文摘

的治疗效果,对肝癌射频消融术(RFA)通常是有限的残余肿瘤细胞的扩散和转移。这些现象与Warburg效应密切相关,其中ErbB2被激活。虽然RFA Warburg效应的抑制残余肿瘤细胞在早期阶段,具体机制尚不清楚。我们探讨了监管关系长非编码RNA ENST00000570843.1 (lncENST)和ErbB2使用慢病毒转染的lncENST和ErbB2超表达/干扰向量在体外和在活的有机体内肝细胞癌模型的亚致死的热量在50°C。ErbB2-mediated Warburg效应被lncENST镇压,所体现的葡萄糖摄取减少,乳酸生产smmc - 7721细胞。lncENST也增加了肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤恶化的裸体Balb / c小鼠RFA后28天。此外,我们通过生物信息学分析,启动子的预测ErbB2结合的转录因子Nkx2-5,导致负面的监管效果。证实了这种猜测Nkx2-5蛋白质和染色质免疫沉淀反应ErbB2,这表明ErbB2转录被Nkx2-5限制。我们建议lncENST轻视Warburg效应残留肿瘤细胞的表达下调ErbB2通过Nkx2-5激活。本研究旨在提供分子靶点,可以防止残留肿瘤细胞增殖RFA后,肝细胞癌治疗的临床意义。

1。介绍

癌症相关的并发症和死亡由于肿瘤恶化、转移和复发已成为世界范围的一个重要的临床问题,缺乏一个全面的解决方案。研究人员和临床医生一直面临着快速发展的挑战,低成本,和有效的治疗方案对各种类型的癌症,其中肝癌或肝细胞癌(HCC)发病率和死亡率最高的国家之一。

射频消融术(RFA)是一种微创技术,已应用于治疗肝癌和显示比较结果与手术切除(1,2]。它的主要作用机制是诱导高温杀死肿瘤细胞的局部肿瘤部位。从中心向外围区域的肿瘤,有一个渐变RFA温度分布,与中央区域达到温度高达300°C。然而,在肿瘤的过渡区,RFA温度范围的42-60°C (3]。肿瘤细胞在中央区域有效地去除,过渡区不会立即根除。在该区域,虽然凋亡机制被激活,一部分残留肿瘤细胞可能恢复亚致死的热休克后他们的活动,导致post-RFA HCC的转移和复发4,5]。不够RFA后残余癌的发病率据报道5 - 40%,占相当大的一部分人口的癌症患者(6- - - - - -8]。

残余癌细胞的生物活性,如扩散、迁移,和epithelial-mesenchymal过渡,往往增强[9]。特别是Warburg效应属于癌症细胞和癌症研究一直是一个突出的主题在最近的趋势。总之,癌细胞的过程倾向于通过糖酵解代谢而不是氧化磷酸化即使在氧气的存在被称为Warburg效应(10]。这个代谢重编程事件促进癌细胞的生长和生存,但其中涉及的分子机制是复杂的,远没有完全理解。在组件参与Warburg效应、致癌基因ErbB2,也被称为人类表皮生长因子受体2,被证明发挥Warburg效应通过激活热休克因子1和反过来上调乳酸脱氢酶(11]。相应地,ErbB2过度诱导葡萄糖摄取和乳酸生产升高,表明葡萄糖代谢的重要作用和对肿瘤细胞的转移潜能的贡献12]。

我们建议改变癌基因的表达等ErbB2可能是一个方法,淡化癌细胞的转移潜力由Warburg效应引起的。结合技术,如RFA,这样可能会提供一个策略有效地治疗癌症。癌基因和肿瘤抑制基因的表达有关的各种因素,包括各种通路的激活(13,14),DNA扩增(15),小分子核糖核酸和长非编码rna (lncRNAs) [16,17),和外部刺激(18]。我们初步的研究显示,当表达lncRNA ENST00000570843.1沉默在肝癌细胞的表达ErbB2基因调节RFA后,表明这个特定lncRNA功能抑制基因转录ErbB2。此外,lncRNA ENST00000570843.1(以下表示lncENST),其他lncRNAs,有趣的是被RFA直接与亚致死的热处理。特别是,RFA lncENST在肝癌细胞的表达明显增加(3),但这一现象和ErbB2活动之间的关系是未知的。

