转录因子CTCFL促进细胞增殖、迁移和入侵通过激活DPPA2胃癌

文摘

客观的。探索之间的关系CTCFL DPPA2和验证CTCFL / DPPA2的积极作用在胃癌细胞恶性行为。方法。我们预测胃癌症相关的转录因子和相应的目标通过生物信息学mrna。CTCFL和DPPA2水平评估中存在和免疫印迹。在体外实验利用测定细胞的生物学行为。芯片是用于评估目标CTCFL和DPPA2之间的关系。结果。CTCFL和DPPA2均高表达在胃癌细胞,和高CTCFLL DPPA2可以促进细胞恶性行为。芯片验证DPPA2 CTCFL的目标。此外,高DPPA2获救CTCFL沉默的压抑影响细胞增殖,迁移和入侵胃癌。结论。转录因子CTCFL促进细胞增殖,迁移和侵袭性属性通过激活DPPA2胃癌。

1。介绍

胃癌是消化道肿瘤负责全球死亡率(1]。对癌症治疗取得的巨大进步,而这仍然是一个巨大的挑战对胃癌的治疗转移发生疾病后彻底治愈(2]。因此,有必要进行深入研究分子机制潜在的胃癌细胞的迁移和入侵,以及癌症转移的前提,提供潜在的治疗策略。

CCCTC-binding因子(CTCF)作为一个高度保守的蛋白质转录监管产生多样化的功能以及染色质结构,它可以作为转录因子调节染色质的绝缘和骑自行车;简而言之,CTCF是生命的必需品维护(3,4]。CTCF的DNA序列的结合主要是通过11-zinc意识到手指,这是有益的蛋白质相互作用。CTCFL是一个几乎相同的相同的CTCF窝藏11-zinc手指地区(5]。与此同时,这两种蛋白质有类似的结合特异性DNA序列由于不同氨基和羧基末端序列,但蛋白质的功能是不同的5]。在当前公共文献,CTCFL可以调解不同癌症的发病和进展,如肝癌和神经母细胞瘤(6,7),但是没有相关的努力已经在胃癌。

DPPA2专门在多能细胞和一些癌症组织中表达8,9]。它是参与胚胎干细胞的多能性维护和早期胚胎发生和体细胞重编程的关键在诱导多能干细胞(10- - - - - -12]。DPPA2差异表达在不同的癌症和可以作为一个特定的治疗目标在某些肿瘤,如卵巢癌、结肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤(13]。最初的临床研究报道,高蛋白质水平的DPPA2与淋巴转移和进一步胃癌转移(14]。但具体分子机制DPPA2影响胃癌进展是一个高度未满足的需求。

我们描述了微分CTCFL和DPPA2在胃癌组织中表达。同时,我们调查的角色CTCFL / DPPA2细胞增殖,迁移和入侵,也验证了目标CTCFL和DPPA2之间的关系。简而言之,我们的研究提供了一些参考目标治疗胃癌。

2。材料和方法

2.1。生物信息学分析

基因表达TCGA STAD包含在文件(https://portal.gdc.cancer.gov/)数据库访问和处理基因ID转换使用GTF (GRCh38.p5)文件获取数据的mRNA表达谱。这个概要文件包含32正常样本和373胃癌的组织样本。“磨边机”是用于识别差异表达mrna (DE mrna)设定的临界值 和adj。值< 0.01。之后,序列上游500个基点的DE mrna被应用为假定的启动子序列,然后用于提取DE转录因子(TF) JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net/)。助教是首先受到FIMO软件(http://meme-suite.org/tools/fimo)预测目标mrna mrna(然后进行浓缩处理分析 , )。TFs的TFs值< 0.05被确定为候选人。皮尔森相关分析用于分析目标特遣部队和mRNA之间的相关性。

2.2。临床样本

人类胃癌组织( )和相应的邻良性组织( 厘米, )从2015年6月到2019年6月从浙江省人民医院采购批准所有的科目。所有癌症样本病理诊断和瞬间冷冻保存在液氮和孤立后在-80°C。所有科目从未收到任何术前治疗,化疗和放疗。我们的研究已经批准的浙江省人民医院伦理委员会。

