文摘

肺癌是最常见的侵袭性恶性肿瘤之一,发病率和死亡率高,在肺腺癌(LUAD)是最普遍的亚型。累积证据展示,小分子核糖核酸参与LUAD发生和进展。在这项研究中,mir - 182 - 5 - p观察增加LUAD组织和细胞系。超表达mir - 182 - 5 - p可以显著促进细胞增殖,迁移和入侵LUAD。通过生物信息学分析,STARD13是理论化的目标基因mir - 182 - 5 - p,在LUAD低表达。进一步的分子实验显示,mir - 182 - 5 - p绑定到3 - - - - - -STARD13翻译区,有一个逆相关性STARD13和mir - 182 - 5 - p LUAD。救援的实验表明,沉默STARD13明显恢复的抑制作用降低mir - 182 - 5 - p细胞增殖,迁移和入侵LUAD。在一起,我们的研究结果揭示了小说的角色mir - 182 - 5 - p / STARD13 LUAD发展轴。

1。介绍

肺腺癌(LUAD)作为最常见的肺癌的组织学亚型负责所有肺癌病例的40%。它有高转移和侵袭性潜力,与一个贫穷的生存5年(1]。深刻的研究的病理学LUAD是当前科学研究中最重要的。寻找新靶点分子疗法通过基础研究可以提供新鲜的诊断和预后LUAD策略,从而影响LUAD患者的早期诊断和改善治疗功效。

许多细胞细胞分化等生物功能,发展,发展,和细胞凋亡是由一类非编码rna小,即小分子核糖核酸(microrna) [2,3]。通过反向调节基因表达在转录后的级别,microrna能抑制基因翻译和导致的直接降解mrna (4]。mir - 182 - 5 - p作为新型癌症相关的microrna的广泛报道发挥监管作用的各种肿瘤。曹et al。5)观察到增加mir - 182 - 5 - p在肝细胞癌组织和细胞促进肿瘤细胞增殖、迁移,并通过FOXO3a抑制入侵。李等人。6]发现mir - 182 - 5 - p是调节在口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞和临床样本,以及函数作为癌基因在OSCC通过阻碍CAMK2N1表达式。mir - 182 - 5 - p被确定为致癌基因在卵巢癌7],乳腺癌和[8],黑色素瘤[9),而这对一个在肾细胞癌的抑制作用[10,11和膀胱癌12]。关于mir - 182 - 5 - p的不同的角色在不同的肿瘤,这可能是由于不同肿瘤的异质性。在非小细胞肺癌(NSCLC), mir - 182的致癌作用和促进细胞增殖行为直接针对FBXW7 FBXW11,表明mir - 182可能是一个新鲜的非小细胞肺癌的诊断和预后的生物标志物(13]。然而,很少有详细调查的调控机制,mir - 182 - 5 - p在LUAD及其作用。

在这项研究中,我们确定了StAR-related脂质转运蛋白13 (STARD13),目标基因有最强的负相关mir - 182 - 5 - p,通过生物信息学分析为研究对象。STARD13,即DLC2,位于染色体13 q12.3ρ是GTPase-activating蛋白质,它已经被证明是一个肿瘤抑制因子(14]。例如,STARD13前列腺癌中表达下调,其过度阻碍癌细胞扩散(15]。它也被认为是一个肿瘤抑制因子在肝细胞癌(16]。但是,没有相关的报道集中在LUAD STARD13。

本研究深入调查的表达和分子机制mir - 182 - 5 - p和STARD13 LUAD,和我们的结果可能为治疗靶点的发现奠定理论基础底层LUAD。

2。材料和方法

2.1。生物信息学分析

成熟的microrna的表达谱(正常: ;肿瘤: ),以及信使rna序列数据(正常: ;肿瘤: ),从癌症基因组图谱下载(TCGA)数据库。微分分析是由使用R的包与正常磨边机,控制样品。与 和 阈值的选择差异表达microrna (DEmiRNAs),感兴趣的microrna的决心。然后,目标microrna的下游靶基因预测通过TargetScan mirDIP, miRDB miRWalk和母星数据库。TCGA-LUAD同时,基于基因表达,表达下调差异表达rna (DEmRNAs) LUAD与预测结果筛选出目标mRNA,从而确定miRNA-mRNA监管。