综上所述,我们推测,lncENST具有肿瘤抑制特性,可用于结合RFA (50°C亚致死的热应力)达到最好效果的杀死肿瘤细胞通过调节ErbB2的表达。我们旨在阐明详细机制参与RFA-mediated肝癌抑制通过lncENST过度,ErbB2的差别导致对这些基因在体外和体内。我们进一步提出,lncENST直接结合并激活转录因子Nkx2-5,其活动会损害ErbB2基因的转录,会使ErbB2蛋白表达,从而抑制残余癌细胞的Warburg效应。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和慢病毒转染

人肝癌细胞株smmc - 7721和LO2从中国获得类型文化中心收集和杜尔贝科修改鹰的培养基培养(美国UT SH30022.01B、HyClone、南洛根)含10%胎牛血清(10270 - 106,Gibco大岛,纽约,美国)。细胞培养在湿润的气氛中有5%的公司₂在37°C。超表达向量pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro和干扰向量pSICOR买来Addgene(水镇、马、美国)。lncENST和ErbB2通过聚合酶链反应(放大5 lncENST前锋呢 - - - - - -GCTCTAGAATAGCCGCCCGGCTAGCT-3和反向5 - - - - - -CGGAATTCCCTTCCGGGTTCACGCTA-3 ;ErbB2前5 - - - - - -GCTCTAGAATGGAGCTGGCGGCCTTGTGC-3和反向5 - - - - - -CGGAATTCTCACACTGGCACGTCCAGACC-3 )和插入pLVX向量EcoRI和BamHI限制性位点产生lncENST和ErbB2超表达载体(分别lnc-OV和ErbB2-OV)。干扰片段(lncENST 5 - - - - - -GGAATTGTTGGTCAGGCAAAC-3和ErbB25 - - - - - -GCTCTTTGAGGACAACTATGC-3 )插入pSICOR向量XhoI和BamHI限制性位点产生lncENST和ErbB2干扰向量(分别lnc-INT和ErbB2-INT)。与lnc-OV转染smmc - 7721细胞/ INT或ErbB2-OV / INT使用Lipofectamine 2000(11668 - 027年,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)根据制造商的指示。Nontransfected细胞(标记为“控制”)被用作控制。

2.2。体外亚致死的热处理和Nkx2-5激活

模拟RFA,在体外亚致死的热应力模型成立于smmc - 7721细胞。相应的细胞被镀和刺激的水浴加热设置为10分钟50°C。此后,立即治疗细胞受到后续实验。模拟Nkx2-5的激活,重组人类Nkx2-5蛋白质(ab152305 Abcam,剑桥,英国)添加2μ克/毫升。

2.3。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

进行CCK-8试验后分析工具包提供的指令(PAB180031 Bioswamp,武汉,中国)。控制或转染smmc - 7721细胞被播种到96 -孔板 细胞/在100μL生长介质和孵化隔夜37°C。细胞受到亚致死的热处理后,10μL CCK-8反应混合物(包含在分析工具包)添加到每个好,和细胞培养4 h 37°C。井的吸光度是使用一个微型板块读者阅读(Multiskan FC,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)在450海里。

