肺癌的诊断模型的构建和验证基于6-Gene甲基化频率在血液、临床特征、血清肿瘤标记物

文摘

肺癌死亡率很高。促进早期诊断和筛查肺癌的最有效的方式是提高肺癌患者的生存率。通过计算机技术,基因检测结果的综合评价,肺癌患者的基本临床资料能有效地诊断早期肺癌和表明癌症风险。本研究回顾性收集70对肺癌组织样本和正常的人类组织样本。6基因的甲基化频率(RASSF1A基因FHIT基因p16,管理,APC, DAPK)在肺癌患者中,基本的临床信息,和肿瘤标志物水平的患者进行了分析。然后,python包“sklearn”是用来建立一个支持向量机(SVM)分类器执行10倍交叉验证建立诊断模型,可以确定肺癌疑似病例的风险。接受者操作特征(ROC)曲线,和性能的基于几个因素的综合诊断模型(临床信息、肿瘤标记物水平和血液中6基因的甲基化频率)被证明是比模型只有一个病理特征。组合模型的AUC值为0.963,和敏感性,特异性,和准确性分别为0.900,0.971,和0.936,分别。上面的结果显示,基于这些特性是高度可靠的诊断模型,可以屏幕和诊断疑似早期肺癌患者,有助于提高诊断速度和肺癌患者的生存率。

1。介绍

肺癌仍是全球癌症死亡的主要原因(1]。组织学检查由85% nonsmall细胞性肺癌(NSCLC)和15%的小细胞肺癌(SCLC)。非小细胞肺癌可以进一步细分为腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌,和支气管肺泡癌(BAC) [2]。肺癌的早期阶段是阴险,导致延误诊断晚期和极度贫困的患者预后[3]。由于高发病率、高死亡率和有限的治疗肺癌,促进早期诊断肺癌最有效的方法之一是降低死亡率和提高肺癌患者的预后。

早期筛查可以有效地降低肺癌的死亡率。现有的成像技术,如低剂量计算机断层扫描(CT)检查可以降低肺癌死亡率降低20%。然而,低剂量CT申请肺癌筛查是有限的误判率高和高成本,及其重复扫描会对人体造成一定的伤害4]。虽然几个外周血肿瘤标志物蛋白能够提高早期诊断,如癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、细胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)和粘蛋白16 (CA125),它无法被提升在临床实践中由于低敏感性和特异性(5]。因此,在当前的精确治疗肿瘤,迫在眉睫的是开发新型诊断方法为进一步提高肺癌的早期诊断的敏感性和特异性。大量研究表明,肺癌,CpG岛的甲基化修饰在肿瘤抑制基因的启动子区域,如FHIT基因p16,管理,RASSF1A基因,APC, DAPK,导致肺癌的发生和肺癌患者的不良预后6- - - - - -8]。管理,甲基化FHIT基因p16和RASSF1A基因潜在的优越的生物标记物,可用于肺癌筛查和辅助检测(9]。异常甲基化频率APC和DAPK基因的启动子区域里伸出手对肺癌的诊断(10,11]。有针对性的血浆游离DNA的甲基化测序(cfDNA)是有用的在肺癌的早期诊断12]。目前,应用计算机辅助诊断的癌症被广泛使用,而支持向量机(SVM)是一种最实用的分类方法。例如,最好的准确性为94.643%,灵敏度94.595% SVM分类器在测试中获得的57个新帕特数据从19卵巢癌患者建议SVM分类器强化促进癌症诊断(13]。尽管尝试构建methylation-related模型诊断,一些研究报道基于肿瘤标志物诊断模型的建设水平,基因甲基化频率,使用支持向量机分类器和临床特征。

基于先前的研究和调查,我们认为6肿瘤抑制基因的甲基化(RASSF1A基因FHIT基因p16,管理,APC,和DAPK)与肺癌患者的预后相关。因此,本研究试图建立一个诊断模型为疑似肺癌患者临床特征的基础上,6-gene甲基化频率在血液和肿瘤标志物水平通过使用支持向量机分类器。这个模型可以帮助患者的早期筛查和诊断肺癌,肺癌,展开尽早疑似患者的风险,从而治疗患者在时间和提高其存活率。

2。材料和方法

2.1。临床样本

本研究回顾了70例门诊病人(45岁男性和25岁女性,30到85岁)受肺癌在郑州大学第二附属医院和河南省级医院胸部2015.03.31 2019.11.31。病人在第四阶段我符合以下标准的人包括:(1)患者在临床和组织病理学诊断为原发性肺癌没有其他器官疾病;(2)病人之前没有收到任何放疗,化疗,或手术前抽样。正常的临床样本收集从70年健康的捐赠者(36男性和34岁女性,32到81岁)接受身体检查在郑州大学第二附属医院和河南省级医院胸部被招募为对照组。所有的健康受试者没有其他器官的疾病。病人的临床资料,包括年龄、性别、吸烟史、病理类型,主要病变,收集阶段。健康受试者临床信息包括年龄、性别、吸烟史。研究协议是医学伦理委员会批准郑州大学第二附属医院、河南省级医院胸部,和所有参与者签署知情同意。

