文摘

微rna (MicroRNA)功能障碍已被证实为缺血性中风的关键事件的外观。本研究旨在揭示mir - 429的作用HBMECs的血管生成。HBMECs是处理氧气和葡萄糖剥夺(OGD)建立缺血性细胞模型。存在是用来测量mir - 429的表达水平在病人的血清或细胞,和CCK-8,伤口愈合实验,管形成试验被用来观察mir - 429的影响HBMECs的表型。此外,Targetscan dual-luciferase记者分析,免疫印迹被用来揭示mir - 429的下游目标和监管机制在OGD-induced HBMECs。结果表明,mir - 429显著调节病人的血清,和过表达mir - 429可能极其抑制可行性,移民和管形成OGD-induced HBMECs。此外,发现SNAI2下游mir - 429倍,和SNAI2救援mir - 429的影响OGD-induced HBMECs。此外,免疫印迹显示,mir - 429可能影响GSK-3的活动β/β连环蛋白通过抑制SNAI2的表达途径。总之,这项研究表明,mir - 429抑制血管生成的HBMECs通过SNAI2-mediated GSK-3β/β连环蛋白通路。

1。介绍

中风是一种急性脑血管疾病引起的突然破裂血管或血管阻塞,严重威胁到数以百万计的世界各地的人们的健康状况在每年1,2]。超过70%的中风可以贡献为缺血性类型,和近30%患者相关原发性出血[3]。恢复血液供应,血管生成的发展将经历当身体受到血液供应不足(4]。研究表明,血管生成发挥重要作用在脑缺血的修复,可防止患者远离中风(5]。血管生成是一个复杂的和连续的过程,它发生在缺血半影卒中后数小时内,持续数周。新成立的卒中后血管不仅改善组织灌注,还与神经与血管的重构密切相关,轴突发芽,remyelination [1- - - - - -4]。良好,血管生成密切相关,改善卒中后神经赤字(3,4]。更高的血管密度显示患者更好的缺血性中风后功能恢复的影响。因此,改善患者的血管生成已越来越被认为是一个有前途的治疗缺血性中风的治疗策略。

小分子核糖核酸(microrna的),与单一非编码RNA的长度大约20个核苷酸,已被确认为关键因素在多个活动的细胞(6,7]。在最近的十年中,越来越多的证据已经证实,障碍的microrna参与许多疾病包括癌症的形成和发展神经系统疾病(8,9]。microrna的特点是绑定3 - - - - - -UTR特别信使rna的调节相关蛋白的表达(10,11]。它已经表明,mir - 429可以抑制大肠癌的发展通过定位在大型肿瘤抑制激酶(LATS2),和减少mir - 429可以促进SRY-box转录因子的表达2 (SOX2)和b细胞淋巴瘤2 (BCL2)减弱淀粉样蛋白的积累引起的神经元损伤β蛋白质(12]。

SNAI2 angiogenesis-related因素,高度表达高葡萄糖条件下,也导致了人脑微血管内皮细胞的生存能力和迁移(HBMECs) [13]。是还发现,在这项研究中,削弱了迁移和可行性SNAI2 HBMECs可以废除的增加。玉等人也指出,与减少差别SNAI2对这些血管新生小鼠视网膜新生血管形成的14]。本研究表明,过度的mir - 203小鼠的抑制血管生成与病理性视网膜新生血管疾病通过GSK-3的失活β/β通过抑制SNAI2连环蛋白途径。

在我们的研究中,我们试图调查协会mir - 429与缺血性中风和发现mir - 429潜在的监管机制缺血性中风的进展。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和OGD治疗

人类BMECs从Generay购买生物技术(上海,中国)被用于这项研究中,和Dulbeco修改鹰的介质(DMEM)含10%胎牛血清(的边后卫)是用于培养细胞。细胞培养的37°C孵化器有限公司为5%2时,亚文化的细胞进行融合的细胞为90%。

细胞治疗与氧气和葡萄糖剥夺(OGD)缺血模型的建立。简而言之,细胞培养与glucose-free DMEM然后转移到一个厌氧室(5%和95% N2在37)2小时。之后,这些细胞被返回0,常氧文化条件12和24小时。

