文摘

客观的。该研究旨在评估的潜在机制微rna - 139 - 5 - p在乳腺癌(BC)。方法。微rna表达状态- 139 - 5 - p和MEX3A测量中存在和免疫印迹。微的抗癌效果- 139 - 5 - p在体外是由一组测试化验。互动微rna - 139 - 5 - p和MEX3A被dual-luciferase检测验证。结果。微rna - 139 -公元前5 - p表达细胞明显低,而MEX3A明显过表达。微rna - 139 - 5 - p抑制增殖,侵入性,和迁徙能力公元前公元前细胞,增加细胞凋亡水平的细胞,而MEX3A施加BC细胞生长促进作用。Dual-luciferase记者检测证实,微rna - 139 - 5 - p必将MEX3A 3 - - - - - -UTR。结论。微rna - 139 - 5 - p抑制针对MEX3A公元前的发展。微rna - 139 - 5 - p / MEX3A可能BC治疗的目标。

1。介绍

乳腺癌(BC),它通常是诊断女性产生第二常见的癌症相关死亡(1]。在2018年,210万名妇女被诊断为公元前(2]。公元前患者的5年生存率已得到改进,但公元前转移患者的5年生存率是26%3]。由于公元前转移的异质性,很难确定治疗和评估转移风险4]。因此,专注于公元前发生和转移的分子机制和治疗可能有助于提高患者的生存率和BC为靶向治疗提供新思路。

小分子核糖核酸参与人体的生理和病理过程,如细胞凋亡、细胞分化和器官发育,从而抑制或促进人类癌症的发生5]。许多研究已经证明,各种小分子核糖核酸调节公元前的发生和发展,如微rna - 193 (4],微rna - 140 - 5 - p [6),和微- 1228 (7]。微rna - 139 - 5 - p可以调节肿瘤细胞的生长。杨et al。8)发现,微rna - 139 - 5 - p促进前列腺癌进展的调制SOX5并显著影响前列腺癌的预后。此外,Chen等人。9)报道,微rna - 139 - 5 - p明显在子宫平滑肌瘤组织中表达下调,微rna - 139 - 5 - p块子宫平滑肌瘤细胞增殖,通过退化TPD52以及诱导细胞凋亡。李等人。10)表明,微rna - 139 - 5 - p针对Notch1抑制转移和EMT在神经胶质瘤。然而,微rna - 139在公元前5 - p功能需要进一步深入调查。

MEX3家庭参与免疫反应等生理过程,新陈代谢,和癌症(11]。MEX3A是哺乳动物的新组件包含gw - 182或Dcp函数作为信使rna降解细胞网站(12]。MEX3A被确诊为癌症的发生显著相关,如膀胱癌症(13和肿瘤14]。然而,公元前MEX3A的作用研究较少。

在最近的研究中,微rna - 139 -公元前5 - p的表达及其生物学功能进行了分析。微rna - 139 - 5 - p和MEX3A交互也评估揭示微rna的影响- 139公元前5 - p的发展。我们显示一个潜在的作用微rna - 139公元前5 - p / MEX3A过程,这可能是一个理论上的支持新的治疗靶点或生物标记。

2。材料和方法

2.1。生物信息学方法

成熟的microrna表达数据信息(正常:104,肿瘤:1103)和mrna(正常:113,肿瘤:1109)的访问TCGA-BRCA癌症基因组图谱(TCGA)数据库。微rna - 139 - 5 - p的表达进行了分析的基础上下载的数据。R包“刨边机”是用来进行差异表达分析在mrna TCGA-BRCA控制和数据集与正常组 , 作为阈值获取差异表达mrna (DEmRNAs)。微rna - 139 - 5 - p目标绑定预测是由使用targetScan miRDB, mirDIP数据库和预测mrna和调节DEmRNAs筛选潜在的交叉mir - 139 - 5 - p的目标。进行了相关分析,遴选mir - 139 - 5 - p目标mRNA呈现highist效率负相关,mir - 139 - 5 - p的表达水平。生存分析的11个目标基因被GEPIA处理数据库。

2.2。细胞培养

人类正常乳腺上皮细胞系MCF-10A公元前(BNCC337734)和人类细胞系mda - mb - 231 (BNCC337893) MCF7 (BNCC337656) HCC1937 (BNCC338509)和MX-1 (BNCC100280)提供的希伯来文名字文化集合(中国,北京)。MCF-10A、HCC1937 MX-1 RPMI -生长在90% 胎牛血清(的边后卫;热科学HyClone,北京)。mda - mb - 231和MCF7在DMEM培养(美国热)和10%的边后卫。