2.3。细胞培养

GES-1(没有。:CBP60512),一个人正常胃上皮细胞系,和AGS(没有。:CBP60476),国网公司- 7901(没有。:CBP60500)、HGC-27(不。:CBP60480), bgc - 823(没有。:CBP60477),胃癌细胞系,都购自中国的细胞库类型文化中心集合,中国科学院(CTCC;中国上海)。所有细胞培养在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;热费希尔科学公司,与10%胎牛血清(美国)补充的边后卫;美国Gibco),然后保持在37°C孵化器含有5%股份有限公司₂。

2.4。细胞转染

向量oe-CTCFL, sh-CTCFL、oe-DPPA2 sh-DPPA2及其匹配-控制(oe-NC和sh-NC)被GenePharma合成(上海,中国)。细胞( )转染前首先在孵化12-well盘子。LipoFiter分析工具包(Hanbio、上海、中国)是应用进行转染过程/制造商的协议。在转染后48小时,总RNA和蛋白质隔离了。

2.5。中存在

总RNA从细胞分离试剂盒(美国卡尔斯巴德表达载体),然后用于合成互补的反转录分析工具包(美国卡尔斯巴德表达载体),遵循标准的过程。ABI 7900 ht仪器(美国应用生物系统公司)miScript SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒、德国)实施中存在热循环条件下:在95°C predenaturation 10分钟,40 95°C的周期5 s, 30年代60°C, 72°C 2分钟。结果规范化GAPDH水平2^{- - - - - -ΔΔCt}方法。引物的设计如表1。

2.6。免疫印迹

里帕溶解产物缓冲区包含1%的蛋白酶抑制剂(Beyotime、上海、中国)被用于从细胞总蛋白质的分离,和BCA蛋白试验设备(Beyotime、上海、中国)申请量化。后在高温变性,蛋白质样品(30μg /孔)是由10% sds - page电泳,然后转移到PVDF微孔膜。密封后5%的脱脂牛奶2 h,膜与初级孵化兔多克隆抗体CTCFL (ab126766, 1: 1000;中国)Abcam DPPA2 (ab91318 1: 100;Abcam、中国)和GAPDH (ab137321 1: 10000;Abcam,一夜之间中国)在4°C。第二天,二级抗体辣根过氧化物酶,(合)标记山羊anti-rabbit免疫球蛋白被添加到膜上杂交在室温下为120分钟,洗3次1 x TBST (Solarbio,北京)。反应后,增强化学发光(ECL)试验设备(Solarbio,北京)是用于可视化蛋白质的乐队,然后,图像被抓获。

2.7。CCK-8

96 -孔板推荐细胞孵化(200μl 细胞/毫升)。在0、24、48和72 h,试剂(20μg /)提供的细胞计数kit-8 (Yeasen)为4 h添加细胞孵化有限公司37°C的5%₂。SpectraMax M5(分子设备、医学博士、美国)建议在450纳米测量吸光度值。

2.8。伤口愈合实验

细胞(2毫升, 细胞/毫升)接种到6-well盘子,直到融合达到90%。然后,单层受伤与无菌吸管提示和顺序用PBS和悬浮在标准条件下FBS-free媒介。伤口区域在0和48 h在倒置显微镜下拍摄(40 x)。

2.9。Transwell入侵检测

Transwell插入(σ,中国),预镀与基底膜基质矩阵(美国BD)放入24-well盘子。200年μl细胞( 细胞/毫升)暂停FBS-free媒介被种植到插入、和10% FBS-supplemented媒介被添加进了盘子。在常规条件下孵化后24小时,细胞入侵的盘子被暴露于4%多聚甲醛固定(30分钟),其次是0.1%的结晶紫染色(30分钟)。细胞仍在顶部的膜与湿棉签轻轻地擦洗。五视图的字段被随机选择使用一个倒置显微镜(100 x),然后拍摄细胞计数。

2.10。染色质免疫沉淀反应——(芯片)PCR

EZ-Magna芯片检测工具(微孔)推荐。具体过程如下:1%甲醛溶液用于诱导细胞的交联,和140毫米添加甘氨酸反应终止。细胞细胞溶解后,核蛋白质复合物被剪200 - 500个基点,然后,获得的DNA片段在一夜之间被孵化的抗体免疫沉淀反应在4°C。后冲洗1 x低盐缓冲,1 x高盐缓冲,1 x氯化锂缓冲区,和2 x TE缓冲,样本顺序筛选了15分钟与200年在37°Cμl(洗脱缓冲。此后,样本孵化与5 M氯化钠的逆转在65°C,然后一夜之间交联处理核糖核酸酶和蛋白酶k .识别CTCFL和执行中存在DPPA2启动子区域。