2.2。细胞转染

microrna的消极控制(miR-NC), mir - 429模拟,或由Generay pcDNA-SNAI2设计和纯化生物技术(上海,中国)。6-well板块的种子细胞和细胞转染时进行融合的细胞为70%。简单地说,4μ100 g的DNA, pmol RNA或10μL 2000年Lipofectamine稀释和孵化250μL为5分钟无血清培养基,分别。

同等体积的稀释转染子是coincubated稀释Lipofectamine 2000 25°C 20分钟。最后,500年μL的混合物被添加在每个好,然后,细胞培养24小时。

2.3。中存在

试剂盒购自Generay生物技术(中国上海)是利用从细胞中提取总RNA提取,提取物的浓度是通过紫外分光光度法来衡量的。一个PrimeScript®RT试剂盒(美国马萨诸塞州热费希尔)是用于逆转录的总RNA。1μ引物(10 Lμmol / L) Synbio mir - 429合成和纯化的技术(苏州、中国)的反应系统根据指令配置KAPA存在工具包(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)。U6, mir - 429的引物序列如表所示1。

表1
mir - 429和U6引物序列。
2.4。免疫印迹

里帕缓冲区从Generay购买生物技术(上海,中国)被添加到细胞总蛋白的提取,和总蛋白的浓度是衡量BCA蛋白质分析工具包(美国马萨诸塞州热费希尔)。相关的蛋白质被孤立于总蛋白质聚丙烯酰胺凝胶PVDF膜上,然后被转移。随后,PVDF膜被5%无脂牛奶1小时然后孵化相关主要抗体在一夜之间在4°C。之后,膜相关的第二抗体孵育1小时25°C。最后,蛋白质的表达水平观察化学发光检测系统。抗体被用于如下:反β连环蛋白(1:500;细胞信号技术),anti-p-GSK3β(在Ser9, 1: 500;细胞信号技术),anti-GSK3βThermoFisher(1: 1000年,马萨诸塞州,美国),和anti-SNAI2 (ThermoFisher 1: 2000年,马萨诸塞州,美国)。

2.5。Dual-Luciferase报告基因分析

pmirGLO荧光素酶记者向量包含野生和突变体3 - - - - - -UTR SNAI2序列被定义为SNAI2-mutant类型(SNAI2-mut)和SNAI2-wild类型(SNAI2-wt),分别。分别SNAI2-mut和SNAI2-wt cotransfected mir - 429模拟或miR-NC hek - 293 t细胞,分别。之后,细胞培养24小时。最后,hek - 293 t的荧光素酶活性被dual-luciferase记者观察分析系统。

2.6。管形成分析

细胞治疗OGD种子到24-well板涂层与基底膜基质(BD生物科学,圣何塞、钙、美国),并与DMEM培养包含15%的边后卫在37°C, 5%的公司2为24小时。之后,五个随机领域的管的形成是由显微镜观察和拍照,并在每个管的平均长度是衡量ImageJ软件(NIH)。

2.7。伤口愈合实验

HBMECs种子入6-well盘子和培养24小时,和细胞转染相关转染子48小时。处理OGD后,细胞单层被刮到200年μL吸管提示后直线底部的盘子,然后脱落细胞被洗的磷酸盐(PBS)的解决方案。之后,细胞与新鲜血清DMEM培养24小时。最后,愈合的细胞在显微镜下观察到0和24小时,和图像软件被用来衡量划痕的宽度。

2.8。统计分析

实验研究中进行了至少3次,独立。SPSS 20.0进行分析的数据,数据被绘制GraphPad Prism 8.0。卡方检验、方差分析与图基的事后测试是用来计算组之间的差别。 意味着两组存在统计学意义。

3所示。结果

3.1。mir - 429显著调节在缺血性中风患者的血清

分析连接mir - 429和缺血性中风,mir - 429的表达水平测量患者和正常人的血清中存在。结果表明,mir - 429显著调节血清中患者与正常人相比(图1(一), )。此外,发现mir - 429是显著下调OGD-induced HBMECs(图1 (b), )。