2.4。流式细胞术检测细胞凋亡

细胞凋亡的评估是通过流式细胞术使用FITC膜联蛋白V凋亡检测设备(BD生物科学,556547年富兰克林湖,新泽西,美国)根据制造商的指示。细胞治疗使胰蛋白酶化使用0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸和离心机 5分钟(19]。上层清液被免职,细胞resuspended磷酸盐(PBS)和统计。约 细胞被离心机 在4°C(5分钟19]。上层清液被丢弃后,1毫升的预冷PBS添加到细胞形成一个暂停,混合和离心机 5分钟在4°C。上层清液被除去,重复前面的步骤。然后,200年μL绑定缓冲被加入到细胞和膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯和碘化propidium (5μL的)被添加到细胞悬液,轻轻混合。这些细胞被培养30分钟在4°C在黑暗中,300人μL(绑定缓冲接着说;之后,流式细胞术进行立即使用NovoCyte装置(究其生物科学公司,圣地亚哥,美国)的数据进行了分析使用NovoExpress软件(究其生物科学有限公司)19]。

2.5。评估的葡萄糖摄取和乳酸生产

葡萄糖吸收是评估使用屏幕追求™比色葡萄糖吸收试验装备(36503年,AAT Bioquest,桑尼维尔,美国)根据制造商的指示。治疗细胞孵化与2-deoxyglucose 37°C大约30分钟。细胞被洗和细胞溶解,细胞溶解产物与提供孵化试验混合物在室温下2 h。吸光度是阅读在570/610 nm和象征的相对葡萄糖吸收。生产乳酸,乳酸测定工具包(k607 - 100, BioVision,苗必达、钙、美国)应用遵循制造商的指示。治疗细胞被播种在96 -孔板在50岁μL /好,50μL反应混合物含有46个μL乳酸测定的缓冲区,2μL的探针,2μL的酶组合工具包中提供的(所有)添加到每个。板块涨跌互现,在室温下孵化30分钟没有光线。吸光度测量在570海里,是指示性的相对生产乳酸。

2.6。定量逆转录聚合酶链反应(存在)

RNA提取使用试剂盒(15596026,Ambion, Inc .,促进城市、钙、美国)和reverse-transcribed cDNA使用RevertAid合成第一链cDNA工具包(K1622,热科学)和TaqMan microRNA分析工具包(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。执行中存在使用SYBR绿色PCR试剂盒(KM4101 KAPA生物系统公司,威明顿,MA)以下引物序列:ErbB2向前5 - - - - - -ACCCGCTGAACAATACCA-3和反向5 - - - - - -GGATCAAGACCCCTCCTT-3 ;Nkx2-5向前5 - - - - - -TGTGCGTCTGCCTTTCCC-3和反向5 - - - - - -GCGTTGTCCGCCTCTGTC-3 ;和GAPDH向前5 - - - - - -CCACTCCTCCACCTTTG-3和反向5 - - - - - -CACCACCCTGTTGCTGT-3 。实验条件如下:最初在95°C变性3分钟;39变性的周期为5 s在95°C,退火在56为10°C,在72°C 25 s和扩展;在65°C和最终扩展为50年代5 s和95°C。数据采集进行了使用QuantStudio™6 Flex实时PCR系统(应用生物系统公司)和分析2^{- - - - - -ΔΔCt}方法(19]。

2.7。免疫印迹

组织或细胞总蛋白质分离前世行分析。细胞被冷PBS冲洗两次,其次是使用radioimmunoprecipitation裂解试验(里帕)缓冲区(PAB180006 Bioswamp)在4°C。之后,细胞样本被转移到埃普多夫管,紧随其后的是10分钟95°C下的加热和10分钟的离心分离 。此后,我们获得上层清液和保存他们在-80°C。组织(20毫克)均质使用缓冲区里帕(150 - 250μL),紧随其后的是15分钟的离心分离 。后来,我们收获的上层清液和保存他们在-80°C下后续分析。bicinchoninic酸试验设备(PAB180007 Bioswamp)是用来量化蛋白质在组织和细胞内容上层清液符合特定的指令。然后,蛋白质样本整除(20μg)通过sds - page分离,随后转移到PVDF膜(IPVH00010、微孔、伯灵顿,妈,美国)以及阻塞用PBS /渐变20 (PBST)含有5%脱脂奶在环境温度为2 h。之后,我们使用初级孵化膜抗体在4°C下一夜之间,包括兔子anti-ErbB2 (PAB33179) anti-Nkx2-5 (PAB34145),或anti-GAPDH (PAB36264)抗体(1:2000年,Bioswamp)。膜使用三次PBST后来冲洗5分钟,其次是1 h孵化使用山羊anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(1:20000年,PAB160011 Bioswamp)在环境温度。PBST的洗5分钟后三次,immunodetection是由增强化学发光试剂(WBKLS0010,微孔)。Tanon - 5200系统(Tanon、上海、中国)是用于可视化,而Tanon软件被用于分析。

