文摘

客观的。确定microrna的机制- 144 - 5 - p和ITGA3在甲状腺癌(TC)。方法。从癌症基因组图谱(TCGA), RNA表达谱得到microrna的表达分析和TC的mrna。存在和免疫印迹是利用测量microrna的表达- 144 - 5 - p和ITGA3在RNA和蛋白质含量,分别。microrna的之间的关系- 144 - 5 - p和ITGA3 dual-luciferase试验验证。transwell CCK-8,刮伤愈合,流式细胞术分析了评估肿瘤细胞的行为。结果。Low-expressed microrna - 144 - 5 - p和high-expressed ITGA3 TC细胞被发现相对于正常细胞。microrna - 144 - 5 - p的表达与抑制增殖的影响呈正相关,入侵和TC细胞的迁移能力而消极与细胞凋亡有关。microrna的p - 144 - 5 -抑制ITGA3表达式在TC,及其超表达显著逆转肿瘤促进作用的过表达ITGA3 TC的生物功能。结论。在我们的研究证明,细胞生长抑制TC的microrna - 144 5 - p / ITGA3轴,TC代表一个潜在的目标。本研究提出了一种新的洞察TC治疗的策略。

1。介绍

甲状腺癌(TC)被认为是内分泌癌症,不断增加的发病率在过去几十年1]。TC可以分为不同的亚型,乳头状甲状腺癌(PTC)占据了大部分的新TC情况下(2]。用特定的方法治疗如手术、放射碘和促甲状腺激素抑制,大量的病人显示一个相对最佳的改善他们的身体状况。然而,仍有复发和转移的肿瘤3- - - - - -5]。同时,由于未熟的TC患者预后评估,许多病人遭受过度治疗(6]。考虑TC治疗和预后的挑战,它的意义进行深入探索TC的分子机制,这是能够提供有价值的见解治疗和预后评估的发展。

microrna的失调是许多研究表明严重与肿瘤相关过程(7]。同时,microrna小说被视为癌症生物标记(8- - - - - -10]。在许多microrna在许多癌症特异表达,microrna - 145被报道的肿瘤抑制宫颈癌(11),肺腺癌(12),和胃癌13]。通过生物信息学分析,microrna - 144 - 5 - p是低表达在TC和涉及细胞粘附和细胞迁移14]。但是目前缺乏实验数据,在一个需要实验来验证microrna的可能造成的影响- 144 - 5 - p在TC进展。

整合素α3 (ITGA3)细胞表面粘附分子,主要表现在细胞膜。据报道,ITGA3可以与细胞外基质相互作用的蛋白质,和它的表达与肿瘤转移相关15]。此外,分子机制研究,生物信息学分析结果显示,ITGA3被认为是一个关键的生物标志物对胰腺癌和可以通过P53 / TGF -促进癌症恶化β有关的通路(16]。Upregulation ITGA3施加一个奖励的角色在肝内胆管癌的细胞增殖和表示预后不良(17]。尽管一些机制在TC ITGA3报道(18],ITGA3在TC的详细功能和潜在机制仍然未知。因此,监管ITGA3对TC的影响的研究可以提高ITGA3作为癌症的理论建设监管机构。

总之,目前的研究集中在microrna的影响- 144 - 5 - p和ITGA3 TC,和microrna - 144 - 5 - p / ITGA3监管轴是由生物信息学方法和dual-luciferase化验。在这个研究结果提供了新的理论支持TC疗法。

2。材料和方法

2.1。生物信息学方法

从癌症基因组图谱(TCGA) (https://portal.gdc.cancer.gov/),成熟的microrna(正常:59,肿瘤:514),信使rna表达数据(正常:58,肿瘤:510)和临床数据(2019年12月19日)TC。然后,差异表达microrna (DEmiRNAs)和mrna (DEmRNAs)访问微分分析( , )。目标microrna的预测是通过miRTarBase (http://mirtarbase.mTC.nctu.edu.tw/php/index.php)和TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/)数据库获得的DEmRNAs microrna的结合位点。皮尔森相关分析进行microrna - 144 - 5 - p和候选人mrna确定目标。临床分期目标mRNA进行分析。