(一)
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(b)
(b)
图1
mir - 429显著调节患者的血清和表达下调OGD-induced HBMECs。(a)的相对表达水平的病人的血清mir - 429。(b)的相对表达水平mir - 429治疗HBMECs OGD 12 h, 24小时和48小时。 的意思 。
3.2。mir - 429过度监管HBMECs的表型

mir - 429模拟和miR-NC cotransfected HBMECs处理OGD和再灌注24小时之前,为了调查mir - 429的影响在缺血性中风的进展。CCK-8、管的形成和伤口愈合是用来观察生存能力的变化和管细胞的形成。发现的可行性OGD-induced细胞与正常细胞相比均有显著抑制(图2(一个), )。与OGD-induced细胞转染miR-NC相比,与增加mir - 429细胞的生存能力下降明显(图2(一个), )。除此之外,它还发现,OGD治疗可以促进HBMECs管形成和迁移而mir - 429 upregulation可以抑制这种现象(数字2 (b)和2 (c), )。这些观察表明,mir - 429可以抑制血管生成和迁移HBMECs因缺血性损伤。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
图2
mir - 429 upregulation生存能力的水平下降,移民和管形成OGD-induced HBMECs。(a)的可行性HBMECs被CCK-8观察。(b)的血管生成HBMECs被管形成试验观察。(c)的迁移HBMECs被伤口愈合实验观察。 的意思 。
3.3。mir - 429直接目标3 - - - - - -UTR SNAI2的

探索mir - 429在缺血性中风的机制,Targetscan mir - 429用于目标预测,和dual-luciferase记者分析进一步用来证实绑定mir - 429及其目标的影响。结果表明,SNAI2下游mir - 429倍,和mir - 429模拟显示荧光素酶活动的显著影响hek - 293 t转染SNAI2-wt(图3(一个), )。此外,存在显示SNAI2显著下调OGD-induced HBMECs(图3 (b), )。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
SNAI2下游mir - 429的目标,和SNAI2显著调节OGD-induced HBMECs。(a)的约束力mir - 429和观察SNAI2 dual-luciferase记者分析。(b)的相对mRNA表达水平SNAI2 HBMECs接受OGD 12 h, 24小时和48小时。 的意思 。
3.4。SNAI2可以反向的影响在OGD-Induced mir - 429细胞

虽然mir - 429的规定细胞已被证实,SNAI2发挥了关键作用在缺血性中风的进展。mir - 429模拟和SNAI2表示向量cotransfected入HBMECs之前治疗与OGD和再灌注24小时观察细胞的表型变化。CCK-8试验表明,SNAI2显著逆转mir - 429在生存能力的影响,移民和管OGD-induced细胞(图的形成4)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
SNAI2可以反向的影响mir - 429的表现型HBMECs OGD和再灌注治疗。(a)的可行性HBMECs被CCK-8观察。(b)的血管生成HBMECs被管形成试验观察。(c)的迁移HBMECs被伤口愈合实验观察。 的意思 。
3.5。mir - 429促进缺血性中风的发展通过调停GSK-3的失活β/β连环蛋白通路

mir - 429的监管机制对缺血性中风的恶化进一步揭示了免疫印迹分析。结果表明,p-GSK-3的表达水平β和β连环蛋白显著下调时,细胞转染和mir - 429与细胞转染前与miR-NC痛苦OGD治疗。此外,人们发现mir - 429的抑制效应GSK-3的活动β/β连环蛋白通路可以被SNAI2拯救(图5)。

(一)
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(b)
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(c)
(c)
(d)
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(e)
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(f)
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图5
mir - 429参与GSK-3的失活β/β通过针对SNAI2连环蛋白。(一)SNAI2的相对表达水平。(b-f) SNAI2的蛋白表达水平,β连环蛋白,p-GSK-3β,GSK-3β。 的意思 。

4所示。讨论

缺血性中风是一种致命的疾病威胁高层人士的健康,和失败的血管生成HBMECs已确认的关键事件出现缺血性中风(15]。本研究证实mir - 429和缺血性中风的关系,发现mir - 429的下游目标,发现mir - 429的规定GSK-3的活动β/β连环蛋白通路。

