ACE2通过SIRT1/eNOS途径促进肺表面活性物质的合成以改善AT II细胞损伤

摘要

客观的．本研究旨在探讨新生儿呼吸窘迫综合征(ARDS)中PS、细胞活力、炎症因子和凋亡水平。此外，我们还探索了ACE2、SIRT1/eNOS通路与缺氧诱导的AT II细胞损伤之间的潜在关系。方法．huc - msc来源的AT II细胞经IF和ICC验证，而qRT-PCR用于PS和AT II细胞标记物(CK-8和KGF)。通过缺氧暴露建立AT II细胞损伤模型。western blot检测pcDNA3.1-ACE2转染后ACE2的增强表达。MTT、western blot、ELISA和流式细胞术检测缺氧和ACE2对AT II细胞的影响。通过添加SIRT1抑制剂EX527，证实了SIRT1/eNOS通路参与了AT II细胞对NRDS的保护功能。结果．在hUC-MSCs成功分化AT II细胞和建立AT II细胞损伤模型的基础上，过表达的ACE2阻碍了缺氧诱导的AT II细胞损伤。过表达ACE2可恢复细胞活力，抑制缺氧引起的炎症因子的分泌和AT II细胞的凋亡。ACE2激活SIRT1/eNOS通路，发挥其细胞保护和抗炎作用。结论．我们的发现提供了ACE2通过激活SIRT1/eNOS途径防止AT II细胞炎性损伤的信息，这表明ACE2可能成为一种新的保护剂，应用于NRDS的保护和治疗。

1.介绍

新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)是一种出生时或出生后不久发生的呼吸系统疾病，是由于肺表面活性物质(PS)缺乏和破坏所致[1]。NRDS对新生儿的生命和健康构成严重威胁，如不进行治疗，死亡率可达30% [2，3.]。在NRDS新生儿中，受损和重塑的肺上皮细胞导致高死亡率和预后差[4，5]。临床上，外源性PS替代疗法[6]结合辅助呼吸支持技术[7]是治疗非全身性疾病最有效的方法[8，9]。然而，该方法在NDRS中的广泛应用取决于PS的质量和可承受的成本[9]。此外，NRDS患儿可能伴有细菌感染，导致PS替代无效，甚至急性肺损伤。因此，制定新的有效的NRDS治疗策略具有重要意义。

肺泡II型(Alveolar type II, AT II)细胞被认为是肺泡的保护者，约占肺泡上皮细胞总数的60%，并产生PS，发挥抗菌、抗炎作用，维持肺泡微环境[10，11]。在受损的肺泡微环境中，AT II细胞扩散、去分化并产生PS以恢复肺泡上皮的特性[10]。主要由AT II细胞合成四种SPs，如SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。其中SP-A、SP-D亲水，抑制炎症反应;SP-B、SP-C疏水，维持PS膜的稳定性[10，12，13]。角质形成细胞生长因子(Keratinocyte growth factor, KGF)是维持AT II细胞表型的生长因子，可调节细胞增殖和表面活性蛋白基因表达在活的有机体内［14，15]。细胞角蛋白8 (CK-8)， AT II细胞表型标记之一[16，调控细胞粘附、蛋白质合成和应激信号转导。

在肺AT II细胞中发现高血管紧张素转换酶2 (ACE2)表达[17]。Ang-II可以通过激活NF直接增加HMGB1的表达κB早期引起靶器官内皮功能障碍[18]，特别是肺损伤引起的急性呼吸窘迫综合征[19]。ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴对ACE/Ang- ii /Ras受体轴介导的肺损伤起抗炎作用[20.]。例如，ACE2将Ang- ii裂解为Ang-(1-7)，并抵消急性肺损伤中的炎症、氧化和凋亡作用。此外，Ang-(1-7)已被证实能刺激内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的激活和一氧化氮(NO)的生成[21]。

Sirtuin 1 (SIRT1)是Sirtuin蛋白家族的一种蛋白编码基因，在许多生物过程中发挥作用，包括炎症、代谢、细胞增殖和凋亡。SIRT1被证明是一种eNOS去乙酰化因子，通过与eNOS结合释放NO，而NO反过来诱导SIRT1的表达[22]。来自eNOS的NO具有维持血管稳态的生物学特性，包括血管舒张、氧化应激和炎症抑制。因此，我们推测SIRT1/eNOS通路可能参与了NRDS的治疗，但其机制尚不清楚。

