临床实践(52),具体的机制,因此,川芎嗪功能可能与这些循环nucleotide-signaling通路有关。川芎嗪可能能够部分抑制多个pd,导致它有更少的副作用比特定PDE4抑制剂,并可能使其更有利于治疗哮喘。在一起,我们的研究结果表明,川芎嗪可以通过一种机制减弱过敏反应与PDE和PDE4表达减少。
总之,这项研究的结果表明,川芎嗪预处理能显著减少气道代和炎症在过敏原刺激大鼠哮喘模型系统。这个功效机制可能与抑制肺PDE的表达式。因此,这项研究提供了潜在的个人影响哮喘的治疗方法可能产生更好的治疗结果。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
附加分
迷你文摘。川芎嗪能抑制PDE活性和改善肺功能在哮喘大鼠模型,和这些变化与减少PDE表达的蛋白质和mRNA水平。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这个项目是国家自然科学基金支持的部分中国(30873076)、安徽省自然科学基金(1508085 qh161),安徽省的年度科学项目(1301043040),安徽省高校自然科学基金(没有。KJ2015A023),安徽省博士后基金会(2016 b095)。