文摘
甲状腺癌(THCA)是一种常见的内分泌恶性肿瘤,发病率及其全球THCA显著增加。Neurexin 2 (NRXN2)参与一些疾病的进展。然而,它仍然是难以捉摸的朝着THCA NRXN2的临床意义和功能。癌症基因组图谱(TCGA)数据显示,我们进行了一项研究,探索NRXN2表达与临床特征之间的联系。此外,我们的数据展示,与正常甲状腺组织相比,NRXN2显示低表达THCA组织。20与NRXN2相关重要基因筛选和鉴定。KEGG分析数据显示,NRXN2展出一个链接到神经系统,胰岛素分泌调节,能量代谢整合,肌肉收缩,心脏传导,神经黏附分子1 (NCAM1)交互。深入我们的结果确认NRXN2降低THCA组织和细胞系的病人。功能,我们证明overexpressing NRXN2导致THCA细胞增殖的抑制作用,迁移和入侵在体外。总的来说,我们的研究表明,第一次NRXN2表现作为抑制剂在THCA肿瘤和一个有前途的生物标志物。
1。介绍
在过去的30年中,全球的甲状腺癌发病率(THCA)已明显增加,主要是由于乳头状甲状腺癌(PTC)的增加1,2]。THCA是一种常见的内分泌恶性肿瘤,但其预后是令人满意的3]。因此,THCA的发病率迅速增加,但杀伤力比持平(4]。对低风险THCA,减少程度的治疗包括手术的程度,包括全甲状腺切除术、肺叶切除,或手术没有主动监控,同时,放射性碘的迹象(RAI)涉及使用5]。剂量和刺激方法,抑制甲状腺素治疗的适应症,后续的范围和方法应该适应复发的风险。分子标记测试可能帮助指导定制治疗甲状腺结节患者和THCA [6]。术前危险分层使用分子标记也可以应用到更好的检测THCA患者最有利的甲状腺切除术的范围(6]。
的突触前神经毒素属于一个家庭单向跨膜蛋白,显示突触在哺乳动物的组织者。神经毒素包括三个基因NRXN1、NRXN2 NRXN3。每个三个基因生成两种形式:一个更长α—构成和更短的β—构成。报告NRXN基因的改变在各种神经精神疾病,包含自闭症谱系障碍(ASD),精神分裂症、智力残疾(ID),和上瘾7]。NRXN2已经开始探索肿瘤。一项研究报道,NRXN2消极监管核转录因子的活性红色的两个相关因子2 (NRF2)和参与多种疾病的出现和发展,如癌,新陈代谢,和神经退行性疾病(8]。一项研究指出NRXN2总体存活率的一个可靠的预测成神经管细胞瘤(9),这有利于理解成神经管细胞瘤的发病机理和治疗。另一项研究表明,基因的删除NRXN2被描述参与突触发生,树突分支,多发性内分泌瘤1型(10]。我们的研究结果暗示NRXN2戏剧本质上在某些癌。直到现在,没有已知的在THCA NRXN2的临床意义和功能。
这里,TCGA基于数据库,NRXN2表达式THCA和nontumor组织之间的差异被发现。我们通过KEGG分析,探讨了可能的THCA NRXN2在肿瘤发生的作用。协会现有NRXN2表达和临床病理的特性或整体TCGA生存分析使用的数据集。通过GSEA分析,我们确定了NRXN2之间的关系和特定的免疫细胞的抗癌功能。存在被测量NRXN2 mRNA表达THCA组织和细胞系。然后,我们进行了CCK-8化验和NRXN2 Transwell分析探讨影响THCA细胞增殖,细胞迁移和入侵。这些结果表明,NRXN2运作作为一个肿瘤抑制基因,可作为THCA治疗的新目标。
2。材料和方法
2.1。NRXN2基因表达分析
原始RNA序列数据集和TCGA-THCA列的临床特征可以从癌症基因组图谱(TCGA)下载网站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)。TCGA数据利用分析THCA NRXN2的mRNA水平。
2.2。基因集富集分析
的分子签名数据库(MSigDB,https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)是一家集带注释的基因集用于基因集富集分析(GSEA)软件。MSigDB包含注释的基因集涉及生化途径、信号级联,表达谱的研究出版物,和其他生物的概念。GSEA是一种计算方法,用于评估定义的一组先天的基因是否显示统计学意义和一致的两个生物状态之间的差异。我们使用免疫特征基因集从MSigDB数据库分析之间的相关性NRXN2和肿瘤浸润免疫细胞的表达水平。
2.3。的发展路径分析