2.11。统计分析

所有数据从三个独立的实验分析了下GraphPad Prism 7.0软件(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA)。提出了测量数据的 。比较两组学生的和在多个组织进行了分析 - - - - - -分别测试和单向方差分析。 是设置一个阈值的统计意义。

3所示。结果

3.1。生物信息学分析结果

完全,1645 DE mrna(图1(一))和62 DE TFs(补充表1)获得。德TFs被用于预测目标使用FIMO mrna的软件,然后在DE mrna进行富集分析。在DE TFs 3 TFs值< 0.05,包括TFAP2B CTCFL, SP8,和mrna会议 和 然后投射到相应的TF监管网络(图1 (f))。CTCFL (BORIS)是一个关键的DNA结合蛋白参与肿瘤的监管,同时也作为一个重要的免疫治疗目标(15,16]。此外,进行皮尔逊相关分析,发现有CTCFL和DPPA2(图之间的正相关关系1 (e))。因此,我们选择CTCFL作为我们的研究对象。生物信息学分析显示,CTCFL和DPPA2都调节肿瘤组织与正常组织的TCGA-STAD数据集(数字1 (b)和1 (c))。此外,生存分析表明CTCFL与患者的预后,而无显著相关性高DPPA2明显涉及病人的预后不利(补充图1,图1 (d))。DPPA2高架在癌细胞和牵连在胃癌细胞转移(14),我们推断,TF CTCFL功能通过针对DPPA2胃癌细胞恶性行为。

3.2。CTCFL和DPPA2调节在胃癌组织和细胞

的水平上更清晰CTCFL DPPA2在胃癌临床组织样本(肿瘤和邻近正常),GES-1和4癌症细胞系被选作进一步验证。存在和免疫印迹公布CTCFL和DPPA2都显著升高癌症病例的信使rna和蛋白质水平相对于相应的控件(数字2(一个)- - - - - -2 (f)),显示出良好的一致性与上面的生物信息学分析的结果。

3.3。沉默CTCFL抑制胃癌细胞恶性行为

生成CTCFL沉默细胞系转染sh-CTCFL和sh-NC(图3(一个))。CCK-8,伤口愈合实验,Transwell入侵检测进行了测试细胞的行为。如数据所示3 (b)- - - - - -3 (d),沉默CTCFL抑制细胞增殖、迁移和侵袭性属性。总的来说,CTCFL强在胃癌细胞恶性行为。

3.4。沉默DPPA2阻碍在胃癌细胞恶性表型

同样,DPPA2沉默进一步调查(图4(一))。CCK-8暗示细胞增殖显著降低在sh-DPPA2转染细胞相对于数控,以及细胞迁移和入侵就是明证伤口愈合和减少Transwell化验(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。综上所述,可以看出DPPA2起到了助长的作用在胃癌细胞恶性表型。

3.5。CTCFL积极调节DPPA2的表达

如上述,CTCFL和DPPA2促进胃癌细胞恶性行为。此外,潜在的结合位点的CTCFL DPPA2使用生物信息学预测分析(图5(一个))。了解之间的关系CTCFL DPPA2, sh-CTCFL, oe-CTCFL,匹配nc转染到癌细胞。通过中存在,CTCFL沉默被发现减少DPPA2水平(图5 (b))。相对地,CTCFL过度增加DPPA2水平(图5 (c))。此外,ChIP-PCR进行进一步验证CTCFL之间的交互和DPPA2启动子(图5 (d))。此外,相关分析表明CTCFL和DPPA2(图之间的正相关关系5 (e))。总的来说,这些发现阐明,DPPA2被CTCFL积极监管。

3.6。CTCFL沉默的压抑的效果在胃癌细胞恶性行为可以逆转DPPA2超表达

我们已经确认CTCFL可以积极调解DPPA2,清晰地阐明胃癌的基本机制,救援进一步进行实验。所有的细胞都被分为3组:sh-NC + oe-NC sh-CTCFL + oe-NC, sh-CTCFL + oe-DPPA2。执行中存在的评估转染效率(图6(一))。然后,CCK-8进行,表明CTCFL沉默抑制细胞生存能力,但这种抑制作用减弱DPPA2时同时过表达(图6 (b))。与此同时,类似的结果可以看到细胞迁移和入侵评估伤口愈合和Transwell化验(数字6 (c)和6 (d))。因此,我们可以得出这样的结论:DPPA2过度抑制CTCFL沉默的负面影响在胃癌细胞恶性表型。