本研究对PS、细胞活力、炎症因子和凋亡水平进行了分析在体外．此外，我们还探索了ACE2、SIRT1/eNOS通路与缺氧诱导的AT II细胞损伤之间的潜在关系。

2.材料和方法

2．1．细胞培养与分化

人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)购自山东省脐血造血干细胞库，经当地伦理委员会批准保存。hUC-MSCs在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素(Gibco，美国)的DMEM/F12 (Thermo，美国)中培养，37℃，5% CO₂;当细胞达到80-90%汇合时传代。2-3代后，将hUC-MSCs离心，胰酶化后接种于6孔板中，加入20%胎牛血清的DMEM/F12再孵育10天，获得分化的AT II细胞，每2-3天更换一次培养液。最后，用添加1%胎牛血清和SupplementMix (PromoCell, Germany, Germany，含牛垂体提取物、表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、肾上腺素、三碘- l -甲状腺原氨酸、视黄酸、KGF和转铁蛋白)的小气道上皮细胞生长培养基(SAGM, PromoCell, Germany)在80-90%汇合时替代培养基。完全分化的细胞(在SAGM中维持21天;培养基每2-3天更换一次)。

2．2．实时定量PCR (qRT-PCR)

采用qRT-PCR法分别检测各组第3、7、14、21天CK-8、KGF、SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA水平。根据制造商的说明，在3、7、14和21天使用TRIzol试剂(Qiagen，美国)从分化的AT II细胞中提取总RNA。然后用逆转录试剂盒(TaKaRa, Japan)合成cDNA，按照说明书用一步逆转录- pcr试剂盒(Qiagen, CA, USA)进行逆转录- pcr。引物序列如下:ck - 8,5 -Gag gca tca CCG cag tta c-3和5 -TTG CTT CGA GCC GTC TTC -3 ;KGF 5 -Gaa caa gga agg aaa act cta TGC aa-3和5 -Aag TGG GCT GTT TTT TGT TCT TTC t-3 ;SP-A 5 -Cag gta GTG TTC Cag Cag GGT g-3和5 -Atc tga agg CGG CTC标签GTC a-3 ;SP-B 5 -Cca agc cat gat TCC caa GGG tg-3和5 -CGA gca gga tga CGG agt agc g-3 ;SP-C 5 -CTC atc GTC GTG GTG att GTG-3和5 -TGG aga agg cag TGG t-3 ;SP-D 5 -Agg agc aaa GGG aga agag tgg-3和5 -GCT GTG CCT CCG taa atg gt-3 ;ACE2, 5 -Cca CTG CTC aac tac TTT gag cc-3和5 -CTT atc CTC act TTG atg CTT TTG -3 ;GAPDH 5 -TCC TCC acc TTT gac gct-3和5 -TCT TCC TCT TGT GCT CTT gc-3 ．计算上述基因的mRNA水平，并将其归一化为GAPDH^-ΔΔCt方法。

2．3.免疫荧光分析(如果有)

hUC-MSCs被播种到有盖的6孔培养皿中。按照分化方法，在第21天从SAGM中获得完全分化的细胞;SP-C、CK-8、SP-A对覆膜进行免疫抗原反应。用500洗涤细胞μl PBS 3次，4%多聚甲醛固定15分钟，0.2% Triton X-100渗透5分钟，5% BSA封闭30分钟，37℃。在IF中，将样品与兔抗人SFTPC (SP-C)和CK-8单克隆抗体(1:20 00,Thermo, USA)在4°C下孵育过夜。37℃复温30分钟后，用PBS洗涤细胞，用山羊抗兔IgG (1: 200, Thermo, USA)在37℃黑暗中处理1小时。最后，用DAPI (1:50, Thermo, USA)在37℃下染色30分钟。最后，将上述盖片装入裱片介质中，用倒置荧光显微镜(Olympus CKX41, Japan)拍摄图像。

２.４.免疫细胞化学(ICC)测定

二氨基联苯胺(DAB)组织化学试剂盒(Thermo, USA)应用于ICC;细胞与兔抗人SP-A抗体(1:500,Thermo，美国)在4°C黑暗的封闭环境中孵育。依次加入生物素标记的山羊抗兔IgG抗体和链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP-)标记的抗体，室温孵育20 min。PBS洗涤后，加入DAB工作液。棕色细胞被认为是阳性信号，在强光显微镜下观察(Olympus CKX41，日本)。

