P3H4超表达是肺腺癌的预后因素

文摘

背景。本研究旨在评价功能和P3H4在肺腺癌的临床价值。此外,我们还调查了下游通路P3H4可能参与。方法。微分表达式分析用来确定差异表达基因在肺腺癌组织与正常组织相比。生存分析是用来测试P3H4和生存时间之间的关系。基因集富集分析下游途径进行了探讨。CCK8和transwell用来检查P3H4对细胞表型的影响。结果。P3H4高度调节在LUAD组织RNA和蛋白质含量。此外,LUAD病人,P3H4的高表达,也观察到有较短的无病生存期和总生存期。这些结果表明,P3H4可以作为LUAD预后的生物标志物。此外,我们还发现,这是拷贝数改变(CNAs), DNA甲基化,P3H4监管RNA的表达,表明其upregulation可能部分源于CNAs。此外,功能实验表明A549和小干扰rna治疗(siP3H4) H1299细胞表现出显著降低24小时后细胞增殖,迁移能力和侵袭性。P3H4功能,调节蛋白的高表达组主要富集在肿瘤microenvironment-related吞噬体等途径,粘着斑,和ECM-receptor交互和癌症相关的通路如膀胱癌症通路,在癌症的蛋白聚糖,河马信号通路。结论。本研究系统地评估在LUAD P3H4的功能和临床价值,并探讨相关的生物通路。P3H4可能通过调节肿瘤microenvironment-related促进LUAD发展途径。

1。介绍

肺腺癌(LUAD)是一种主要的非小细胞肺癌(NSCLC) (1]。肺上皮细胞的发展,这也是最常见的一种肺癌,占近40%的肺癌病例(2]。相比其他亚型的肺癌、肺腺癌是不那么咄咄逼人,和良好的预测是观察小,患者局部腺癌(I期)(3]。然而,大多数患者LUAD诊断晚期,发生了转移,导致一个令人沮丧的存活率4,5]。

肿瘤微环境(时间)和当地的组织细胞外基质(ECM)被发现是重要的球员在各种癌症(肿瘤进展和转移6- - - - - -8]。肿瘤细胞和免疫细胞之间的串扰调节肿瘤发生的多个方面,并针对重要途径在时间被认为是一种很有前途的治疗策略9]。同时,肿瘤相关巨噬细胞(tam),这是一个丰富的细胞群的时间,可以调节免疫抑制分子的表达,如PD-L1和吞噬作用抑制剂,从而促进肿瘤进展和抵抗治疗(10]。

Prolyl 3-hydroxylation (P3H)是一种罕见但守恒的转译后的修改在许多胶原蛋白类型(11),可能与肿瘤微环境(12]。具体来说,P3H基因的两个成员,P3H2 P3H3,小说被确定为目标表观遗传沉默在乳腺癌(13]。在膀胱癌,击倒P3H4将导致逮捕了细胞周期和减少EMT-related蛋白质的表达水平,表明沉默P3H4可以有效地抑制膀胱癌的不受控制的增殖和侵袭性(14]。同时,增加P3H4表达式之间的关联和高病理阶段,更糟糕的是生存已经观察到在膀胱癌15]。此外,P3H4推断从序列相似性是在一个复杂的交联的胶原原纤维和胶原蛋白交联据报道,增加肿瘤细胞增殖和促进转移(16,17]。在此,我们进行了系统分析P3H4在肿瘤组织RNA和蛋白质含量,并演示了它对癌症细胞功能的影响,预测潜在的功能和机制的阐明P3H4 LUAD。

2。材料和方法

2.1。基因表达数据收集

基因表达数据集得到从公共数据库包括UCSC的齐娜(https://xena.ucsc.edu/),加入数字:TCGA-LUAD [18]。片段每公斤百万(FPKM)基因表达为RNA序列数据计算为基础,分别。总之,人类参考基因组的读取是对齐的明星v2 (19),和基因表达水平衡量HTSeq [20.]。LUAD和邻近的正常组织的蛋白质表达数据收集从LinkedOmics (http://linkedomics.org)。

2.2。差异表达分析

差异基因表达水平受到学生的测试- - - - - -测试和褶皱变化方法。的通过学生的价值观 - - - - - -测试是由Bonferroni调整的方法。的基因,调整值< 0.05和 ,被确定为特异表达基因。