4所示。讨论

转录因子(TFs)蛋白质能与特定DNA序列结合,以确保他们的目标基因可以表达在特定的时间和空间具有一定强度,和他们的功能障碍是关键的病理原因导致恶性肿瘤的发生(17]。例如,TF E2F1唤起TINCR转录活动和促进胃癌进展通过激活TINCR / STAU1 CDKN2B轴(18]。TF TFAP4诱发PI3K / AKT通路激活在肝细胞癌(HCC)加强细胞转移(19]。和TF Nrf2促进膀胱移行细胞癌的发生和发展与TUG1互动(20.]。与不同癌症CTCFL密切相关。在肝细胞癌中,例如,CTCFL上调OCT4由组蛋白甲基化加强癌症干细胞的性质(21]。在乳腺癌,CTCFL介导肿瘤发生和发展的方式激活诱导的孕激素和雌激素受体基因(22]。然而,CTCFL在胃癌中的作用,以及相应的监管机制,是未知的。

我们使用生物信息学分析知道CTCFL和DPPA2都在胃癌差异表达。更应收,CTCFL的水平和DPPA2评估在临床肿瘤组织和匹配相邻良性组织。发现CTCFL和DPPA2癌症病例中高度表达,这表明这两个基因可能与胃癌细胞特征。随后,一些在体外实验表明,overexpressing CTCFL或DPPA2促进细胞增殖,迁移和入侵。据报道,CTCFL或DPPA2展品的相关细胞增殖和转移的肿瘤。例如,DPPA2击倒施加一个老鼠干细胞的增殖抑制作用(10),能够减少转移的癌症干细胞在神经母细胞瘤细胞系7]。针对这些,我们可以看到overexpressing CTCFL或DPPA2奖励的功能细胞行为,但自己或对胃癌之间的监管尚不清楚。

此外,为了进一步验证目标CTCFL和DPPA2之间的关系,CTCFL沉默和超表达细胞系构建。执行中存在的水平,发现DPPA2正与CTCFL水平的改变,表明这两个基因之间有一定关系。因此,我们进行了ChIP-PCR进行进一步的验证。正如所料,CTCFL可以用DPPA2目标绑定。此外,救助实验被用来阐明CTCFL / DPPA2胃癌的机制。结果显示,overexpressing DPPA2可以减弱CTCFL沉默细胞行为的抑制作用。集体,在胃癌,TF CTCFL激活DPPA2促进细胞增殖,迁移和入侵。

总之,这项研究发现,CTCFL和DPPA2胃癌恶性进展的一个重要组成部分,和他们的表达水平可能与预后有关。与此同时,我们的研究证实了有针对性的DPPA2和CTCFL之间的关系,这可能有助于开发新策略对胃癌的预防和治疗。但是结果没有确认在活的有机体内动物实验。进一步的调查将会完成,包括在活的有机体内研究和分子机制CTCFL / DPPA2轴的疾病。

数据可用性

数据和材料在当前的研究中可从相应的作者以合理的要求。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集、分析、发布决定,或准备手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者导致数据分析、起草和修改这篇文章,给了最后批准的版本发布,并同意负责所有方面的工作。