2．5．细胞瞬时转染和处理

用人血管紧张素转换酶2基因过表达质粒(pcDNA3.1-hACE2, Addgene, USA)及其阴性对照(pcDNA3.1-NC)转染AT II细胞。转染使用Lipofectamine®2000试剂盒(Thermo，美国)，当细胞达到80%汇合。通过qRT-PCR验证转染效率。随后加入EX527作为抑制剂，证实了SIRT1/eNOS通路的关键作用。达到对数期后，将细胞分为对照(空气-21%氧)、缺氧(3%氧)、缺氧+pcDNA3.1-NC、缺氧+pcDNA3.1-ACE2、缺氧+pcDNA3.1-ACE2+DMSO、缺氧+pcDNA3.1-ACE2+EX527组。

2．6．MTT试验

MTT法检测细胞活力(Abcam, UK)。的 huc - msc来源的AT II细胞接种于6孔板，培养1、3、7天。在不同处理后的细胞中加入MTT溶液，在37℃下再孵育4 h。然后离心溶解，在460 nm处检测每孔的吸光度。

2.7。西方墨点法

huc - msc来源的AT II细胞培养3天，用RIPA裂解缓冲液(Thermo，美国)裂解。用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo, USA)测定蛋白浓度。将等量蛋白的细胞裂解液经8-12% SDS-PAGE电泳，转NC膜。NC膜被阻断，用一抗孵育。美国主要的抗体都是购买(热)和上市如下:兔子反CK-8(1: 500年,55 kDa), KGF(1: 1000年,40 kDa), SP-A(1: 1000年,25个kDa), SP-B(1: 1000年,45 kDa), SP-C(1: 1000年,19 kDa), SP-D(1: 1000年,43 kDa)、ACE2(1: 1000、105 kDa), HMGB1(1: 2000年,28 kDa) p-NFκ48 kDa) B(1: 1000年,il - 6 (1: 1000 kDa 22日),MCP-1(1: 200年,11 kDa), TGFβ25 kDa) 1(1: 250年,SIRT1(1: 1000、110 kDa) t-eNOS(1: 1000、150 kDa) active-eNOS(1: 1000、130 kDa),β肌动蛋白(1:5000、42 kDa)和GAPDH(1: 2000年,37个kDa)。β-Actin和GAPDH作为内参。然后加入相应的二抗山羊抗兔IgG(1:5000)孵育。最后，用酶联化学发光试剂(Abcam，美国)观察免疫印迹。

2.8。酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA检测血清Ang- ii和Ang-(1-7)水平。根据说明书使用Ang- ii和Ang-(1-7) ELISA试剂盒(Biomatik, Canada)。简而言之，在4℃超声裂解细胞，收集上清液。然后将上述上清液和标准品分别加入检测板中。孵育2小时后，依次加入检测抗体、hrp -链霉亲和素(HRP-streptavidin)和3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液，使用Microplate Reader (Multiskan Sky, Thermo, USA)在450 nm处进行最终测定。根据所绘制的标准曲线得到了Ang- ii和Ang-(1-7)的浓度。

2.9。流式细胞术

annexin V-FITC/PI染色检测huc - msc来源的AT II细胞的凋亡率。细胞( /孔)置于6孔板中孵育3 d。然后用胰蛋白酶消化细胞，离心收获细胞，黑暗下用annexin V-FITC和PI染色。最后，每孔加入1×结合缓冲液，用CytoFLEX FCM (Beckman, USA)分析细胞凋亡率。

2.10。统计分析

实验至少重复了三次。使用ImageJ图像处理技术定量western blot条带和细胞计数。统计图由GraphPad Prism 8绘制。本研究中获得的重复数据采用双向方差分析进行检验，两组间的差异采用方差分析 -测试。值< 0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。hUC-MSCs体外向AT II细胞的分化