2.2。细胞培养

人类LUAD细胞系A549 (BNCC341254) Calu-3 (BNCC338514),中冲(BNCC340767)和PAa (BNCC341415)和人类支气管上皮细胞系BEAS-2B (BNCC338205)都从希伯来文名字购买文化集合(BNCC)。A549和PAa细胞准备在罗斯威尔公园纪念研究所- 1640 (rpmi - 1640)中。Calu-3细胞培养在最低基本Medium-Earle平衡盐溶液(MEM-EBSS)。中冲和BEAS-2B细胞培养在杜尔贝科的修改鹰中葡萄糖(DMEM-H)媒介。在这项研究中使用的媒介都含有10%胎牛血清的边后卫和补充了100 U /毫升链霉素(Gibco;热费希尔科学,Inc .)和100 U /毫升青霉素(Gibco;热费希尔科学,Inc .)。细胞培养在孵化器37°C,公司为5%2。

2.3。细胞转染

mir - 182 - 5 - p模仿和mir - 182 - 5 p抑制剂及其对应的负面都从Sangon访问控制生物技术(上海,中国)。当细胞融合增长到50%,合成序列mir - 182 - 5 - p模仿/模拟数控是暂时性的转染到LUAD细胞A549和mir - 182 - 5 - p抑制剂/抑制剂数控是暂时性的转染到细胞中冲Lipofectamine 2000的指令(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。转染后的介质取代4 - 6 h。慢病毒表达载体pLVX-IRES-neo(美国Clontech)是利用构造si-STARD13 si-NC向量,然后,对应的向量被转染到细胞。

2.4。RNA隔离和实时定量聚合酶链反应(存在)

细胞总RNA提取利用试剂盒试剂(表达载体,热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国制造商的协议。这是量化NanoDrop 2000分光光度计(热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)。上标2合成第一链cDNA工具包(热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)实施反转录。进行中存在SYBR绿色PCR混合(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)和7900年ABI棱镜检测系统(热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)。试验中使用的引物序列详细表1买来Sangon生物技术(上海,中国)。U6,β肌动蛋白作为内生参考mir - 182 - 5 - p和STARD13,分别。结果是2- - - - - -ΔΔCt价值。实验进行了一式三份。

表1
引物序列中存在。
2.5。免疫印迹

通过radioimmunoprecipitation总蛋白质分离分析(里帕)(Beyotime、上海、中国),并由bicinchoninic测量酸的浓度(BCA)蛋白质分析工具包(美国皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)。孤立的蛋白质分离10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page),然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔,Billerica的)。然后,建议使用5%脱脂牛奶膜堵塞。膜是孵化与特定的初级抗体在一夜之间在4°C和冲洗三次磷酸盐+ Tween-20 (PBST) (Beyotime、上海、中国),其次是孵化与辣根过氧化物酶(合)标记的第二抗体2 h。最后,通过增强化学发光免疫反应性的乐队是可视化(ECL)方法(热费希尔,沃尔瑟姆,妈,美国)。抗体信息如下:主要抗体兔子anti-STARD13 (Abcam ab126489, 1: 200年,剑桥,英国)β肌动蛋白(Abcam ab115777, 1: 2500年,剑桥,英国);二次抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白g h和l(合)(Abcam Ab205718, 1: 2000年,剑桥,英国)。

2.6。Dual-Luciferase报告基因分析

针对关系mir - 182 - 5 - p和STARD13验证了通过dual-luciferase报告基因分析。突变体(傻瓜)3 - - - - - -翻译区(3 - - - - - -UTR) STARD13序列是由点突变的方法。然后,野生型(WT)或狗3 - - - - - -UTR序列插入到下游pmiRGLO(美国WI Promega)荧光素酶向量,因此,荧光素酶报告质粒STARD13-WT STARD13-MUT构造。LUAD细胞系A549和中冲被播种到24-well盘子和培养为24小时37°C。之后,mir - 182 - 5 - p模仿/模拟数控和STARD13-WT /狗cotransfected进A549细胞,而mir - 182 - 5 - p抑制剂/抑制剂NC和STARD13-WT /狗cotransfected成中冲细胞。Renilla荧光素酶表达载体pRL-TK(豆类,大连,中国)作为内部参考。转染48 h后,相对荧光素酶活性与dual-luciferase评估检测设备(WI Promega,麦迪逊,美国)。