2.3。生存分析

建立了单变量Cox回归模型来评估P3H4表达水平之间的关系和LUAD生存时间。样本分层分为高低P3H4表达式组使用中值表达式P3H4截止。协会的统计意义P3H4生存率较与生存时间评估。生存分析是在R中实现生存包(21]。

2.4。的基因分析

浓缩传播的分析(ORA)是用来确定Reactome途径丰富的调节基因(22]。核糖体蛋白的富集程度与P3H4高度相关的基因通过基因集富集分析测试(GSEA)。奥拉是在R中实现clusterProfiler包(23]。

2.5。细胞培养和转染

两人肺癌细胞株A549和H1299购自上海药物研究所是中国科学院(CAS)。这些细胞培养在rpmi - 1640中补充10%胎牛血清(Gibco)和1% penicillin-streptomycin和孵化37°C公司为5%₂。两个small-interface rna专门绑定P3H4 mRNA和消极的控制被表示为si-P3H4-1, si-P3H4-2, si-NC。进行转染的细胞对数生长期使用Lipofectamine 2000(热费希尔科学)。以下是siRNAs的序列:si-P3H4-1-GGGCUGUGAAGCUCUACAACA;si-P3H4-2-GGCACGCUCUGGAGCAGUACG。

2.6。实时逆转录聚合酶链反应

从A549和H1299细胞总rna分离使用试剂盒试剂。制造商的协议后,我们进行了使用PrimeScript RT的反转录试剂盒(豆类、东京、日本)。P3H4 mRNA表达定量分析使用ABI棱镜7900 ht(应用生物系统公司,培育城市,CA),与GAPDH作为内部参考。以下是P3H4的引物:forward-5 - - - - - -CATGAGCAGGTGGACTTCAAGG-3 ,reverse-5 - - - - - -ACTTGTCCACGAAGTAGCCACC-3 ;和引物GAPDH: forward-5 - - - - - -AGGCTGTTGGGAAAGTTCTTC-3 ,reverse-5 - - - - - -ACTGTTGGAACTCGGAATGC-3 。所有这些实验进行了一式三份。

2.7。细胞计数Kit-8 (CCK8)测定

CCK8化验是用来检测细胞增殖。在96 -孔板进行了实验 ³细胞/。使用一个微型板块读者(Bio-Rad、上海、中国),我们发现后的吸光度在450 nm手册。所有这些实验进行了一式三份。

2.8。Transwell化验

transwell室(8μ米孔隙大小;微孔)和钱伯斯涂层与基底膜基质被用来进行细胞迁移和入侵检测,分别。细胞( ⁴细胞)与转染48小时被种植到参议院,和500年μL中含有10%的边后卫下室。迁移或入侵细胞的4%多聚甲醛,在37°C孵化24 h,固定为30分钟和紧张0.1%结晶紫20分钟。所有这些实验进行了一式三份。

2.9。统计分析

multiple-sample和两个示例比较试验的方差分析(方差分析)和学生的 - - - - - -用R语言测试。数据可视化的平均值和95%置信区间。假设测试,值< 0.05,被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。的mRNA表达P3H4高度调节肺腺癌组织中

探讨RNA表达水平的P3H4肺腺癌(LUAD)和正常组织,我们LUAD的表达与正常组织相比,使用癌症基因组图谱,TCGA LUAD队列。具体来说,P3H4 RNA表达高度调节在LUAD(图1(一),Wilcoxon等级和测试,值< 0.001),其中约2倍比正常组织。生存分析显示,短总体存活率在样品高mRNA的表达P3H4相比与较低的mRNA表达(图1 (b),值< 0.05)。

为了进一步探索P3H4的转录,我们调查是否拷贝数改变(CNAs)和DNA甲基化水平与它的RNA表达有关。DNA甲基化之间的皮尔逊相关性和RNA的表达P3H4约为-0.081,表明P3H4 mRNA表达差与DNA甲基化(图有关1 (c),值= 0.072)。此外,肿瘤样本之间的比较P3H4 RNA的表达与P3H4增益和那些没有P3H4增益显示P3H4表达高于那些P3H4获得(图1 (d),值< 0.001)。这些结果表明,P3H4高度调节LUAD组织及其upregulation可能部分源于CNAs。