2.8。动物实验

所有动物实验按照道德准则的湖北省动物使用和保护委员会(允许没有。SYXK 2018 - 0104)。前不久雌性Balb / c-nuν老鼠(Huafukang生物科学有限公司、北京、中国)重19 g是安置在specific-pathogen-free环境。在实验中,小鼠麻醉使用1%戊巴比妥(30毫克/公斤)通过腹腔注射。的在活的有机体内肝细胞癌异种移植模型建立了注入Huh-7细胞( 细胞在100年μL为每个鼠标)皮下注射到老鼠的右腋部。五天之后,老鼠收到尾静脉注射lncENST或ErbB2的超表达/干扰慢病毒载体(0.5μ克/μL在20μL盐水的老鼠)一周一次。控制老鼠注射生理盐水。RFA治疗,一个多极RFA装置(模型TJ358 WE568,上海Hongmai医疗器械有限公司,有限公司,上海,中国)是用于应用程序的亚致死的热应力在活的有机体内异种移植小鼠。RFA是执行一次实验期间如前所述[20.]。在异种移植肿瘤已发展到6毫米的体积³的针探针RFA装置是5毫米插入肿瘤。RFA是150年代应用于2 W 300 J (RFA应用在这些条件下可以达到治疗4毫米半径)。肿瘤生长监测在28天通过测量肿瘤的长度和宽度每隔一天。肿瘤体积计算 。28天的尽头,老鼠牺牲用1%的戊巴比妥麻醉后通过腹腔注射(30毫克/公斤),提取肿瘤。

2.9。组织准备和嵌入

肿瘤组织中提取被切成小块( )和固定在10%福尔马林48 h。固定标本然后用水洗,脱水乙醇使用一系列分级浓度(50%、70%、85%、95%和100%)。此后,标本是沉浸在同等体积的乙醇和二甲苯为2 h和纯二甲苯为另一个2 h使透明。接下来,嵌在融化石蜡标本3 h。嵌入组织被旋转切片机(RM2235徕卡生物系统,布法罗格罗夫,,美国)与厚度约5部分μm。

2.10。末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)测定

切片样本在二甲苯两次浸泡15分钟,用一系列分级浓度的乙醇(100%,95%,85%,和75%)在每个浓度为5分钟。然后,10分钟的样本用自来水洗净和孵化蛋白酶K在室温15 - 30分钟。TUNEL反应混合物准备使用TUNEL分析工具包提供的组件(11684817910,罗氏、巴塞尔、瑞士)。

组织样本与50孵化μL反应混合物的湿润环境37°C 1 h和PBS洗了三次。然后,与50个样本孵化μL(过氧化物酶解决方案工具包中提供的()在37°C与PBS 30分钟,清洗三次。此后,50 - 100μL diaminobenzidine添加到样本和孵化15 - 25°C 10分钟。与PBS最后三个洗后,样本与苏木精复染色(PAB180015 Bioswamp),脱水,使透明,密封的盖玻片。可视化使用光学显微镜细胞凋亡,凋亡细胞染色棕色。