2.7。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

转染细胞被播种在96 -孔板的密度 细胞/。后0、24、48、72和96 h, 10μl CCK-8解决方案(Dojindo、熊本、日本)添加到每个细胞培养的另一个2 h。光密度(OD)发现了价值450海里标(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.8。伤口愈合实验

细胞接种6-well板( 细胞/)。细胞增长完全融合后,200年μl吸管提示实施轻轻地刮在细胞单层人工伤口。PBS的刮细胞被冲洗掉。伤口愈合是0和24小时后观察和拍照。

2.9。细胞入侵检测

Transwell钱伯斯(BD生物科学)涂层与基底膜基质®是推荐评估细胞的入侵。约 细胞接种到参议院涂层与基底膜基质(纽约康宁)和无血清培养基培养,而众议院补充10%的边后卫。24小时后,细胞通过基底膜基质膜固定,然后用结晶紫染色。入侵细胞的数量计入5-random字段在显微镜下。

2.10。统计分析

数据管理和分析进行SPSS 21.0统计软件。提出了测量数据 ,并采用两组之间的比较 - - - - - -测试,是由多组比较单向方差分析。 意味着差异具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。mir - 182 - 5 - p是特别是LUAD组织和调节细胞

TCGA LUAD成熟的microrna的表达数据的数据库,理论化,mir - 182 - 5 - p在LUAD显著调节组织(图1(一)),并与正常组织相比,差异显著。调查的潜在作用mir - 182 - 5 - p LUAD的恶性进展,存在进行评估mir - 182 - 5 - p各LUAD细胞系的表达。如图1 (b),与之相比,人类支气管上皮细胞系(BEAS-2B),有一个增加mir - 182 - 5 - p的表达在人类LUAD细胞系(A549, Calu-3中冲,PAa)。A549和中冲细胞被选为后续分析。

(一)
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(b)
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图1
mir - 182 - 5 - p是LUAD组织和细胞中高度表达。(一)箱线图mir - 182 - 5 - p在正常表达( )和肿瘤( )从TCGA-LUAD组织样本。(b) mir - 182 - 5 - p的表达在人类支气管上皮细胞系(BEAS-2B)和人类LUAD细胞系(A549, Calu-3中冲,PAa)。 ; 。
3.2。mir - 182 - 5 - p加速细胞增殖,迁移和入侵LUAD

进一步研究的生物功能mir - 182 - 5 - p LUAD细胞,mir - 182 - 5 - p模仿/模拟数控转染到A549细胞株而mir - 182 - 5 - p抑制剂/抑制剂数控转染到细胞中冲,从而实现mir - 183 - 5 - p超表达/人工沉默。提出了图2(一个),每组有利的转染mir - 182 - 5 - p的功效,可以用于后续分析。CCK-8化验的结果体现,mir - 182 - 5 - p超表达促进A549细胞的增殖,而沉默mir - 182 - 5 - p降低(图中冲的增殖细胞2 (b))。伤口愈合试验的结果表现出的upregulation mir - 182 - 5 - p培育LUAD细胞迁移而沉默mir - 182 - 5 - p大大阻碍了细胞迁移(图2 (c))。Transwell分析还指出,A549细胞的入侵能力mir - 128 - 5 - p模仿组明显增强mir - 128 - 5 - p模仿组,而中冲mir - 128 - 5 - p细胞抑制剂组显著下调(图2 (d))。因此,可以得出结论,mir - 182 - 5 - p影响细胞增殖,迁移和入侵LUAD LUAD发展发挥了关键作用。

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图2
mir - 182 - 5 - p加速细胞增殖,迁移和入侵LUAD。(一)mir - 182 - 5 - p表达细胞系A549和中冲发现通过转染后存在。(b) CCK-8试验被用来评估不同转染组细胞的增殖能力(模拟数控,mir - 182 - 5 - p模仿,抑制剂数控,和mir - 182 - 5 - p抑制剂)。(c)伤口愈合试验进行检测在不同转染组细胞的迁移能力。(d)入侵检测进行了测量不同转染组细胞的入侵能力(×100)。 。
3.3。STARD13 LUAD低表达,是一个下游mir - 182 - 5 - p的目标