3.2。验证在LUAD P3H4高表达的蛋白质水平

在LUAD P3H4是高度调节RNA水平,然后,我们使用质谱检测其蛋白表达蛋白质组学数据从徐et al。24]。一致,P3H4也是调节蛋白表达的LUAD与正常组织相比(图2(一个),值< 0.001)。的进一步生存分析P3H4蛋白表达证实P3H4蛋白表达也高度相关的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)(图2 (b)、生存率较值< 0.05),表明P3H4蛋白表达在LUAD预后不良的指标。测试的独立性P3H4蛋白表达在LUAD生存的预测,我们进行了多变量Cox回归分析使用TNM分期、年龄、分化水平代数余子式。值得注意的是,P3H4蛋白表达也显著的多变量Cox模型(图2 (c)),这表明P3H4 LUAD蛋白表达是一个独立的预后因素。这些结果进一步表明,P3H4高度调节和LUAD可能作为一个独立的预后因素。

3.3。沉默的P3H4抑制肺癌细胞增殖

探索是否P3H4监管肺癌细胞的功能,我们通过两个小接口rna沉默P3H4基因(siRNAs)使用A549和H1299细胞线。具体来说,P3H4的RNA表达水平显著抑制siRNAs(数字3(一个)和3 (b),值< 0.05),表明这个核可以有效地减少P3H4 RNA表达。与消极的控制(siNC)相比,两个细胞系siRNAs治疗(si-P3H4-1和si-P3H4-2)表现出显著减少细胞增殖(数字3 (c)和3 (d),值< 0.05),表明P3H4基因沉默可能抑制A549和H1299细胞不受控制的增殖。

3.4。沉默P3H4抑制肺癌细胞的入侵和迁移

此外,我们还发现P3H4沉默对癌症的影响细胞迁移和入侵。具体来说,transwell化验显示,击倒的P3H4可以显著抑制A549的侵袭性和H1299细胞株(数字4(一)和4 (b))。此外,A549的迁徙能力下降和H1299 P3H4沉默也观察到transwell试验(数据4 (c)和4 (d))。这些结果表明,P3H4沉默可以显著抑制肺癌细胞入侵和迁移。

3.5。P3H4-Related信号通路

进一步探索在LUAD P3H4蛋白质的生物功能,蛋白质组的肿瘤样本组进行分层分为高低P3H4表达式组。微分表达式分析确定305年调节和11个表达下调的蛋白质(补充表S1调整后值< 0.05和 )。值得注意的是,只有调节蛋白成功丰富KEGG通路的基因集富集分析,表达下调的蛋白质的数量是很小的。具体来说,调节蛋白质P3H4蛋白高表达组主要是丰富的通路调节肿瘤微环境如吞噬体、粘着斑,和ECM-receptor交互和癌症相关的通路如膀胱癌症通路,在癌症的蛋白聚糖,河马信号通路(图5(一个))。途径和相关基因的网络可视化显示FLNC, PLAU, WNT5A, THBS1, MSR1, FRMD6, PLAUR, MMP2, DAPK3, AKT3, THBS2, TUBB2B, GPC1, MMP1、WWTR1, PDGFRA, RASSF2, THBS3, C1R, MRC2,排版,ITGA11中心基因在这些癌症或肿瘤microenvironment-related通路(图5 (b))。这些结果表明,P3H4可能通过调节促进LUAD进展癌症和肿瘤microenvironment-related通路。

4所示。讨论

在这项研究中,为了研究的表达模式和临床价值P3H4在肺腺癌中,我们进行了差异表达分析和生存分析,TCGA和蛋白质组群。具体来说,P3H4高度调节在LUAD组织RNA和蛋白质含量。此外,LUAD病人,P3H4的高表达,也观察到有较短的无病生存期和总生存期。这些结果表明,P3H4可以作为LUAD预后的生物标志物。值得注意的是,P3H4也观察到是与膀胱癌的预后密切相关15,25]。癌症是由基因和外遗传性改变CNAs和DNA甲基化异常26,27),我们调查的规定P3H4基因组和外遗传性改变。比较分析和相关分析显示,这是区域不是DNA甲基化,P3H4监管RNA的表达,表明其upregulation可能部分源于CNAs。随着DNA是更稳定的RNA,相对数量的副本P3H4可以用来评估P3H4表达水平与患者的风险使用肿瘤组织或循环肿瘤细胞(CTC) [28]。