2.11。免疫荧光组织样本的

组织部分deparaffinized和受到抗原检索和内源性过氧化物酶阻断如前所述。5分钟的部分与PBST洗两次,阻止5% BSA 10分钟。阻塞后,部分与兔子孵化主要抗体ErbB2 (1: 50, PAB33179 Bioswamp)或Nkx2-5 (1: 50, PAB34145 Bioswamp)一夜之间在4°C。与PBS的部分被洗了三次5分钟每个孵化和Alexa萤石488 -共轭Affinipure山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)二级抗体(1:200年,PAB160027 Bioswamp) 1 H在37°C在黑暗中,紧随其后的是PBS洗涤 。核染色进行了使用20μL (4 ,6-diamidino-2-phenylindole,样本被安装在荧光显微镜玻片。

3所示。统计分析

所有实验进行了一式三份( ),和数据的 (SD)。统计分析是由单向方差分析与图基测试多个比较使用OriginPro 8。 被认为是具有统计学意义。

4所示。结果

4.1。亚致死的热强调lncENST抑制肝细胞癌肿瘤行为的影响

我们第一次验证的作用lncENST RFA-mediated肝癌抑制和特定的现象牵涉其中。一个在体外肝癌模型建立了使用smmc - 7721细胞,转染用的lncENST过度(lnc-OV)或干扰(lnc-INT向量(图)1(一))。亚致死的热处理应用在50°C模拟RFA后,转染细胞的生长行为监控热应力。热处理的细胞lncENST沉默扩散到更大的程度上比nontransfected细胞,而那些过表达lncENST显示增殖能力下降(图1 (b))。扩散的结果辅以凋亡行为(图1 (c)),即lnc-OV导致热处理显著的细胞凋亡(27.1%)细胞和lnc-INT抑制细胞凋亡(6.34%)比nontransfected细胞(控制,9.4%)。

我们有兴趣调查这些变化是否在增殖和凋亡是由lncENST Warburg效应。首先,我们评估了葡萄糖摄取和乳酸生产、Warburg效应的特征,在亚致死的热处理LO2正常肝细胞和肝细胞转染lnc-OV或lnc-INT。显然,LO2正常肝细胞没有表现出显著增加葡萄糖摄取(图2(一个)(图)和乳酸生产2 (b))。而是肝癌细胞,lncENST沉默显示高浓度的葡萄糖吸收(图2 (c)(图)和乳酸生产2 (d)),而lncENST超表达有抑制作用的两种现象。HCC-xenografted小鼠注射lnc-OV、肿瘤增长大幅放缓,在参与小鼠相比,而lnc-INT在很大程度上促进了肿瘤的生长(图2 (e))。然而,在所有情况下,RFA(黑线)治疗效果,减少肿瘤体积相比,在non-RFA-treated老鼠(图2 (e))。我们也比较了肝癌细胞的细胞凋亡之间的异种移植肿瘤通过TUNEL分析各种治疗。lnc-OV导致增强细胞凋亡(黑箭头在图2 (f)),RFA后,所有的组织表现出广泛的领域积极TUNEL染色(棕色区域图2 (f)),lnc-OV显示细胞凋亡的最大程度。这些观察表明,lncENST发挥抗肿瘤特性的超表达Warburg效应和抑制肿瘤的生长,和RFA强调这些影响与lnc-OV的管理。