下游调控机制的进一步研究mir - 182 - 5 - p, mir - 182 - 5的下游靶基因- p预测到5公共数据库(TargetScan miRDB,母星,mirDIP miRWalk)。首先,微分分析在TCGA-LUAD基因数据集,和533年下调DEmRNAs与预测mrna获得目标基因(图43(一个)),其中STARD13有最强的逆相关mir - 182 - 5 - p(图3 (b)),在癌组织(图突出低表达3 (c))。因此,STARD13被选为潜在的监管目标,mir - 182 - 5 - p。之后,存在和免疫印迹分析进行了探测STARD13信使rna和蛋白质含量在不同LUAD细胞系。如数据所示3 (d)和3 (e),与之相比,人类支气管上皮细胞系(BEAS-2B) STARD13信使rna和蛋白质水平显著降低人类LUAD细胞系(A549, Calu-3中冲,PAa)。通过分析在TargetScan数据库中,发现3 - - - - - -UTR STARD13 mRNA的互补地区mir - 182 - 5 - p(图3 (f))。随后,dual-luciferase报告基因分析是用于验证绑定的mir - 182 - 5 - p和STARD13。结果显示,mir - 182 - 5 - p模仿导致细胞的荧光素酶活动的差别明显对这些STARD13-WT mRNA 3 - - - - - -UTR集团,而没有对STARD13-MUT集团的荧光素酶活性产生重大影响。此外,mir - 182 - 5 - p抑制剂导致的荧光素酶活性增加细胞STARD13-WT组而STARD13-MUT组中没有观察到明显的变化(图3 (g)),这表明mir - 182 - 5 - p可能下调STARD13通过绑定STARD13 3基因的表达 - - - - - -UTR。此外,免疫印迹还提出,mir - 182 - 5 - p模仿STARD13 A549细胞中表达减少,而mir - 182 - 5 - p抑制剂STARD13表达增加(图中冲细胞3 (h))。这些结果表明,mir - 182 - 5 - p可能下调STARD13表达式。

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图3
STARD13 LUAD低表达,是一个下游mir - 182 - 5 - p的目标。(a)目标基因的交叉mir - 182 - 5 - 5 p预测数据库和DEmRNAs使之抑制。(b)的热图mir - 182 - 5 - p的相关性和预测的基因。(c)的箱线图STARD13表达水平在正常( )和肿瘤( )组。(d, e) STARD13 mRNA和蛋白表达水平在人类支气管上皮细胞系(BEAS-2B)和人类LUAD细胞系(A549, Calu-3中冲,PAa)。(f)的结合位点mir - 182 - 5 - p和STARD13。(g)的绑定mir - 182 - 5 - p和STARD13 dual-luciferase验证了报告基因分析。(h)免疫印迹检测超表达的影响/沉默STARD13 mir - 182 - 5 - p的表达。 ; 。
3.4。mir - 182 - 5 - p影响细胞增殖、迁移,并通过调节STARD13入侵

调查是否mir - 182 - 5 - p催促中冲细胞的恶性进展通过针对STARD13 si-STARD13和mir - 182 - 5 - p抑制剂cotransfected成中冲细胞。首先,存在进行评估mir - 182 - 5 - p和STARD13 mRNA的表达。与此同时,免疫印迹进行测量STARD13蛋白质表达。结果指出,当mir - 182 - 5 - p被抑制,有STARD13 mRNA和蛋白水平增加(数据4(一)和4 (b))。接下来,进行了跟踪实验来验证我们的预测。CCK-8试验表明相比mir - 182 - 5 - p抑制剂+ si-NC集团si-STARD13和mir - 182 - 5 - p抑制剂cotransfection可以恢复中冲细胞的增殖活动(图4 (c))。伤口愈合实验表现,沉默mir - 182 - 5 - p导致LUAD减少细胞迁移,同时压制mir - 182 - 5 - p和STARD13获救细胞迁移能力(图4 (d))。Transwell入侵分析显示,与抑制剂数控+ si-NC组相比,细胞入侵能力被沉默阻碍了mir - 182 - 5 - p虽然被压制救起mir - 182 - 5 - p和STARD13同时(图4 (e))。在一起,这些发现表明,mir - 182 - 5 - p调制扩散,迁移,并通过针对STARD13入侵中冲细胞。