数据库的注释、可视化和综合发现v6.8(大卫,https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)来进行KEGG通路富集分析。值得注意的是,上面的结果 被确定。在图演示了浓缩途径和过程1,那里的 - - - - - -轴和 - - - - - -轴代表数据库中的记录相对丰度和所有功能类别的浓缩比例。
(一)基因集富集分析(GSEA)浓缩NRXN2表达和巨噬细胞M0地图。的 - - - - - -轴代表基因集;的 - - - - - -轴描述运行浓缩分数和排名指标
(b)的数据,TCGA:分析和比较NRXN2原发肿瘤组织和正常固体组织之间的表达式
2.4。临床样本
35 THCA组织和配对相邻正常组织获得手术病人在台州温州医科大学附属第一人民医院。所有患者之前没有收到任何化学或物理处理操作。所有组织被定义为THCA病理检查后,紧接着放入液氮长期使用。我们的研究得到了研究伦理委员会的批准,台州温州医科大学附属第一人民医院。所有患者一致签署知情同意表格。
2.5。细胞培养和转染
人类THCA细胞系(cal - 62, BCPAP TPC-1, 8505 c)和人类正常的甲状腺上皮细胞系(Nthy-ori 3 - 1)从写明ATCC获得(美国罗克维尔市)。卡尔- 62在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM)与10%胎牛血清的边后卫,青霉素(50单位/毫升;Gibco)和链霉素(50μg / mL;Gibco)如前所述。BCPAP细胞,TPC-1细胞,和人类正常细胞系Nthy-ori 3 - 1被培养在罗斯威尔公园纪念研究所1640 (RPMI 1640)含有10%的边后卫(Gibco,罗克维尔市,医学博士,美国),100年μ青霉素g / mL, 0.1毫克/毫升链霉素。8505 c在最低基本培养基培养细胞(MEM)和10%的边后卫,青霉素(50单位/毫升;Gibco)和链霉素(50μg / mL;Gibco)。细胞系都生长在37°C公司5%2的气氛。的完整序列NRXN2从THCA基因组被放大,然后结扎慢病毒构建pcDNA3.1 (GenePharma、上海、中国)。最后的阳性克隆OVER-NRXN2被测序验证。Lipofectamine 2000(美国表达载体)被用来使转染质粒进入细胞表示为手动指示。
2.6。总RNA提取和定量实时PCR
从组织和细胞总RNA提取使用RNAiso +(豆类生物技术有限公司,大连,中国)。整个RNA分离指的指令。收获的RNA进行中存在分析。短暂,RNA的互补脱氧核糖核酸是相对地转录利用逆转录酶工具包的协议描述(Vazyme,中国)。量化的NRXN2 mRNA运行利用SYBR绿色主设备(Vazyme,中国)7900年ABI ht序列检测机(美国CA Bio-Rad)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)是一个内部参考和利用规范化NRXN2 mRNA的表达。NRXN2底漆和GAPDH是合成和从GenePharma购买。引物序列如下:NRXN2, 5 - - - - - -CAGCACGAGGATGGATCGC-3和反向5 - - - - - -GCCCACGTTAAAGATCACCCC-3 。GAPDH向前5 - - - - - -GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3和反向5 - - - - - -GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3 。
2.7。扩散分析
CCK-8工具包是进行细胞增殖(Beyotime、上海、中国)。 每口井的细胞接种于96孔板一式三份。在每个细胞孵化了10μ2 h L CCK-8解决方案在37°C。450纳米的OD值被吸光度测量读者mb - 580(希尔、深圳、中国)。
2.8。Transwell化验
Transwell试验进行了利用Transwell室(8μ孔隙大小,康宁公司、美国纽约)和基底膜基质(美国BD生物科学)来评估THCA细胞的转移能力在体外。 细胞在每一个被播种到参议院DMEM培养基中1%的边后卫。600年μL DMEM培养基添加了10%的边后卫是众议院。在24 h postincubation,剩下的细胞在参议院被使用湿棉花棒。和细胞室是固定的,与DAPI染色。然后,细胞的数量是由荧光倒置显微镜监控(Mshot,广州,中国)。