2.2。细胞系和文化

人类正常的甲状腺细胞线HTori-3 (BNCC338687), TC细胞系TPC-1 (BNCC338689), ftc - 133 (BNCC337959) KTC-1 (BNCC340144),和8505 c (BNCC340524)采购从希伯来文名字文化(中国)集合。F-12K介质(BNCC341829,希伯来文名字,中国)是准备培养HTori-3, KTC-1和8505 c,和rpmi - 1640中(BNCC341471,希伯来文名字,中国)ftc - 133和贝克汉姆的l - 15 (l - 15)介质TPC-1 (BNCC341687,希伯来文名字,中国)。10%胎牛血清(的边后卫)是包含在上述介质细胞系标准培养条件下孵化。

2.3。细胞转染

microrna - 144 - 5 - p模仿(miR-mimics),负控制模拟(miR-NC) pcDNA3.1-ITGA3质粒(oe-ITGA3)编码ITGA3和空白质粒pcDNA3.1 (oe-NC)向量都采购RiboBio(中国)。遵守操作说明,Lipofectamine 2000工具包(美国卡尔斯巴德英杰公司)在使用中转染模仿/质粒为TC细胞系TPC-1和ftc - 133。细胞转染后24 h用于进一步的实验。

2.4。实时聚合酶链反应

试剂盒试剂(美国生活技术)是用于提取总RNA。miScript II RT工具包(美国试剂盒)被用来恢复microrna与信使核糖核酸的互补。绿色的miScript SYBR PCR试剂盒(试剂盒、德国)被用来测量microrna的表达水平和信使rna。然后,存在操作在应用生物系统公司®7500实时PCR系统(热费希尔科学、马)。GAPDH是作为ITGA3内部参数,和U6 microrna - 144 - 5 - p。引物序列表现出表1。2- - - - - -ΔΔCt值是用来评估的相对表达microrna - 144 - 5 - p和ITGA3。

表1
引物序列中存在。
2.5。免疫印迹分析

无线电免疫沉淀反应分析裂解缓冲(Beyotime,中国)被用来提取细胞溶解产物。量化由BCA蛋白质分析工具包(Beyotime,中国),蛋白质12% sds - page分离和转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉是用来保持膜密封2 h;然后,它孕育了隔夜主要抗体在4°C。接下来,磷酸盐与渐变®是用来冲洗膜和在室温下培养的二次抗体2 h。最终,一个增强化学发光(ECL)工具包(美国通用电气医疗集团)是用于检测蛋白质的信号。主要的抗体兔子anti-ITGA3 (ab131055 0.3μg / ml)和兔anti-GAPDH (ab181602, 1: 10000)和二次抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白(ab205718)提供的Abcam(中国)。

2.6。细胞计数Kit-8 (CCK8)测定

96孔板( 这里使用细胞/)接种和培养细胞在37°C公司为5%2。孵化为0,24、48、72、和96 h, 10μl CCK-8解决办法是补充(CK04;Dojindo实验室、日本)。2 h后,吸光度是评估在450海里。

2.7。Transwell化验

一个24-well transwell室(8μ米孔径,BD生物科学)是利用这个分析迁移能力和侵袭性癌症细胞的检测。涂层与基底膜基质,参议院几乎充满了 细胞。中含有10%的边后卫是添加到众议院。48小时后,入侵细胞,用甲醇结晶紫以及沾0.1%。最后,他们在倒置显微镜下拍摄(DSX510i、奥林巴斯、日本)。