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图4
mir - 182 - 5 - p影响细胞增殖、迁移,并通过调节STARD13入侵。(a)中存在评估mir - 182 - 5 - p和STARD13 mRNA的表达中冲每个转染组细胞(抑制剂数控+ si-NC, mir - 182 - 5 p抑制剂+ si-NC和mir - 182 - 5 - p抑制剂+ si-STARD13)。(b)免疫印迹检测STARD13在每个转染组蛋白表达。(c) CCK-8发现LUAD在每个转染组细胞增殖。伤口愈合(d)分析评估LUAD在每个转染组的细胞迁移。(e)入侵检测测量细胞入侵LUAD每个转染组(×100)。 。

4所示。讨论

microrna是确认调节基因的表达与肿瘤的发展,增殖,凋亡,应激反应(17- - - - - -20.在很多人类癌症),异常的表情。TCGA-LUAD在这项研究中,通过数据分析,mir - 182 - 5 - p被发现显著差异表达在LUAD及其下游负调节基因STARD13出土。最重要的是,这项研究集中在针对mir - 182 - 5 - p之间的关系和STARD13,从而提高监管机制mir - 182 - 5 - p LUAD在分子水平上。

一些研究报道mir - 182 - 5 - p的角色在不同癌症恶化[21,22]。例如,mir - 182 - 5 - p促进细胞生存能力、有丝分裂、迁移和入侵人类胃癌(差别通过RAB27A对这些23]。在目前的研究中,mir - 182 - 5 - p表达式进行评估,发现在LUAD明显调节细胞。一项研究[8)报道,调节mir - 182 - 5 - p作为促进癌症的癌基因在乳腺癌细胞增殖和迁移。此外,mir - 182 - 5 - p也调节在NSCLC肿瘤样本,旨在促进癌细胞的恶性进展蒸机压制,和其高表达与惨淡的非小细胞肺癌患者的预后相关(24]。在这项研究中,mir - 182 - 5 - p超表达促进增殖,迁移,和A549细胞的入侵,而沉默mir - 182 - 5 - p阻碍中冲细胞的恶性发展。

后来,下游目标mrna mir - 182 - 5 - p预测。自mir - 182 - 5 - p与STARD13逆相关性最高,这是猜测,mir - 182 - 5 - p可能影响通过调制STARD13 LUAD的恶性发展。STARD13或START-GAP2也称为DLC2基因。Ching et al。25第一次)发现,STARD13是肝细胞癌低表达。STARD13有c端域和一个氨基端山姆域,它拥有两个域之间的差距为ρgtpase域(25- - - - - -27]。STARD13作为一种肿瘤抑制蛋白抑制乳腺癌细胞的生长,会产生一个antimetastasis效应和压制RhoA活动(28]。STARD13 Raf-1-ERK1/2-p70S6K信号通路的调节在肝癌阻碍癌细胞的生长和迁移29日]。在这项研究中,与人类支气管上皮细胞系BEAS-2B相比,STARD13低LUAD细胞系中表达。Dual-luciferase报告基因分析证实mir - 182 - 5 - p可以直接目标3 - - - - - -UTR STARD13。此外,STARD13表达显著下调了overexpressing mir - 182 - 5 - p,这是相反的,当沉默mir - 182 - 5 - p。细胞功能检测认证,沉默mir - 182 - 5 - p阻碍细胞增殖,migrative,和入侵的能力,而这种影响又恢复了mir - 182 - 5 - p抑制剂+ si-STARD13组。

总的来说,mir - 182 - 5 - p发挥了关键作用LUAD细胞的恶性进展,及其表达LUAD细胞的转移性活动的影响。STARD13作为一个肿瘤抑制器的靶蛋白基因mir - 182 - 5 - p。总之,mir - 182 - 5 - p通过针对STARD13调制的恶性发展。这些发现表明STARD13 LUAD的可能是一个潜在的治疗目标。在接下来的调查中,我们将核实是否STARD13调节的恶性进展LUAD STARD13-RhoA-ROCK等通过信号通路,从而治疗LUAD奠定了基础。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。数据和材料在当前的研究中可从相应的作者以合理的要求。

同意不适用。

的利益冲突

作者宣称他们没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

所有作者导致数据分析、起草和修改这篇文章,给了最后批准的版本发布,并同意负责所有方面的工作。所有作者同意提交出版的手稿。