2.9。统计分析
被显示为代表的所有数据 三个独立的实验。SPSS 17.0(美国芝加哥,IL)是用来分析数据的差异。 表示一个统计上的显著差异。
3所示。结果
3.1。评估NRXN2表达和临床病理特征之间的联系
首先,我们探讨了THCA NRXN2表达和临床病理特征之间的关系。图2表明NRXN2表达式显示负相关和淋巴结的转移状况THCA(图2(一个)),但表现出积极的与患者的年龄(图2 (b))。N1的THCA NRXN2的表达水平较低(图2(一个))。NRXN2表达式中没有明显区别男性患者和女性患者THCA(图2 (c))。NRXN2表达式在每个年级THCA样本低于正常样本(图2 (d))。总之,NRXN2 THCA患者可能的生物标志物。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。NRXN2 THCA免疫细胞与肿瘤浸润有关
我们验证了在THCA NRXN2表达和免疫细胞之间的关系。数据显示,NRXN2与巨噬细胞相关的表达式非常M0(图1(一)),它的表达可能与抗肿瘤特异性免疫细胞功能减弱,尤其是通过调节巨噬细胞参与反应的免疫细胞在肿瘤的微环境。鉴于NRXN2的平均水平,THCA患者分为高表达和低表达的NRXN2两组。
3.3。在THCA NRXN2的高表达
TCGA数据库被送往检测NRXN2 THCA组织中的表达水平。我们的数据表明,NRXN2原发肿瘤组织中的表达显著降低相对于正常组织(图1 (b))。总的来说,结果表明,NRXN2 THCA组织中表达较低而在正常组织。
3.4。在THCA NRXN2-Related信号通路
为了进一步研究的可能作用NRXN2 THCA,肿瘤发生的重要选择与NRXN2相关的基因通路富集分析。图3(一个)描绘了一个概要的浓缩效果。大大丰富了条款阶段2-plateau阶段,NCAM信号对神经突增长,Ca2 +独立WNT信号通路,NCAM1交互,β-连环蛋白、能量代谢的整合,胰岛素分泌,调节心脏传导,肌肉收缩,神经系统。
(一)KEGG THCA NRXN2基因的分析。的 - - - - - -轴显示基因比例;的 - - - - - -轴说明了丰富通路;点的大小显示基因计数;颜色代表了价值
(b)的数据,TCGA:确定20 NRXN2相关的基因,预测NRXN2-related基因的信号通路。灰色的点代表丰富的途径;颜色的点代表基因;点的大小代表了数;颜色说明了褶皱变化;边缘展品与此浓缩通路相关的基因
此外,TCGA我们使用数据的数据库来识别基因与NRXN2和预测NRXN2-associated基因的信号通路。结果表明,共有20个重要基因与NRXN2,包括APBA2 GNA14, ABCC8, PRKCA, PRKACB, LRFN1, KCNJ8, ALDH2 KCNAB1, ITPR1, CACNB2, CACNB4, LMOD1, KCNE4,国家猪肉厂商,KCNIP3 RYR2, COL6A6。所有这些基因是与神经系统有关,胰岛素分泌调制,能量代谢整合,肌肉收缩,心脏传导,NCAM1交互(图3 (b))。
3.5。NRXN2 THCA表达下调
图4(一)礼物,与相邻正常组织相比,NRXN2 mRNA的表达在很大程度上减少35配对组织THCA患者( )。此外,图4 (b)演示了一个卡尔- 62年NRXN2 mRNA的表达减少,BCPAP, TPC-1,和8505 c THCA细胞株,而在人类正常甲状腺上皮细胞系(Nthy-ori 3 - 1) ( )。我们的研究结果暗示NRXN2可能涉及THCA起始和发展。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.6。NRXN2 THCA抑制细胞增殖
CCK-8试验是利用评估的影响NRXN2扩散的NRXN2-overexpressed THCA细胞。我们设计了OVER-NRXN2表达式磁带overexpressing NRXN2。我们的数据暴露,OVER-NRXN2超表达效率高。NRXN2显然是过表达通过转染OVER-NRXN2在卡尔- 62和TPC-1细胞( ,数据4 (c)和4 (d))。Overexpressing NRXN2大大推迟THCA细胞增殖( ,数据4 (e)和4 (f))。