2.8。刮伤愈合试验

在这里Six-well盘子被细胞接种。在细胞的整体覆盖率达到80%,轻轻刮着的单层细胞的200μl吸管。24小时后,伤口区域的细胞转染组和对照组测定。删除这些孤立的细胞通过两次洗涤文化解决方案。至于再生的细胞(24小时),一个新的媒介使用。最后,在0 h和24小时,观察细胞迁移和拍照。

2.9。流式细胞术

转染48 h,细胞被收集和消化。然后,他们与PBS洗两次,resuspended绑定缓冲,然后加上膜联蛋白V-FITC和propidium碘(π)。最后,细胞凋亡的检测是通过流式细胞仪石中剑流式细胞仪(美国,正欲CA)和数据进行了分析。

2.10。Dual-Luciferase化验

pmirGLO荧光素酶记者向量(美国Promega)插入ITGA3野生型(ITGA3-WT)和突变(ITGA3-MUT) 3 - - - - - -UTR构造识别microrna的绑定关系- 144 - 5 - p的3 - - - - - -UTR ITGA3。TC细胞系TPC-1被播种在96孔板(一式三份 细胞/)和100 nM miR-mimics / miR-NC和ITGA3-WT / ITGA3-MUT质粒cotransfected进入细胞。培养48 h, dual-luciferase记者系统(美国Promega)被用于测量荧光素酶的活动。

2.11。统计分析

从3独立进行了实验数据分析GraphPad Prism 6.0(拉霍亚,CA)。结果表示为 。比较两组学生的 - - - - - -测试和对比多个组是单向方差分析用于进行预测。然后,Bonferroni方法用于后续测试。

3所示。结果

3.1。microrna的表达- 144 - 5 - p是在TC细胞明显减少

microrna - 144 - 5 - p是由前面的研究指出TC-related microrna的生物信息学分析(14]。但是,没有实际的支持在TC确定其分子机制。来确定它的角色在TC,我们介绍了下面的实验。总数量82 DEmiRNAs筛选通过微分表达式的分析,包括microrna的p - 144 - 5 -这是我们研究的重点(图1(一))。TCGA TC数据的生物信息学分析表明,TC与低microrna - 144(图5 - p表达式1 (b))。microrna在TC - 144 - 5 - p表达细胞系是明显体现在中存在的结果(图1 (c))。这些发现表明,microrna - 144 - 5 - p明显low-expressed TC。

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图1
microrna - 144 - 5 - p明显降低TC细胞:(a)火山的地图在TC DEmiRNAs数据集用红色代表upregulation;差别,而绿色代表对这些(b) microrna的表达- 144 - 5 - p;(c) microrna - 144 - 5 - p的表达在正常细胞系HTori-3和TC细胞株TPC-1 KTC-1, ftc - 133和8505 c检测到存在; 表示 。
3.2。抑制效果的microrna的p - 144 - 5 - TC细胞系的发展在体外

microrna的p - 144 - 5 - ftc - 133和TPC-1细胞系中表达水平明显不同于正常细胞系;因此,他们选择以下功能实验。成功转染后的microrna - 144 - 5 - p模仿和miR-NC(负控制),microrna - 144 - 5 - p的表达水平评估中存在。的超表达microrna的p - 144 - 5 -在这两个甲状腺癌细胞而刺激转染肿瘤细胞(图2(一个)),表明这些细胞可以用于后续的实验。TC显著抑制了细胞扩散microrna的p - 144 - 5 -超表达(图2 (b))。这两种甲状腺癌细胞的侵袭性和流动性后overexpressing microrna - 144 - 5 - p显著下调(数字2 (c)和2 (d))。流式细胞术结果显示overexpressing microrna的p - 144 - 5 -特别是调节细胞凋亡的TC水平细胞(图2 (e))。集体、增殖、迁移和侵袭性TC细胞可能被过度削弱microrna - 144 - 5 - p,而激活细胞凋亡。