研究的功能失调的microrna是许多疾病的主要原因之一,和明显的差异microrna的概要文件中存在集中和正常组织16,17]。在这项研究中,人们发现mir - 429在OGD-induced显著下调。一些研究表明,mir - 429可能发挥作用的肿瘤抑制抑制增殖,迁移和入侵多个肿瘤。研究表明,mir - 429非常人类甲状腺癌细胞表达下调,并增加mir - 429可以调节增殖、转移,并通过抑制细胞凋亡的肿瘤细胞的表达ZEB1 [18]。此外,一项研究也表明,mir - 429沉默可以显著提高小鼠的脑损伤和炎症和创伤性脑损伤引起的脂多糖(19]。因此,似乎mir - 429可能代表作为致病因素在这项研究中,和mir - 429可以显著增加块HBMECs管的形成和抑制细胞的生存能力和迁移能力。管形成作为一个重要的细胞保护机制应对缺血性损伤(20.,21]。Pedragosa et al。22)已经证明不正常的血管生成可能损害复苏与缺血性中风的老鼠。因此,这项研究表明,mir - 429 upregulation是一个关键事件进展的缺血性中风。在我们的研究中,人们发现mir - 429可以直接目标3 - - - - - -UTR SNAI2,锌指蛋白的表达水平SNAI2 (SNAI2)被mir - 429负调控。

哺乳动物核心河马信号组件包括Ste20家族激酶Mst1 Mst2,果蝇同源的河马。Mst激酶和WW重复支架蛋白形成一个活跃的复杂萨尔瓦多(Salv),也称为WW45,磷酸化大肿瘤抑制同族体(背阔肌)激酶。哺乳动物有两个背阔肌基因,Lats1 Lats2,果蝇同源的疣。背阔肌激酶与暴徒复杂使磷酸化Yap和小胡子,两个相关的转录辅活化因子。河马调节生长和祖基因像Sox2 Snai2, Ccdn1 Cdc20, l-Myc心肌细胞。在肝脏overexpressing Yap和河马丧失突变体,原癌基因的表达和Ccdn1调节,暗示肝脏和心脏之间共享机制(23,24]。尽管凋亡抑制剂Birc2和Birc5调节Salv CKO突变的心,细胞凋亡是不变。

缺血后处理可以增加一种蛋白激酶的磷酸化下游GSK-3等目标β,一直在考虑GSK-3的激活β/β连环蛋白通路参与脑复苏的病人遭受缺血性损伤后(25,26]。在这项研究中,GSK-3的活动β/β连环蛋白通路OGD-induced细胞显著抑制mir - 429时调节。mir - 429验证几种肿瘤细胞的血管生成的关键因素。程等人已经指出,减少mir - 429诱导LncRNA XIST是神经胶质瘤血管生成的关键原因27]。此外,本研究还发现,SNAI2充当一个中间人GSK-3的失活β/β连环蛋白,SNAI2 upregulation可以拯救HBMECs mir - 429对血管生成的影响。SNAI2是上游GSK-3的目标β/β连环蛋白,SNAI2 upregulation可以促进GSK-3的激活β/β连环蛋白调解一些肿瘤细胞入侵和迁移。一项研究已经证实,SNAI2沉默可以极其阻碍前列腺癌细胞的扩散转移和具备干细胞(28]。因此,这项研究表明GSK-3 mir - 429的抑制作用β/β连环蛋白通路,促进血管生成,通过针对SNAI2 HBMECs。然而,这项研究有一些局限性。我们只强调了mir - 429对HBMECs的表型的影响,而更直接的证据应该实现的实验在活的有机体内。此外,血管再生和功能恢复之间的关系尚未得到证实。然而,血管生成可能会提供一个合适的微环境触发轴突的产物,可能诱发神经发生。使用代理和/或细胞疗法促进血管生成和轴突结果缺血性外围可能治疗相关的治疗策略。

5。结论

本研究证实mir - 429的抑制性影响生存能力,迁移和管HBMECs的形成,揭示了下游因子和调控机理,mir - 429细胞的血管生成。总之,它表明,mir - 429可以通过针对SNAI2抑制HBMECs的血管生成。

数据可用性

所有的实验数据可以通过电子邮件访问相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

[太阳和Shenghao叮了同样的工作。