3.7。NRXN2减少细胞转移THCA细胞
我们执行Transwell试验来验证如果NRXN2可以调节THCA细胞迁移和入侵在体外。卡尔- 62年后overexpressing NRXN2和TPC1细胞,我们进行了细胞迁移和入侵检测。结果表明,粘附细胞的数量在下议院膜表面明显比对照组降低(数字5(一个)- - - - - -5 (h))。这些结果表明,NRXN2会抑制THCA细胞转移。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
4所示。讨论
NRXN1、NRXN2 NRXN3 NRXNs三个重要基因,这是一群突触前unipath跨膜蛋白和功能突触的组织者在哺乳动物。NRXN2基因的突变是显示在自闭症,精神分裂症、ID和其他几个神经精神障碍(7]。考虑上面提到的报告,他们为表明NRXN2铺平了道路产生了直接或间接影响人类疾病。不过,它还难以捉摸的角色发展的NRXN2癌。
TCGA的数据组织的数据库显示,NRXN2表达式THCA低于nontumor组织。同样,NRXN2表达式在临床样本THCA大大降低相对于正常组织。许多报道指出NRXN2是多种疾病的一个关键因素(11]。据报道,NRXN2调节NLRP3在广告影响阿尔茨海默氏症的大脑区域12]。另一个研究报告说,NRXN2调节GAP43和桶在早期皮质突触发生与NRXN1多样化和NRXN3 [13]。此外,NRXN2也决定加入sex-differential DNA甲基化和相关网络(14]。
为了研究的分子功能和潜在机制NRXN2 THCA肿瘤发生的,我们进行通路富集分析和确定10个重要的浓缩通路。然后,我们进一步确定20 NRXN2-related基因。NRXN2-associated基因的信号通路参与神经系统,主要是胰岛素分泌,调节能量代谢的整合,肌肉收缩,心脏传导,NCAM1交互。神经系统被视为受癌症影响的组织和渠道的传播癌症疼痛和神经周的入侵15]。据报道,NRXN2是三个人类神经毒素基因(7]。胰岛素分泌在低血浆葡萄糖水平不当会导致严重和持续低血糖新生儿和儿童,导致血糖低血糖(HH) [16]。据报道,肿瘤细胞的能量代谢的核心特性,和癌症细胞必须产生足够的ATP来满足能源需求的过分活跃的信使核糖核酸的翻译(17]。运动训练是一个潜在的干预策略,预防和治疗癌性恶病质(18]。乳腺癌患者抗癌治疗前后呈现明显的肌肉力量障碍(19]。NRXN2可能参与肿瘤发生和发展的癌症通过这些途径,但很少有报道NRXN2癌症的分子功能和潜在机制(20.]。此外,我们发现NRXN2削弱有关抗肿瘤特异性免疫细胞的功能。本研究为NRXN2的研究提供了一个新的方向。
在先前的报道中,我们发现有一些研究NRXN2在肿瘤中的作用。此外,我们还没有发现任何文章讨论THCA NRXN2的效果。神经细胞相关蛋白,NRXN2与许多脑部疾病(21]。在这项研究中,我们探索NRXN2有关甲状腺肿瘤的形成,并通过一系列的实验证实了我们的假设。我们进行了相应的实验确定NRXN2 THCA体外的功能。我们相信NRXN2抑制肿瘤恶化THCA施加扩散和转移的抑制作用。这项研究有一些局限性。在未来的研究中,我们将进一步调查的临床意义和预后价值NRXN2 THCA和做免疫印迹实验和动物模型实验的基础上,本研究进一步证实了这项研究的结果。
的差别在结论中,我们证明了对这些NRXN2 NRXN2 THCA和识别关键基因相关。通过KEGG,我们分析NRXN2在甲状腺癌形成的分子功能。我们的数据表明,低表示NRXN2 THCA了与临床病理参数和总生存期。NRXN2表达密切相关的抗肿瘤功能特定的免疫细胞,巨噬细胞M0尤其如此。我们所有的研究结果表明,NRXN2抑制THCA细胞增殖,迁移和入侵在体外。NRXN2函数作为一个肿瘤抑制基因,可作为小说THCA治疗的目标。这可能是一个有前途的THCA预后和治疗的目标。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
概念和设计的研究是由崔张马和呦呦。采集的数据是由崔。崔的数据进行分析和解释。统计分析是由崔张马和呦呦。起草这份手稿是由崔。修订手稿的重要知识内容是由崔Ma和呦呦。