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图2
过表达microrna - 144 - 5 - p TC细胞抑制恶性行为:(a)转染效率的microrna的p - 144 - 5 - TPC-1和ftc - 133细胞系中存在测试;(b)细胞增殖在miR-NC miR-mimic CCK-8组测试;s组(c)细胞入侵测试transwell化验(100 x);(d)细胞移植组测试抓治疗试验(40 x);(e)在团体通过流式细胞仪检测细胞凋亡; 表示 。
3.3。ITGA3负相关,microrna在TC - 144 - 5 - p表达细胞

探索microrna的下游目标- 144 - 5 - p在TC细胞,在mrna微分表达式进行了分析,1749年DEmRNAs包括1270年调节和479年下调DEmRNAs筛选(图3(一个))。microrna的目标基因- 144 - 5 - p利用miRTarBase预测和TargetScan数据库。3 DEmRNAs共享结合位点和microrna的p - 144 - 5 -相交得到的预测目标和调节DEmRNAs(图3 (b))。由皮尔森相关分析显示,microrna - 144 - 5 - p与相关系数最高的ITGA3负相关(图3 (c))。数据从数据库,TCGA表明ITGA3明显在TC组织(图3 (d))。结合临床资料,ITGA3的表达明显不同的患者不同阶段(图3 (e)(图)和N阶段3 (f))的肿瘤。信使rna的表达在TC ITGA3细胞系的价格相比明显高于正常细胞(图3 (g))。同样,免疫印迹试验的结果表明,蛋白质的ITGA3 TC细胞系是高得多的价格相比之下正常细胞系(图3 (h))。基于上述结果,ITGA3 microrna的可能是一个目标- 144 - 5 - p。

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图3
ITGA3非常高TC细胞表达:(a)火山的地图在TC DEmRNAs数据集,用红色代表upregulation;差别,而绿色代表对这些(b)的维恩图预测目标mrna的microrna - 144 - 5 - p和不同调节mrna的;(c)皮尔森相关分析图表的microrna - 144 - 5 - p和目标mrna;(d) ITGA3水平在正常和肿瘤细胞;T (e)箱线图ITGA3表达在不同的阶段;(f)箱线图ITGA3表达在不同的N TC的阶段;(g) ITGA3 mRNA水平在正常细胞系和TC细胞系;(h) ITGA3蛋白质含量在正常细胞系和TC细胞系; 表示 。
3.4。microrna的p - 144 - 5 -抑制ITGA3表达式通过瞄准它

我们信息角度预测,3 UTR ITGA3存在结合位点的microrna - 144 - 5 - p(图4(一))。之后,有针对性的互动是由dual-luciferase试验,在荧光素酶活性降低了引入miR-mimics ITGA3-WT组,表明microrna的- 144 - 5 - p结合位点预测的生物信息学分析是正确的(图4 (b))。据透露过表达microrna的存在- 144 - 5 - p明显下调ITGA3 TC mRNA水平细胞(图4 (c))。ITGA3蛋白表达也显著减少的overexpressing microrna - 144 - 5 - p(图4 (d))。结果表明,microrna - 144 - 5 - p降低了翻译和加速ITGA3的信使rna降解。总之,这些结果表明,microrna - 144 - 5 - p下调ITGA3通过目标3 在TC细胞UTR区域。

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图4
microrna - 144 - 5 - p是上游ITGA3监管机构:(a)绑定ITGA3-WT和ITGA3-MUT microrna - 144 - 5 - p序列;(b)的荧光素酶活性在不同治疗组TC细胞系TPC-1;(c)的mRNA表达ITGA3 TPC-1和ftc - 133细胞过度的microrna - 144 - 5 - p;(d)蛋白表达的ITGA3 TC细胞系TPC-1 ftc - 133; 表示 。
3.5。microrna的TC - 144 - 5 - p抑制针对ITGA3进展