P3H4 LUAD中高度表达,然后探讨肺癌细胞的功能是否能被压制P3H4显著改变。具体地说,与消极的控制(siNC)相比,核的细胞治疗(siP3H4)表现出显著减少细胞增殖,迁移能力,并使用A549和H1299细胞系侵袭性。持续的抑制增殖和P3H4击倒的入侵也观察到在膀胱癌14]。

功能,我们还探讨了在LUAD P3H4蛋白质的生物功能。P3H4调节蛋白的高表达组主要富集在肿瘤microenvironment-related吞噬体等途径,粘着斑,和ECM-receptor交互和癌症相关的通路如膀胱癌症通路,在癌症的蛋白聚糖,河马信号通路。值得注意的是,分子细胞外基质如ITGA11本地化,PDGFRA, THBS1/2/3, COMP coexpressed P3H4和可能P3H4的直接目标。ITGA11发现提高人类非小细胞肺癌细胞的致瘤性通过调节IGF2表达成纤维细胞(14]。PDGFRA是一个著名的生长因子受体和被广泛报道传输信号在各种癌症29日,30.]。血小板反应蛋白(tsp) multifaced蛋白质和作为肿瘤微环境的重要组成部分31日),这表明P3H4可能是肿瘤微环境的调节器。,先前的研究还发现,P3H4参与调节肿瘤微环境和涉及对靶向治疗和免疫治疗的敏感性12,32]。

总之,本研究系统地评估的表达水平和临床价值P3H4 LUAD和探索相关的生物学途径。P3H4可能通过调节肿瘤microenvironment-related促进LUAD发展途径。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前的研究中可在公共数据库包括TCGA和地理,已被认为是在材料和方法参考。

同意

所有作者都同意发表这手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

海萍一刃江和罗的构思和设计实验。峰金和Haiqing周获得数据,相关材料和分析工具。峰金进行了实验和分析数据。崔向峰金和香港写道。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

我们承认的贡献所有的调查人员参与研究的网站。

补充材料

补充表S1:肿瘤样本之间的差异表达基因有高和低P3H4表达式。(补充材料)