2.2。cfDNA隔离和净化

试剂盒PAXgene®血液ccfDNA管(上海汇生物科技有限公司)是用于收集空腹静脉血(> 6毫升/病人)。血液样本在2000 r·分钟离心机¹15分钟在4°C。血清总是孤立的肿瘤标志物检测和cfDNA提取,分别。

cfDNA从血液样本中提取了GeneJET全血基因组DNA纯化迷你包(热费希尔科学)和纯度分析NanoDrop nd - 1000分光光度计(美国NanoDrop)。

2.3。检测肿瘤标志物

肺癌肿瘤标志物水平的血清样本评估以下包/制造商的指示。东航工具包(ab99992)和CA125工具包(ab274402)从Abcam购买,英国剑桥。CYFRA21-1工具包(猫No.211-10)和SCCA工具包(猫No.800-10)从瑞典访问CanAg(北京)。总之,相应的剂量的校准器和未知样本添加到每个微量滴定板;然后,50μl(连词合被分发到样本,移液和混合。板密封,孵化在37°C 60分钟,然后冲洗缓冲,紧随其后的是100μl潜艇三甲和孵化18°C-25°C 10 - 20分钟。最后,反应是通过添加100年停止μl(停止、移液和混合。每个微量滴定板的吸光度在450纳米是读30分钟内标。标准曲线绘制和样品的标准装备。东航的浓度、CA12 CYFRA21-1和SCCA在每个样本根据标准曲线确定。如果蛋白质的浓度> 50毫微克/分升,样本稀释并再次评估直到浓度< 50毫微克/分升。

2.4。Methylation-Specific聚合酶链反应(MSP)

基因启动子区域的甲基化状态是由MSP,和1μg cfDNA被甲基化分析。亚硫酸氢EpiTect工具包(试剂盒、德国)亚硫酸氢用于修改根据制造商的协议。那时的bisulfite-modified cfDNA用于MSP。甲基化设计特定的序列(M)和unmethylated特定序列(U)引物合成了广州生物技术公司,如表中列出1。PCR扩增中执行下列条件:95°C 12分钟,其次是40 95°C的周期为30秒,30秒60°C, 72°C,持续30秒。PCR产品在1.5%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色和凝胶成像仪观察和拍照。

2.5。模型建设和验证

这里,结合样本临床资料(年龄、性别、吸烟史),肿瘤标记物表达水平,和6基因的甲基化频率血,SVM分类器是由python包“sklearn”执行十倍交叉验证。然后,接受者操作特征(ROC)曲线绘制计算曲线下的面积(AUC)值来验证可靠性和评估建立诊断模型的性能。

通过敏感性预测模型的性能评价( ),特异性( ),和准确性(ACC) (14]。

, , ,和是真阳性的数量,真正的负面,假阳性和假阴性的样本,分别。

2.6。统计分析

卡方检验是评价肺癌患者和健康者之间的关系等方面的临床病理特征和基因甲基化频率。由于血清肿瘤标记物水平的患者和健康者不符合正态分布,使用的数据是由( ](M:中位数, :四分位数)和非参数Wilcoxon rank-sum测试实施对比组。 被认为是具有统计学意义。

2.7。代码的可用性

模型程序用于确定病人是否有肺癌是由我们的团队成员,提供开源模式的代码(https://github.com/732618078/Classifier/blob/main/svm.py)。

3所示。结果

3.1。包括样本的基本信息

所有样本的基本信息和临床特征包括在本研究详细的表2。共收集140份血液样本,包括70年样本肺癌患者和70名健康受试者的样本。结果显示分布的年龄,性别,吸烟史肺癌患者和健康受试者之间没有统计学上的不同。

3.2。检测肿瘤标志物

共有140名肺癌患者和健康受试者的血样收集进行分析。结果表示,四种血清肿瘤标记物水平(SCCA,东航,CYFRA21-1和CA125)肺癌的患者明显高于健康受试者的数据具有统计上的显著差异,如表所示3。

3.3。6基因的甲基化频率的血液

管理,本研究发现FHIT基因P16, RASSF1A基因,APC, DAPK肺癌的甲基化标记通过文献综述和先前的研究[9- - - - - -11]。上面的6个基因的甲基化频率在140年肺癌患者和健康受试者的血样进行评估通过MSP,如表所示4。结果显示,这6个基因的甲基化频率在肺癌患者显著高于健康受试者,和数据具有统计上的显著差异。

3.4。诊断模型的建立和验证

better-diagnosing肺癌患者的临床医生、临床资料(年龄、性别、吸烟史),肿瘤标记物表达水平或风险基因的甲基化分析了单独或集体的10倍交叉验证的支持向量机分类器。之后,几个诊断模型被ROC曲线(图构造和验证1)。结果表明,组合模型基于临床信息,肿瘤标记物表达水平和风险基因甲基化水平最佳的性能比其他模型只有一个功能,AUC值为0.963,这是大于其他三个模型的AUC值(0.905,0.805,0.542) , ,ACC的0.900、0.971和0.936,分别,这表明肺癌的综合诊断模型基于上述特点有良好的性能。