为了获得足够的AT II细胞用于后续研究，在条件SAGM下诱导hUC-MSCs，在体外．为确保hUC-MSCs充分分化，分别在第3,7,14和21天采用qRT-PCR检测AT II细胞标志物(CK-8, KGF)和肺表面活性剂(SP-A, SP-B, SP-C, SP-D)的mRNA水平。qRT-PCR结果(图1(一))显示，随着分化时间的延长，各指标及肺表面活性物质水平均升高，14 d后达到平稳水平。此外，hUC-MSCs向AT II细胞培养诱导14天后，观察到不规则平面多边形形态(图)1 (b))．SP-C和CK-8作为特异性AT II标记物，采用IF检测。表达的SP-C(红色)、CK-8(绿色)和细胞核(蓝色)如图所示1 (c);我们在培养诱导14天后观察到SP-C和CK-8的高表达，提示hUC-MSCs直接分化具有与AT II细胞相同的细胞功能特征。采用ICC检测SP-A阳性率。如图所示1 (d)， sp - a阳性细胞百分比(棕色细胞百分比)高达90%。所有结果表明hUC-MSCs成功分化为AT II细胞。

3．2．ACE2缓解缺氧诱导的AT II细胞炎症和凋亡

通过缺氧诱导建立AT II细胞损伤模型。为探讨ACE2对AT II细胞的作用，将过表达ACE2的载体转染AT II细胞，在缺氧条件下培养。分别采用qRT-PCR和western blot检测ACE2在mRNA水平上的表达(图)2(一个))和蛋白质水平(图2 (b)),结果显示大幅减少缺氧和缺氧+ pcDNA3.1-NC组和高表达在缺氧+ pcDNA3.1-ACE2恢复组相对于对照组,这表明ACE2的表达下调和缺氧的获救pcDNA3.1-ACE2转染。western blot检测PS和细胞标志物水平，与对照组相比，缺氧组和缺氧+pcDNA3.1-NC组PS和细胞标志物水平明显下调，缺氧+pcDNA3.1-ACE2组PS和细胞标志物水平回升(图)2 (c))．为了证实ACE2对细胞损伤的作用，在第1、3、7天采用MTT法检测完全分化的AT II细胞活力。如图所示2 (d)，过表达ACE2后，缺氧组严重的细胞损伤减轻。同时，western blot检测炎性细胞因子如图所示2 (e);炎症因子(HMGB1, p-NF)的表达κB, IL-6, MCP-1, TGFβ1)缺氧组和缺氧+pcDNA3.1-NC组均显著上调，而缺氧+pcDNA3.1-ACE2组较对照组回落。用ELISA法测定Ang- ii和Ang-(1-7)的水平(图)2 (f)）;缺氧+pcDNA3.1-ACE2组相对于缺氧组Ang- ii水平降低，Ang-(1-7)水平升高，表明过表达ACE2可能使Ang- ii转化为Ang-(1-7)。最后，细胞凋亡(图2 (g))的细胞凋亡率与炎性细胞因子有相同的趋势。以上结果表明，缺氧可诱发AT II细胞的炎症和凋亡，而过表达ACE2可消除这些损伤。

3．3.ACE2通过SIRT1/eNOS途径减轻AT II细胞损伤

为了验证ACE2是否通过SIRT1/eNOS途径对AT II细胞起到保护作用，我们通过SIRT1抑制剂(EX527)阻断该途径，并在缺氧条件下培养细胞。western blot检测各组中SIRT1/eNOS通路蛋白的表达。western blot检测结果显示，与对照组相比，缺氧组的SIRT1和active-eNOS表达下调，缺氧+EX527组的SIRT1和active-eNOS表达继续下调(图)3(一个))．为了深入了解SIRT1/eNOS通路的功能，我们在AT II细胞中通过SIRT1抑制剂(EX527)阻断该通路。此外，缺氧+pcDNA3.1-ACE2组与缺氧+pcDNA3.1-ACE2组相比，使用EX527后SIRT1和active-eNOS水平显著降低(图)3 (b))．AT II细胞PS和标记蛋白的表达符合上述趋势(图)3 (c))．如图所示，通过MTT法分析细胞活力，缺氧+pcDNA3.1-ACE2组相对于缺氧组细胞损伤明显减轻，EX527可逆转这一作用(图)3 (d))．然而，缺氧时，HMGB1和炎症细胞因子的表达显著上调;当ACE2过表达时，它们回落，在EX527相对于对照组显著地再次回到高水平(图)3 (e))．细胞凋亡率(图3 (f))和Ang-II(图3 (g)Ang-(1-7)水平与炎性细胞因子的变化趋势相似，而Ang-(1-7)水平与炎性细胞因子的变化趋势相反。因此，过表达ACE2可缓解缺氧诱导的细胞损伤;ACE2的作用通过使SIRT1/eNOS通路失活而失效。为此，ACE2通过激活SIRT1/eNOS通路减轻损伤，可改善全身炎症损伤，减轻细胞凋亡，促进Ang- ii向Ang-(1-7)转化，从而促进PS的产生。