4.2。ErbB2-Mediated Warburg效应是通过激活Nkx2-5减毒在肝癌细胞

建立lncENST和RFA-mediated肝癌抑制之间的联系,然后我们验证的参与ErbB2在促进Warburg效应。smmc - 7721细胞转染与ErbB2过度(ErbB2-OV)或干扰(ErbB2-INT)向量。热处理应用在50°C模拟RFA后葡萄糖吸收(图3(一个)(图)和乳酸生产3 (b))进行评估。我们观察到ErbB2过表达时,葡萄糖摄取和乳酸产量显著增加。相比之下,两人都减少了ErbB2干扰。然后我们寻找可能诱导或抑制因素的表达ErbB2在转录水平。生物信息学分析基于冠军芯片转录因子搜索门户从试剂盒21)透露,Nkx2-5是一个转录因子结合的启动子区域ErbB2基因。因此,我们添加了一个重组Nkx2-5 ErbB2-OV-transfected细胞蛋白(模拟Nkx2-5激活)和监控其对细胞代谢的影响。我们发现Nkx2-5激活有拮抗作用ErbB2,因为它除了ErbB2-OV-transfected细胞诱导低葡萄糖摄取和乳酸生产相比只有受到ErbB2-OV转染的细胞。这可能表明的抑制效应Nkx2-5 Warburg效应的淡化的功能ErbB2在细胞的新陈代谢。

接下来,我们ErbB2-OV或ErbB2-INT注入HCC-xenografted老鼠和检查他们是否影响肿瘤的生长行为(图3 (c))。在28天观察期,ErbB2-OV诱导显著的肿瘤生长,所表示的大幅增加肿瘤体积与对照小鼠。ErbB2-INT,另一方面,似乎并没有影响肿瘤的生长。应用RFA似乎对肿瘤的生长有抑制作用,尤其是在ErbB2-OV-treated老鼠。肿瘤细胞的行为,TUNEL分析揭示了许多凋亡细胞RFA应用时,特别是在ErbB2-INT和ErbB2-OV治疗(图3 (d))。这些观察暗示ErbB2的干涉本身并没有大幅影响肿瘤的行为,但RFA仍能有效地在一定程度上导致肿瘤细胞死亡。

4.3。lncENST Nkx2-5抑制ErbB2的转录激活

我们继续评估是否针对lncENST和ErbB2之间存在的关系。转染smmc - 7721细胞后lnc-OV或lnc-INT,他们表现出降低和升高mRNA的表达ErbB2分别(图4(a))。最少、ErbB2蛋白表达遵循相同的趋势(图4(b))。在活的有机体内实验还在裸体小鼠受到肿瘤异种移植的肝细胞转染lnc-OV或lnc-INT。动物因此RFA治疗,ErbB2在肿瘤组织表达测定。预期,RFA-treated ErbB2的组织表现出相对较低的信使rna和蛋白质表达比参与同行,但在相同的一般趋势(数据4(c)和4(d))。

建立,lncENST ErbB2负监管效应,我们调查了发生机制。我们建议亚致死的燥热引起lncENST激活某个中间因素反过来控制的转录ErbB2。正如前面指出的,预测的转录因子Nkx2-5绑定到的启动子区域ErbB2基因ErbB2的影响减少细胞新陈代谢,淡化Warburg效应。来证实我们的假设,我们评估的表达是否lncENST Nkx2-5有关。图5(一个)确实表明lnc-OV调节Nkx2-5的表达,而lnc-INT了相反的效果,这说明之间的直接相关性lncENST和Nkx2-5的表达。然后我们旨在补充我们先前已经显示的结果,阐明lncENST和ErbB2之间的关系,通过集成的活化剂Nkx2-5到系统是否受到影响ErbB2表达式。尽管lnc-INT没有改变mRNA的表达ErbB2显著图5 (b)Nkx2-5活化剂的加入显著下调,而lnc-INT孤单。此外,虽然ErbB2的蛋白表达被lnc-INT调节,Nkx2-5抑制ErbB2表达式的激活水平引起的类似lnc-OV(图5 (c)),即使lncENST沉默。显然,Nkx2-5对抗对注销upregulation lnc-INT的角色ErbB2,反过来又极大地限制ErbB2蛋白表达。换句话说,我们可以合理地假设lncENST和Nkx2-5互补功能的转录调节ErbB2。