确认

本研究支持的资金从浙江省自然科学基金青年基金(LQ19H160013)和浙江省医疗卫生科技项目(2019323421)。

补充材料

补充1。补充图1:CTCFL水平与患者的预后之间的相关性。

补充2。补充表1:DE TFs确定的62年。

引用

1. j . w . Li Li h .μm .郭和h·邓“mir - 503抑制胃癌细胞增殖和入侵目标HMGA2和灭活WNT信号通路,”癌细胞国际,19卷,不。1,p。164年,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j .你问:赵,x风扇和j .王”SOX5促进细胞入侵和转移通过激活Twist-mediated epithelial-mesenchymal过渡在胃癌,”Oncotargets和治疗》12卷,第2476 - 2465页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. j·e·菲利普斯和v . g . Corces CTCF:韦弗基因组的大师,”细胞,卷137,不。7,1194 - 1211年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. g . n . Filippova c . f .气j·e·乌尔姆et al .,“肿瘤相关锌指CTCF的突变转录因子有选择地改变tts dna结合蛋白特异性,”癌症研究,卷62,不。1、52、2002页。视图:谷歌学术搜索
5. d . i Loukinov e . Pugacheva s Vatolin et al .,”鲍里斯,一本小说男性germ-line-specific蛋白质与表观遗传重编程事件有关,与CTCF共享同一11-zinc-finger域,绝缘子蛋白参与阅读印记是在soma,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷99,不。10日,6806 - 6811年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. l . j . y .他问:y Liu魏et al .,”鲍里斯调节SOCS3表达式通过表观遗传机制在人类肝癌细胞,”四川达雪雪包。易雪禁令卷,49号1、1 - 7,2018页。视图:谷歌学术搜索
7. k·r·Garikapati n . Patel v . k . k .马卡尼p . Cilamkoti Bhadra,和m . p . Bhadra”下调鲍里斯/ CTCFL具备干细胞有效调节癌症和转移MYCN由调制放大神经母细胞瘤细胞系Wnt /β连环蛋白信号通路。”生物化学和生物物理研究通信,卷484,不。1,第99 - 93页,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. k .高桥k .田边m . Ohnuki et al .,“诱导多能干细胞从成人人类成纤维细胞因素,定义”细胞,卷131,不。5,861 - 872年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. t·约翰·o·l·卡巴雷若s . j . Svobodova et al .,“ECSA / DPPA2发起一个embryo-cancer抗原与cancer-testis coexpressed抗原在非小细胞肺癌,”临床癌症研究,14卷,不。11日,第3298 - 3291页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. j . Du t . Chen x邹,熊,和g . Lu”Dppa2 knockdown-induced小鼠胚胎干细胞的分化和压抑的扩散,”生物化学杂志,卷147,不。2、265 - 271年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. c . h . k .朱j . Li Lai, c .郭和c·王,“重组成纤维细胞多能性使用arginine-terminated polyamidoamine基于纳米颗粒的病毒性基因传递系统,”国际期刊的纳米9卷,第5847 - 5837页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. d . Ruau r . Ensenat-Waser t c全垒打et al .,“多能性相关基因来重新激活chromatin-modifying代理neurosphere细胞,”干细胞,26卷,不。4、920 - 926年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. n . e . Tchabo p . Mhawech-Fauceglia o . l . Caballero et al .,“表达和血清的免疫反应性发育限制在卵巢癌上皮分化抗原,”癌症免疫,9卷,不。6、2009。视图:谷歌学术搜索
14. h . Shabestarian m . Ghodsi a . j . Mallak a . h . Jafarian m . Montazer和m . m . Forghanifard”DPPA2蛋白表达与胃癌转移有关,”亚洲太平洋癌症预防杂志》上,16卷,不。18日,第8465 - 8461页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. Soltanian和h . Dehghani,”鲍里斯:具备干细胞癌症的主要监管机构,”癌细胞国际,18卷,不。1,p。154年,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. d . Loukinov”,针对CTCFL /鲍里斯癌症的免疫治疗,”癌症免疫学、免疫疗法,卷67,不。12日,第1965 - 1955页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. m·伯恩哈特m . Galach d·诺瓦克,j . Utikal“诱导多能性的介质及其作用癌细胞——当前科学知识和未来的视角,“生物技术杂志,7卷,不。6,810 - 821年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. w·l·t·徐y . f . Wang Xiong et al .,“E2F1诱发TINCR通过激活转录活性和加速胃癌进展的TINCR /STAU1 / CDKN2B信号轴”,细胞死亡和疾病,8卷,不。6篇文章e2837 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. t·黄问:f . Chen b . y . Chang et al .,“TFAP4促进肝细胞癌侵袭转移通过激活PI3K / AKT信号通路”疾病标记ID 7129214条,卷。2019年,13页,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. z太阳,黄g和h . Cheng”转录因子Nrf2诱发lncRNA的老年病TUG1促进发展和阿霉素耐药性在膀胱移行细胞癌,”癌症管理和研究11卷,第6090 - 6079页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. 刘问:刘,k . Chen z . et al .,”鲍里斯让OCT4通过组蛋白甲基化,促进癌症干细胞——就像在人类肝癌细胞属性,“癌症的信卷,403年,第174 - 165页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. 诉达奇:毛孔,f . Docquier et al .,”鲍里斯,转录因子的paralogue CTCF,乳腺肿瘤中异常表达,“英国癌症杂志》,卷98,不。3、571 - 579年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2021叫海波姚明等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。