引用

1. j . n . Bodor诉Kasireddy, h . Borghaei”一线治疗转移性肺腺癌没有司机突变,”肿瘤学实践/美国临床肿瘤学会杂志》上,14卷,不。9日,第535 - 529页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. t . v . Denisenko i n Budkevich, b . Zhivotovsky“细胞death-based肺腺癌的治疗,”细胞死亡和疾病,9卷,不。2,p。117年,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. k . Jao p . Tomasini s Kamel-Reid et al .,“单个和多个癌症相关的预后影响体细胞突变切除的非小细胞肺癌,”肺癌卷,123年11月,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. 美国Blandin骑士,p . a . Crosbie h .橡胶j . Chudziak t . Hussell和c .潜水”肺癌早期检测的进展和前景”开放的生物学,7卷,不。9日,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. j·j·林,s . Cardarella c·a·莱登et al .,“五年存活率_EGFR_突变与EGFR-TKIs转移性肺腺癌治疗,”胸部肿瘤杂志,11卷,不。4、556 - 565年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. a Dongre r·a·温伯格,“新见解epithelial-mesenchymal转型的机制和影响癌症,”自然评论。分子细胞生物学,20卷,不。2、69 - 84年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 华盛顿号和洛杉矶Shevde肿瘤微环境天生就调节癌症恶化。”癌症研究,卷79,不。18日,第4566 - 4557页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. a·g·霍金斯诉《f . da Veiga Leprevost et al .,”尤因检查参与组成分泌腺肉瘤及其反应激活Wnt /β-连环蛋白的信号,”分子和细胞蛋白质组学,17卷,不。5,901 - 912年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. l .回族和y陈”,肿瘤微环境:魔鬼的避难所。”癌症的信,卷368,不。1、7 - 13,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. y田,m . Lu w .悦et al .,“TFIIB-related 2与不良预后相关因素nonsmall通过促进肿瘤细胞肺癌病人epithelial-mesenchymal过渡,“生物医学研究的国际文章ID 530786卷,2014年,13页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. d·m·哈德逊和d·r·艾尔”胶原蛋白prolyl 3-hydroxylation:一个小翻译修饰的一个主要角色呢?”结缔组织的研究,54卷,不。4 - 5,245 - 251年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. y . w . Lim g·l·科尔斯s . k . Sandhu d·s·约翰逊,a·s·阿德勒和e . l .石头,“单细胞转录组显示PD-L1 / TGF -的影响β封锁在肿瘤微环境,”BMC生物学,19卷,不。1,p。107年,2021。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. r·沙阿·史密斯c Purdie et al .,”的prolyl 3-hydroxylases P3H2和P3H3小说在乳腺癌,表观遗传沉默目标”英国癌症杂志》,卷100,不。10日,1687 - 1696年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. l ., k彭日成,h彭日成et al .,“击倒P3H4抑制增殖和入侵膀胱癌,”老化,12卷,不。3、2156 - 2168年,2020页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. z, A·侯赛因et al . g . Liu”co-expression网络差异表达基因在膀胱癌和风险评分模型预测生存,”Hereditas,卷156,不。1,p。24日,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. m . e .听到r . Besio m . Weis et al .,“Sc65-null老鼠为小说提供证据,内质网复杂调节胶原lysyl羟基化,“公共科学图书馆遗传学,12卷,不。4篇文章e1006002 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. 贝克·t·r·考克斯,d .鸟,a . m . et al .,“LOX-mediated胶原蛋白交联负责fibrosis-enhanced转移。”癌症研究,卷73,不。6,1721 - 1732年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. f . Farshidfar郑,m . c . Gingras et al .,“综合胆管癌基因组分析确定不同_IDH_突变体分子资料,”细胞的报道,18卷,不。11日,第2794 - 2780页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 多布林,c·a·戴维斯f·施莱辛格et al .,“明星:超速普遍RNA-seq对准器,”生物信息学卷,29号1、15至21,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. s .安德斯·p·t·所有和w·胡贝尔”HTSeq——一个Python框架来处理高通量测序数据,”生物信息学没有,卷。31日。2、166 - 169年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. j·c·a·李“书评”,社会学方法与研究,32卷,不。1,第120 - 117页,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. 他g . Yu和问:y,“ReactomePA: R / bioconductor包reactome途径分析和可视化,”分子生物系统,12卷,不。2、477 - 479年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. g . Yu l . g . Wang和y汉,“clusterProfiler: R包比较生物基因簇之间的主题,“组学,16卷,不。5,284 - 287年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 王j.y.徐,c .张x et al .,“综合人类肺腺癌的蛋白质组学鉴定,”细胞,卷182,不。1,页245 - 261。2020年e17 e217。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. l . w . Li, y,陈平,“P3H4是与膀胱癌的临床病理特征和预后相关,”世界肿瘤外科杂志》上,16卷,不。1,p。206年,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. a·e·摩根,t·j·戴维斯和m . t . Mc Auley“DNA甲基化在衰老和癌症的作用,“《美国营养学会,卷77,不。4、412 - 422年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. l . a . Pikor v . r . Ramnarine s Lam和w·l·林”基因改变定义非小细胞肺癌亚型及其治疗的影响,“肺癌,卷82,不。2、179 - 189年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. x倪,m .卓苏z . et al .,“可复制的拷贝数变异模式单一的肺癌患者循环肿瘤细胞中,“美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷110,不。52岁,21083 - 21088年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. j . Haybaeck段y, z,”治疗的潜力mTOR / PI3K / AKT通路在胃肠道间质瘤:基本原理和进展,”癌症,12卷,不。10,2972年,页2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. c·塞拉诺和美国乔治,”胃肠道间质肿瘤:挑战和机遇的新十年,“临床癌症研究,26卷,不。19日,5078 - 5085年,2020页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. d . Ramchandani诉米塔尔,“血小板反应蛋白在肿瘤微环境,”实验医学和生物学的发展卷,1272年,第147 - 133页,2020年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. e . Koedoot l .种m .萧述三et al .,“微分重组的乳腺癌亚型在3 d文化和影响对靶向治疗的敏感性,”科学报告,11卷,不。1,p。7259年,2021。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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