我们后来观察到的影响Nkx2-5 ErbB2的表达在肿瘤组织与lnc-OV / INT-transfected异种移植小鼠肝癌细胞免疫荧光(图6(一))。RFA治疗后,ErbB2的表达明显增加小鼠注射lnc-INT但是lnc-OV几乎完全没有在那些异种移植。相反,不同的转录因子的表达Nkx2-5 lnc-OV-xenografted小鼠肿瘤组织中观察到,在控制和lnc-INT-xenografted老鼠最小Nkx2-5表达式。此外,lnc-OV mRNA的表达下降ErbB2在肿瘤组织就像smmc - 7721细胞在体外,而Nkx2-5 mRNA表达的减少和增加了lnc-INT lnc-OV,分别为( ,图6 (b))。评价蛋白质含量导致几乎相同趋势ErbB2表达式的mRNA表达,但是lnc-INT诱导没有变化ErbB2mRNA表达,显著增加ErbB2的蛋白质水平( ,图6 (c))。

最后,我们执行染色质免疫沉淀反应证实生物信息学分析的预测(图6 (d)),即Nkx2-5和之间的结合位点ErbB2基因了。Nkx2-5蛋白质和之间的交互ErbB2基因是探索使用下拉Nkx2-5 / Nkx2-5抗体ErbB2复杂的转染smmc - 7721细胞后与过度或向量lncENST或Nkx2-5干涉。的表达ErbB2然后评估作为转录调控的迹象(图6 (e))。值得注意的是,我们发现Nkx2-5的过度导致的减少ErbB2表达,这表明ErbB2转录被Nkx2-5受阻。然而,在缺乏Nkx2-5的情况下,ErbB2表达升高极大,进一步验证Nkx2-5的监管作用的转录ErbB2。

5。讨论

RFA是一种安全而强大的治疗肝细胞癌,可以作为一个替代或补充传统的外科手术或化疗方法的策略。然而,post-RFA残余肿瘤细胞仍有问题,因为他们可能引发复发,具有转移潜能。需要确定致癌或肿瘤抑制因子相关RFA治疗因此明显为了增加它的功效。我们以前报道,几个lncRNAs改变在肝细胞癌的表达细胞治疗亚致死的热量(3),包括新发现lncRNA ENST00000570843.1 (lncENST)。考虑到许多lncRNAs发现功能和活动,就不足为奇了他们极其涉及肿瘤代谢的调节22]。残余肝细胞不足RFA后,以上的差别,对这些lncRNA FUNDC2P4证明加强epithelial-to-mesenchymal过渡通过促进钙粘蛋白的表达。这种现象导致增加肝细胞增殖,迁移和入侵,这表明缺乏FUNDC2P4 post-RFA肝癌发展和复发有关(23]。lncENST的功能和活动,这是使用在我们的研究中,还没有文献报道。我们试图验证lncENST是否是一个肿瘤抑制,可以激活RFA-induced亚致死的热量及其在肝癌细胞活动。后让lentivirus-transfected smmc - 7721肝癌细胞亚致死的热处理在50°C,我们观察到lnc-OV限制细胞增殖和促进细胞凋亡(图1)。因为我们旨在阐明这些过程的具体机制,我们进一步检查的因素可能与lncENST影响肝癌细胞代谢提供一个解释肿瘤抑制lncENST的潜力。

lncRNAs的重要功能之一是促进细胞新陈代谢通过各种酶和激酶。这样,lncRNAs能影响糖酵解和Warburg效应直接影响肿瘤细胞(24]。这种代谢重编程随后可以促进或抑制恶性转化,导致肿瘤发生和癌症进展。例如,糖酵解促进肝癌细胞的lncRNA Ftx通过过氧物酶体的激活proliferator-activated受体γ,导致肿瘤恶化[25]。