2.3。转染的细胞

微rna - 139 - 5 - p模仿,microrna - 139 - 5 - p抑制剂,oe-MEX3A,和相应的负GenePharma公司提供的控制(上海,中国公关)。Nontransfected控制提出了确定转染效率(图S1)。1.5μL / 2000 mL Lipofectamine转染试剂(美国ThermoFisher)是利用50纳米基因片段或1μ公元前g质粒转染到细胞。实验进行了细胞培养24小时后,和转染持续了48 h。

2.4。中存在

后总RNA分离试剂盒试剂(美国ThemorFisher),这是使用NanoDrop量化(美国ThermoFisher)。信使rna逆转录和microRNA是由使用上标三世第一链合成系统工具包(美国表达载体)和NCode™很™微互补脱氧核糖核酸合成工具(技术)。存在分析mrna和小分子核糖核酸是由使用顺华兴™EvaGreenH Supermix (Bio-Rad)和绿色ER表达SYBR microRNA存在设备(技术),分别。U6 GAPDH和作为内部控制基因。以下引物序列:微rna - 139 - 5 - p转发:5 - - - - - -TCTACAGTGCACGTGTC-3 ,反向:5 - - - - - -GAATACCTCGGACCCTGC-3 ;U6转发:5 - - - - - -CTCGCTTCGGCAGCACATA-3 ,反向:5 - - - - - -AACGATTCACGAATTTGCGT-3 ;MEX3A转发:5 - - - - - -CGGAGTGCACTCTGGCTTTGAG-3 ,反向:5 - - - - - -CAGAGGAGAAGAGCACGGAGGT-3 ;GAPDH转发:5 - - - - - -TGACTTCAACAGCGACACCCA-3 ;反向:5 - - - - - -CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3 。微rna或mRNA相对表达式分析了2- - - - - -ΔΔCt方法。

2.5。西方墨点法

里帕缓冲溶液(Solarbio,北京)被用来分离总蛋白质在每组。提取样品的浓度是由BCA分析工具包(Abcam,剑桥,英国)。10% sds - page分离,样本转移到PVDF膜(美国表达载体),其次是孵化主要抗体。然后,与二次抗体治疗的蛋白质(山羊anti-rabbit免疫球蛋白(1:2000年,ab205718 Abcam,英国))1 h。蛋白质含量被BeyoECL化学发光检测设备(Beyotime生物技术研究所)。在这项研究中,主要的抗生素是兔子anti-MEX3A(1: 500年,ab79046 Abcam,英国)和兔anti-GAPDH(1: 2500年,ab9485 Abcam,英国)。

2.6。CCK-8化验

转染细胞接种到96孔板( 细胞/)。通过使用CCK-8工具包,细胞增殖后评估(Dojindo、熊本、日本)细胞培养。光密度在450纳米细胞增殖能力。

2.7。细胞迁移和入侵检测

细胞被放置在一个6-well板( 细胞/)。当细胞融合达到了100%,10μL吸管被用来创建一个划痕区域中部地区的单层细胞。然后,细胞被置于一个中含有1%的边后卫。在30 0 h和h,细胞迁移的图像拍摄和分析。

细胞转染后,mda - mb - 231和MCF7细胞在无血清培养基被停职。接下来,悬浮细胞被播种的上盘室(美国纽约康宁合并,康宁)。底部边中注射10%的边后卫。细胞培养后,入侵细胞用4%甲醛溶液和0.25%结晶紫。之后,细胞被洗两次PBS和风干。入侵细胞的数量是由使用一个倒置显微镜观察(奥林巴斯公司(日本东京)。

2.8。细胞凋亡检测

转染细胞准备,通过使用双染色PI-Annexin-V凋亡检测设备(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。细胞凋亡状态被流式细胞术分析(美国BD生物科学,圣何塞,CA)。

2.9。Dual-Luciferase报告基因检测

野生型(wt)和变异(傻瓜)MEX3A-3序列 UTR subcloned进PGL3-M (WI Promega,麦迪逊,美国)。微rna - 139 - 5 - p模仿或数控模拟cotransfected与PGL3-3 mda - mb - 231细胞 UTR-wt或PGL3-MEX3A-3 UTR-mut。荧光素酶活性量化使用dual-luciferase报告基因系统(美国Promega)。

2.10。数据分析

SPSS 22.0(美国纽约阿蒙克的IBM公司)是用于数据分析。数据的形式 。 - - - - - -测试了两群比较。考虑统计上的显著差异 值小于0.05。

3所示。结果

3.1。的差别明显对这些微rna - 139 -公元前5 - p

建议通过大量研究微rna - 139肿瘤恶化[5 - p是至关重要的15,16]。因此,我们试图说明功能的微rna - 139 -公元前5 - p。TCGA-BRCA数据表明,microrna的表达水平——公元前139 - 5 - p组织明显减少(图1(一))。随后表现出相同的结果(图中存在的结果1 (b))。mda - mb - 231和用于细胞MCF7细胞功能化验后。