4所示。讨论

肺癌是最致命的癌症,早期很难被检测到,因此,大多数病人已经确诊的晚期(15]。目前疑似病例的诊断评估肺癌的诊断,包括组织完整的分期,转移评估,和患者评价函数,而假阳性率相对较高(16]。此外,低剂量CT筛查肺癌可以提高早期诊断水平,但它的主要缺点是成本高和重复扫描,将对人体造成一定的伤害4]。这样的方法,然而,未能诊断肺癌的疗效。因此,探索方法,可用于提高肺癌的诊断速度提供了广阔的研究前景。

肿瘤标记重要的筛查、诊断和疗效评价肺癌,但是他们的独立使用无法准确识别和诊断肿瘤特异性和灵敏度较低5]。因此,本研究试图建立一个基于肿瘤标志物诊断模型水平和其他特征的肺癌患者。DNA甲基化是一种新发现的生物标志物的诊断、预后、治疗和预测,也是一个最合适的最早,也是最重要的17]。相关研究表明,肺癌的发生和发展是通过控制调节异常DNA甲基化,非编码rna,组蛋白乙酰化作用,在异常的DNA甲基化是主导。CpG岛肿瘤抑制基因的DNA启动子区域甲基化起着关键作用在肺癌的发生和发展18]。例如,杨et al。19]研究DAPK启动子的甲基化频率在NSCLC组织和癌前正常组织,前者明显高于后者。燕et al。20.)发现FHIT基因启动子区域甲基化在非小细胞肺癌组织中显著高于正常肺组织和更高的在非吸烟人群。FHIT基因甲基化也与风险增加和不断恶化的非小细胞肺癌的生存。Pankova et al。21)认为,RASSF1A基因启动子区域甲基化会增加肺癌干细胞的特点和提高肺癌转移进展的风险。此外,肿瘤抑制基因p16、APC,管理在肺癌组织中被证实是hypermethylated [22]。这些调查表明,肿瘤抑制器基因的甲基化差异有助于诊断肺癌患者健康的人在某种程度上。因此,本研究招募了70名肺癌患者和70名健康受试者6-gene通过MSP检测,和一个显著差异被发现肺癌患者和健康受试者之间在基因的甲基化频率。

支持向量机的基本思想是通过映射和构造分类超平面,为了解决这一问题,将低维空间中的非线性问题转换成线性问题,在高维空间中(23]。机器学习作为发展中遇到了许多问题,如局部最小值,非线性,和维灾害,以及模型选择和过度拟合,而支持向量机可以部分解决上面的问题23]。如今,建立预测模型结合机器学习成为肺癌诊断的一种有效方法。例如,根据收集的CT图像特性,Kavitha et al。24)有效地分割肺结节基于模糊c均值聚类(FCM)技术和诊断癌症阶段基于SVM分类器。陈等人。25]提出MEM-SVM结合修改electromagnetism-like机制(EM)算法与支持向量机作为分类器,结果证明MEM-SVM,具有良好的诊断能力,可以作为替代诊断工具申请其他医疗测试从肺癌脑转移的早期检测。在这项研究中,十倍交叉验证进行的独立应用临床特征(年龄、性别、吸烟史),肿瘤标志物的水平,和6-gene甲基化频率,或联合应用上述三个特征通过使用支持向量机分类器。验证结果证明了组合模型是最优ROC曲线的AUC值为0.963,和 , ,和值为0.900,0.971和0.936,分别。这些结果显示,合并后的肺癌诊断模型有良好的性能,很可能诊断肺癌患者健康的人。

总之,本研究建立了一个结合肺癌的诊断模型和有利的功效通过SVM分类器基于样例的临床特性,肿瘤标志物水平,6-gene甲基化频率。这个模型建立在这项研究可能帮助临床医生在一个精确的测定在早期肺癌患者/肺结节,从而提高诊断速度和早期肺癌的生存率。本研究在一定程度上有临床应用价值。虽然上述研究可以验证模型的准确性,仍然存在不足。需要做进一步的工作来验证这个模型对肺癌的诊断价值通过扩大样本容量与多中心组合和标准化的检测证明测试。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。如果需要任何额外的数据和材料可以从相应的作者以合理的要求。

同意

所有作者同意提交出版的手稿。

的利益冲突

作者宣称他们没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

CY为研究设计做出了贡献。JC进行文献搜索。DD获得数据。XZ写了这篇文章。LX进行数据分析。外汇起草。JC修订文章的最终批准,并提交的版本。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

本研究支持的基金从河南省的科技项目(192102310373)。本研究基金支持的重点科研项目的高校在河南省(19 a310011)。

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