4.讨论

NRDS儿童死亡率高，有可能出现后遗症，给家庭和社会带来沉重负担。因此，NRDS的防治已成为新生儿医学中最棘手的问题之一。在本研究中，我们通过hUC-MSCs分化构建了AT II细胞模型，并在缺氧环境下处理细胞，这些细胞与NRDS密切相关。随后，SIRT1/eNOS被证实是保护AT II细胞免受过表达ACE2缺氧诱导损伤的关键途径，SIRT1/eNOS通路抑制剂的加入证实了我们的假设。

一般认为ARDS发病机制始于炎症过程，炎症过程介导肺泡损伤[23]，最后形成透明膜[24]。据报道，ACE2可促进Ang- ii转化为Ang-(1-7)的形成，被发现可作为糖尿病肾病的治疗方法[25]。首先，ACE2被证明通过降低HMGB1及其下游炎症级联反应来发挥保护作用，以改善缺氧诱导的心肌细胞损伤[26]。HMGB1是一种重要且常见的染色质结合蛋白，参与疾病发病和肿瘤进展。此外，有报道称，重组ACE2可有效减少细胞凋亡和炎症[27]，以及Ang-II与NO之间的拮抗机制[28]。Ang-II可以通过激活NF直接增加HMGB1的表达κB早期引起靶器官内皮功能障碍[18]，特别是肺损伤引起的急性呼吸窘迫综合征[19]。此外，在心血管损伤和内皮功能障碍组织中，已在小鼠中证实eNOS与HMGB1的表达水平呈负相关[29]。同时，一项研究表明NRDS与SIRT1信号通路显著相关，SIRT1参与肺损伤的抗炎作用[30.]。ACE2和SIRT1信号通路协同降低了RDS中HMGB1介导的炎症不良改变[30.]。在本研究中，我们不仅发现ACE2促进了Ang-II的耗尽，而且还发现了HMGB1释放和NF的减少κ检测到B通路激活，与既往研究一致。

PS由AT II细胞产生和释放，参与维持肺泡液表面活性剂稳态和进行宿主防御的生理过程。由于表面活性剂稳态失衡，导致包括NRDS在内的多种肺部疾病，而PS的缺乏对肺损伤的生物物理功能至关重要[31]。此外，PS在先天免疫防御中发挥主要作用，与严重肺损伤的发生密切相关，而其缺失则导致肺病理[32]。此外，SIRT1信号通路可以促进PS的合成和释放，从而有效防止NRDS的发生[30.]。SIRT1与eNOS呈正相关;具体来说，SIRT1增加eNOS的激活，产生NO [33]，可直接促进AT II细胞中PS的合成[9]。在我们的研究中，与缺氧诱导的细胞相比，过表达ACE2的AT II细胞恢复了PS的产生，而添加SIRT1抑制剂(EX527)又使PS水平下降。

在机制上，过表达ACE2通过消耗Ang- ii生成Ang-(1-7)介导了SIRT1/eNOS通路的激活，从而显著下调了炎性细胞因子，缓解了细胞凋亡，并防止了PS产生的损害。在体外．本研究为应用新疗法预防和缓解NRDS提供了初步的数据支持。

综上所述，尽管我们探索并总结了ACE2改善AT II细胞损伤的潜在机制在体外，对NRDS的积极作用在活的有机体内仍需在未来的研究中进行测试确认。

缩写

”:	新生儿呼吸窘迫综合征
PS:	肺表面活性物质
在二细胞:	肺泡II型细胞
SPs:	表面活性剂的蛋白质
KGF:	角化细胞生长因子
CK-8:	Cytokeratin-8
ACE2:	血管紧张素转换酶2
以挪士:	内皮型一氧化氮合酶
SIRT1:	Sirtuin蛋白1
hUC-MSCs:	人脐带间充质干细胞
SAGM:	小气道上皮细胞生长培养基
合:	辣根过氧化物酶
HMGB1:	高流动性组盒

数据可用性

本文中的所有原始数据均可在合理要求的情况下由通讯作者提供。

的利益冲突

我们声明没有利益冲突。

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