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图1
重要的microrna在公元前差别p - 139 - 5 -对这些:(a)箱线图的微rna - 139 - 5 - p的表达在正常(绿色)和肿瘤组织(红色);(b)中存在被用来检测微rna - 139 - 5 - p的表达在人类正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和BC细胞系mda - mb - 231, MCF7 HCC1937, MX-1。 ; 。
3.2。微rna - 139 - 5 - p Upregulation抑制公元前的迁移和增殖,加速细胞凋亡细胞

结果显示的存在,微rna转染- 139 - 5 - p模拟微rna的表达水平明显升高5 - p - 139 -这是明显减少了微- 139 - 5 - p抑制剂(数字2(一个)和2 (f)),这表明转染效率在每个治疗组很好足够的后续实验。作为显示在图2 (b)和图2 (g),microrna - 139 -公元前5 - p过度阻止细胞增殖能力;相反,击倒的微rna - 139 - 5 - p增强它。然后,我们发现通过伤口愈合实验微rna - 139 - 5 - p抑制细胞迁移(数据2 (c)和2 (h))。同样,Transwell结果显示,微rna - 139 - 5 - p有抑制影响公元前入侵细胞(数字2 (d)和2(我))。最后,为了确定细胞凋亡可能是影响微rna - 139 - 5 - p,用流式细胞术测定细胞凋亡的评估。结果表明,公元前细胞的凋亡率增加微rna转染后- 139 - 5 - p模仿和减少微rna - 139 - 5 - p抑制剂治疗后(数字2 (e)和2 (j))。它可以得出一个结论,微rna - 139 - 5 - p过度压抑BC细胞和促进细胞凋亡的进展。

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图2
微rna - 139 - 5 - p BC-related影响细胞行为:(a、f)微rna - 139 -公元前5 - p转染效率检查中存在;(b, g)增殖状态评估使用CCK-8试验;(c、h)迁移水平测试由伤口愈合试验(40 x);(d、i)入侵能力测试由Transwell化验(100 x);(e, j)凋亡水平是评估通过流式细胞术。 。
3.3。MEX3A是微的目标——在公元前139 - 5 - p

刨边机微分分析显示,1405个基因调节和757个表达下调(图3(一个))。然后,目标的微rna - 139 - 5 - p基于多个公共数据库进行了分析。与1405年预测目标分割的调节DEmRNAs获得11个目标基因靶向结合位点的微rna - 139 - 5 - p(图3 (b))。生存分析显示,目标基因对生存时间的影响不显著(图S2)。MEX3A提出的相关分析显示出最高的皮尔森相关系数与微rna - 139 - 5 - p和显著负相关(图3 (c))。此外,MEX3A明显被指出是在公元前组织(图3 (d))。在细胞水平上,结果MEX3A公元前也显著调节细胞(数字3 (e)和3 (f))。

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图3
MEX3A目标是由微rna -公元前139 - 5 - p: (a)火山DEmRNAs地图,红色和绿色圆点表示,下调DEmRNAs,分别;(b)维恩图预测目标的交叉微rna - 139 - 5 - p和调节DEmRNAs;(c)皮尔森相关分析的微rna - 139 - 5 - p及其预测目标;(d)箱线图MEX3A表达在正常组(绿色)和肿瘤组(红色);(e)中存在被用来测试mRNA的表达在MCF-10A MEX3A, mda - mb - 231, MCF7, HCC1937, MX-1细胞;(f)西方墨点法是用来测量MEX3A蛋白表达在每个细胞株;(g)结合位点的微rna - 139 - 5 - p和MEX3A;(h) dual-luciferase检测是用来测试是否微rna - 139 - 5 - p MEX3A mRNA结合;(i, j) MEX3A mRNA和蛋白表达水平。 ; 。

结合位点的微rna - 139 - 5 - p MEX3A信使rna被TargetScan预测数据库(图3 (g))。随后,dual-luciferase化验检测观察到荧光素酶活性的野生型组可以显著降低过度的微rna - 139 - 5 - p,虽然没有影响荧光素酶活性可以观察突变组;因此,我们证实MEX3A可能是目标的微rna - 139 - 5 - p(图3 (h))。接下来,我们发现微rna - 139的规定5 - p MEX3A表达式,并指出微rna - 139 - 5 - p的upregulation克制MEX3A mRNA和蛋白的表达水平的举止(数字3(我)和3 (j))。