当两个microrna - 144 - 5 - p和ITGA3过表达,ITGA3是惊人地调节miR-NC + oe-ITGA3组当它随后恢复,甚至表达下调(数字5(一个)和5 (b))。CCK-8化验结果显示,过表达ITGA3 TC细胞的增殖能力显著提高。然而,这奖励的效果可以通过同时过度减毒microrna - 144 - 5 - p和ITGA3(图5 (c))。发现,TC细胞的侵袭性以及流动性ITGA3是过表达后明显提升。但他们巨大的下降产生的同步超表达的microrna - 144 - 5 - p和ITGA3,相反,当ITGA3独自过表达(数字5 (d)和5 (e))。ITGA3可以显著抑制细胞的过度凋亡TC,而同时过度的microrna - 144 - 5 - p和ITGA3可以减少这种抑制作用(图5 (f))。因此,microrna - 144 - 5 - p部分获救TPC-1 ITGA3引起的表型的细胞。总的来说,ITGA3表明了这些结果的功能目标microrna - 144 - 5 - p。

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图5
microrna - 144 - 5 - p调节生物功能的TC针对ITGA3: (a, b) ITGA3信使rna和蛋白质的表达在不同的治疗组;(c) TPC-1细胞的增殖;(d)的入侵潜力TPC-1细胞(100 x);(e)迁移的潜在TPC-1细胞在不同治疗组(40 x);(f) TPC-1细胞凋亡水平; 表示 。

4所示。讨论

microrna的表达状态和潜在的角色- 144 - 5 - p进行了分析。例如,锅等。14)指出,低在TC 4 microrna的表达,包括microrna - 144 - 5 - p,可能影响肿瘤发生通过关键路径。,验证了我们的研究,microrna的表达- 144 - 5 - p明显TC组织和细胞中表达下调。microrna的肿瘤抑制作用- 144 - 5 - p在细胞增殖,迁移和入侵TC首次透露了结果,提出一个新颖的研究。根据Rosignolo等的研究,microrna - 144 - 5 - p可以应用分类PTC结合其他microrna [19),显示一个有前途的潜能;然而;在我们的研究中,我们未能验证microrna - 144 - 5 - p表达式TC亚型之间的地位和影响。总之,我们扩大了理解microrna - 144 - 5 - p在某种程度上基于以前的研究。

这项研究表明,ITGA3可能是下游microrna的5 - p - 144的目标。据报道,ITGA3高度表达不同癌症类型(16,17]。此外,高度表达ITGA3证明刺激肿瘤细胞的扩散和转移前研究[20.]。刘等人。18)透露,TPC细胞的生长能够减少microrna - 524 - 5 - p针对FOXE1和ITGA3。然而,在TC ITGA3的详细功能仍然是不完整的。ITGA3的表达通过细胞生物学实验验证在TC调节细胞的过度ITGA3提高增殖,迁移和侵袭性能力,同时削弱TC细胞的细胞凋亡。此外,dual-luciferase试验结果进一步验证了绑定关系ITGA3和microrna - 144 - 5 - p。还发现,microrna - 144 - 5 - p的增殖,迁移,通过瞄准ITGA3入侵能力和促进细胞凋亡。这些结论提供了TC的迁移和入侵的分子机制,有助于为TC开发新的治疗方法。

总之,我们在这个研究证明microrna - 144 - 5 - p细胞抑制TC的发展。这种效应是介导,通过ITGA3至少部分。虽然我们最初探索microrna的角色- 144 - 5 - p / ITGA3 TC的细胞表型,进一步说明其下游通路在甲状腺癌是必不可少的,这是至关重要的发展有效的甲状腺癌的诊断和治疗。

数据可用性

(数据类型)的数据用于支持本研究的结果中包括这篇文章。

的利益冲突

作者宣称他们没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

所有作者导致数据分析、起草和修改这篇文章,给了最后批准的版本发布,并同意负责所有方面的工作。Jizong张和燕钟了同样工作。