的差别相反,对这些lncRNA IDH1-AS1的癌蛋白原癌基因导致了Warburg效应通过低氧诱导因子1α,即使在常氧条件下26]。我们演示了在此的超表达lncENST大大减少ErbB2的表达,一种已知的致癌基因触发Warburg效应(11]。抑制葡萄糖的吸收和乳酸生产在肝癌细胞亚致死的热应力的存在lnc-OV(数字2(一个)和2 (b))和ErbB2-INT(数字3(一个)和3 (b))验证了这一现象。,我们认为合理的抗肿瘤效应lncENST有关的限制Warburg效应通过抑制ErbB2的表情。的在活的有机体内HCC-xenografted老鼠实验还表明,亚致死的热处理强调的肿瘤抑制效果lncENST通过促进细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的增殖,以及限制在lnc-OV-xenografted小鼠肿瘤的生长(数字2 (c)- - - - - -2 (e))。

针对lncENST和ErbB2随后澄清之间的关系在我们的研究,以提供一个机械的解释lncENST-mediated肿瘤抑制。通过生物信息学分析,我们预计Nkx2-5抑制转录的ErbB2通过绑定到其基因启动子区域(21]。同源框转录因子Nkx2-5在调节心脏增长关键功能(27),涉及心脏缺陷和疾病(28,29日]。然而,在此我们建议Nkx2-5也可能参与肿瘤抑制监管流程。我们第一次表明lnc-OV调节Nkx2-5的表达,而lnc-INT表达下调(数据5(一个)和5 (b))。值得注意的是,在这两个在体外和在活的有机体内实验中,lnc-INT似乎并没有产生重大影响的mRNA表达ErbB2,而相应的蛋白表达ErbB2被lnc-INT大幅升高。这一发现可能表明突出参与的转录因子Nkx2-5调节ErbB2活动。特别是,ErbB2不一定是受lncENST在转录水平,但是ErbB2蛋白质翻译直接激活或失活的影响Nkx2-5 lnc-OV或lnc-INT,分别。

我们的研究结果有助于优化治疗方案对各种癌症的发展,尤其是肝癌。RFA的缺点所带来的残余癌细胞的存在可以解决通过结合基因疗法和其他类似的技术。我们强调了Warburg效应和建议改变或破坏细胞的新陈代谢将可能是一个有用的方法。的重要作用,我们演示了lncRNA ENST00000570843.1目标在抑制肿瘤生长和抑制ErbB2-mediated Warburg效应。据我们所知,lncRNA ENST00000570843.1是一种新发现的lncRNA没有比我们其他任何先前的研究报道。因此,详细的属性和功能lncRNA ENST00000570843.1仍无特征但可能感兴趣的和值得深入调查。鉴于这种lncRNA的抗癌潜力已经显示在当前的研究中,我们的目标是进一步探索的性质lncRNA ENST00000570843.1在未来的研究中,特别是在致癌基因和治疗靶点的交互方式,在各种形式的压力和/或药物干预。一个全面的机械特性和潜在价值的理解不仅lncRNA ENST00000570843.1还其他lncRNAs将使我们能够充分利用他们的特点和利用他们的权力在抗癌的下一代发展策略。

新发现的lncRNA ENST00000570843.1,调节亚致死的热处理,是负调节致癌蛋白ErbB2演示。的差别,对这些基因ErbB2反过来抑制Warburg效应残留肿瘤细胞促进细胞凋亡和削弱肿瘤恶化HCC-xenografted小鼠模型。这个过程与转录因子的激活Nkx2-5,提出抑制ErbB2表达式通过lncENST超表达。结论,具体目标披露本可以作为潜在的候选分子和基因治疗肝细胞癌的治疗方法的发展。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

当前的工作是由中国国家自然科学基金(格兰特数字:81672857和81570594),重庆科技创新和应用程序项目(批准号:cstc2018jscx-msybX0130),特殊项目的军队医科大学为提高科技创新能力(授予数量:2019 xlc1009),和陆军医疗中心的创新能力发展项目计划(授予数量:2019 cxjsb015)。