3.4。微rna - 139 -公元前5 - p调节过程的细胞通过MEX3A

调查是否MEX3A微中发挥了至关重要的作用——公元前139 - 5 - p压制,我们研究了mda - mb - 231和MCF7细胞系转染后。存在结果展示,微rna - 139 - 5 - p的upregulation突出MEX3A的mRNA水平降低,而MEX3A的mRNA水平恢复后移植MEX3A(图4(一))。西方墨点法也显示同样的趋势在MEX3A的蛋白表达中存在的结果(图4 (b))。然后,CCK-8试验进行了在每个转染组细胞,并指出微rna - 139 - 5 - p的upregulation抑制细胞增殖,这是扭转部分的upregulation MEX3A(图4 (c))。细胞迁移和入侵检测被发现移植微rna - 139 -公元前5 - p可以抑制细胞生长。然而,当mda - mb - 231和MCF7细胞cotransfected微rna - 139 - 5 - p模仿和oe-MEX3A迁徙和侵入性能力与细胞相比明显升高仅处理微rna - 139 - 5 - p模拟(数字4 (d)和4 (e))。最后,微rna - 139 -公元前5 - p过度凋亡水平升高的细胞。然而,公元前的细胞凋亡水平细胞过表达微rna - 139 - 5 - p和MEX3A显著降低(图4 (f))。这些统计数据表明,MEX3A微rna产生抑制效应的一个重要的角色——公元前139 - 5 - p进展。

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图4
微rna - 139 -公元前5 - p / MEX3A调节的发展细胞:(a, b)公元前MEX3A mRNA和蛋白表达在细胞治疗组;(c)细胞增殖状态由CCK-8测试;公元前(d)迁移水平的细胞治疗组(40 x)由伤口愈合试验;公元前(e)入侵细胞治疗组分析Transwell化验(100 x);公元前(f)细胞凋亡的细胞通过流式细胞术治疗组评估。 。

4所示。讨论

多项研究表明,失调与肿瘤生长相关的小分子核糖核酸在临床上和化疗抵抗,导致高发病率和死亡率的病人(17- - - - - -19]。先前的文献发现,微rna - 139 - 5 - p是突出在许多癌症中表达的低20.,21]。同样,我们指出,微rna - 139 - 5 - p在公元前显著下调。通过功能性实验,调节微rna - 139 - 5 - p进行抑制的功能在公元前增殖和迁移和促进细胞凋亡的细胞,这是一样的结果Zhang et al。22]。微rna - 139 - 5 - p可以调节其他癌症的发展。例如,微rna - 139 - 5 - p目标NOTCH1抑制大肠癌细胞增殖和转移,促进细胞凋亡(23]。结合上述研究结果,我们认为,微rna - 139 - 5 - p发挥抑癌功能在公元前。

MEX3蛋白质是自我更新和分化的关键,也是参与肿瘤细胞的发展。例如,MEX3A在胃癌组织中表达显著更高时相比,在邻近的正常组织,和淘汰赛hMEX-3A减少胃癌细胞的集落形成能力以及癌细胞的生存有很大的影响(24]。在结肠癌,MEX3A参与调节结直肠上皮内稳态,损伤反应,和恶性转化和显著调节25]。在这项研究中,我们主要探讨其监管公元前影响细胞功能。结果呈现,MEX3A是在公元前和显著负相关微rna - 139 - 5 - p。我们还指出,过度的微rna - 139 - 5 - p克制的表达MEX3A直接通过绑定到3 UTR MEX3A。此外,功能分析表明,微rna - 139 - 5 - p和MEX3A过度减毒的抑制作用overexpressing微rna - 139 -公元前5 - p独自细胞生长。在上述基础上,我们发现抑制微rna - 139 -公元前5 - p细胞部分通过针对MEX3A。

我们的研究证明了以上的差别显著的对这些微rna - 139公元前5 - p,和异常表达的微rna - 139 -公元前5 - p抑制恶性行为的细胞通过直接瞄准MEX3A。结合我们当前的结果和之前的研究结果,我们提出了微rna - 139 -公元前5 - p控制开发作为一个肿瘤抑制。这项研究使我们能够进一步了解微rna - 139 - 5 - p的机制在公元前公元前可以开发新的方法来治疗。虽然在本文实验结果足以证明监管关系microrna - 139 - 5 - p和MEX3A,仍有一些弱点。为例,由于条件有限,没有临床研究的影响进行了进一步探索microRNA在临床实践中,患者的预后和临床组织利用之间的关系,进一步验证微rna - 139 - 5 - p和MEX3A。

数据可用性

数据通讯作者的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

补充材料

图S1:微rna转染效率- 139 - 5 - p抑制剂和模仿。(一)转染效率比较中存在;(b) CCK-8试验比较不同治疗组之间细胞生存能力变化。图S2: GEPIA数据库分析目标基因的操作系统。(补充材料)