文摘
客观的。上皮细胞的异常表达转换序列2 (ECT2)通常被认为是经济增长的驱动因素和肿瘤的侵犯。本研究进行调查的监管效果miR-30a-5p和ECT2肺腺癌(LUAD),它提供了一种LUAD的有效临床治疗的基础。方法。成熟的microrna、mrna的表达数据和临床数据的LUAD下载的癌症基因组图谱(TCGA)。ECT2 mRNA的表达水平和miR-30a-5p癌症细胞系中检测到存在。免疫印迹进行测试ECT2蛋白的表达。针对miR-30a-5p和ECT2之间的关系被dual-luciferase试验验证。CCK-8方法和Transwell测试的可行性进行了分析,迁徙,入侵能力的细胞。结果。ECT2表达调节与LUAD LUAD并显著相关的临床分期和病理T阶段,和上游调节基因的表达miR-30a-5p表达下调。在LUAD miR-30a-5p ECT2目标。Downregulation ECT2可能抑制可行性、移民、和入侵LUAD细胞,可以逆转的同时抑制miR-30a-5p的表达。结论。我们的研究结果表明,miR-30a-5p压抑的恶性进展LUAD通过下调ECT2。miR-30a-5p LUAD患者和ECT2可能有效的目标。
1。介绍
肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因,和肺腺癌(LUAD)占据约50%的肺癌病例,有逐年增加的趋势(1]。LUAD是一种非小细胞肺癌(NSCLC),其中大部分起源于支气管粘膜上皮,和一些来自大支气管的粘液腺。一般来说,疾病进展缓慢,初期症状不明显2]。尽管最近LUAD的诊断和治疗策略的发展,在患者治疗失败仍普遍先进LUAD [3]。为了解决这个问题,许多研究人员进行了深入的研究和调查。早期研究的遗传学和表观遗传学LUAD发现上皮细胞转化序列2腺癌(ECT2)差异表达原位(AIS)和早期浸润性癌(4),这表明ECT2 LUAD治疗可能是一个新的入口。
ECT2是鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)ρGTPase蛋白质的家庭。ECT2蛋白质包括c端GEF催化GEF活动域,一个n端结构域调节GEF活动和本地化,和一个中央年代域有两个核本地化所需信号ECT2核本地化(5]。在正常细胞中,ECT2坐落在间期细胞核核膜破裂后和分布式进入细胞质在前中期,然后,细胞分裂是刺激通过激活GTPase RhoA [6]。研究表明,ECT2起着促进的作用在乳腺癌等癌症的恶性进展(7),胃癌8),和胰腺癌9]。在肺癌中,许多研究发现,ECT2与肺癌进展相关。例如,史等。10)公司分析发现ECT2在肺癌的诊断和预后价值。白等。11)收集的数据从临床病人,发现ECT2明显NSCLC中高度表达,并与患者临床病理特征和预后。
虽然已经有大量的研究在高表达的促进作用ECT2 LUAD的恶性进展,LUAD ECT2的具体发病机理仍不清楚。在这项研究中,我们开始通过分析ECT2,发现其上游调控基因miR-30a-5p通过生物信息学分析。ECT2的功能和miR-30a-5p LUAD细胞和潜在的监管关系进行了研究在体外实验。最后,我们体现miR-30a-5p可以调节ECT2的表达抑制LUAD进展,它提供了一种新的治疗目标治疗LUAD。
2。材料和方法
2.1。生物信息学分析
的成熟microrna LUAD(正常:46,肿瘤:521)的mRNA表达数据(正常:59,肿瘤:535)和临床数据从TCGA(下载https://portal.gdc.cancer.gov/)。microrna的微分分析和mrna在正常组织和肿瘤组织是由磨边机包( , )得到差异表达microrna和mrna。目标mRNA确认通过文学和目标mRNA和之间的关系的临床阶段LUAD被TCGA-LUAD数据集的数据进一步分析。母星(http://starbase.sysu.edu.cn/)是用来预测目标的上游调控基因的信使rna,和有针对性的结合位点的差异表达microrna在目标mRNA。最后,相关分析来确定最终的执行监管microrna的上游。
2.2。细胞培养
人类支气管上皮细胞系BEAS-2B (3153 c0001000000175)和人类LUAD细胞系Calu-3 (3111 c0001ccc000032), SPC-A1 (3111 c0001ccc000387),和NCI-H2009 (3111 c0001ccc000383)都购买细胞株的国家基础设施资源(NICR,中国)。所有的细胞系培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)(美国Gibco)含10%胎牛血清(的边后卫)(美国Gibco),在恒温孵化器孵化37°C和5%的公司2以备将来使用。
2.3。细胞转染
miR-30a-5p抑制剂(miR-inhibitor)、NC-inhibitor miR-30a-5p模仿(miR-mimic) NC-mimic, si-ECT2, si-NC从GenePharma购买(上海,中国)转染入实验细胞系使用Lipofectamine 2000(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。细胞培养在一个完整的媒介公司5%2和37°C,以供将来使用。所有细胞都应该培养在中在转染前至少24小时。细胞转染效率检测到存在细胞转染后36 h。
2.4。RNA提取和存在
细胞总RNA提取试剂盒的试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。根据制造商的指示,microrna是相对地转录成互补脱氧核糖核酸的miRcute microrna的合成第一链cDNA工具包(Tiangen,中国)检测microrna的表达。同样,为了检测mRNA的表达,上标三世第一链合成系统工具包(表达载体,卡尔斯巴德,CA)被用来反对地抄写mRNA的互补。最后,SYBR®绿色实时PCR反应混合液(豆类生物有限公司、志贺、日本)被用来测试microrna的表达和信使rna的存在。U6,β肌动蛋白作为内部参考microrna的信使rna,分别。相对表达水平的计算是基于2−ΔΔCt方法,实验重复了三次。实验中演示了使用的引物序列表1。
2.5。CCK-8化验
CCK-8方法用于检测细胞生存能力。转染细胞接种到96孔板的密度 细胞每口井;然后,10% CCK-8 (Beyotime生物技术,中国上海)添加到井中。细胞在450 nm的吸光度测定,分光光度计在0 h, 24小时、48小时、72 h,分别和96 h。
2.6。Transwell化验
在细胞迁移试验,细胞在无血清培养基resuspended。这些细胞被添加到Transwell上院 细胞/毫升,包含10%的边后卫的完全培养基添加到众议院。在37°C孵化后24 h,细胞已在参议院被移除和结晶紫染色了,和多余的结晶紫是丢弃。干燥后,膜室的底部放置在显微镜下观察和计数。Transwell入侵检测进行了使用一个上院涂层与基底膜基质矩阵,和剩下的程序是一样的细胞迁移试验。
2.7。Dual-Luciferase记者分析
合成ECT2 3 - - - - - -UTR-wild类型(WT)和ECT2 3 - - - - - -UTR-mutant(傻瓜)克隆到荧光素酶载体质粒配置完成。细胞培养在48-well盘子,ECT2 3 - - - - - -UTR-WT或ECT2 3 - - - - - -UTR-MUT质粒载体是cotransfected miR-mimic或NC-mimic使用Lipofectamine 3000试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)进入细胞。Renilla荧光素酶的表达载体pRL-TK(豆类、大连、中国)被用来作为内部参考。荧光素酶检测试剂(美国WI Promega,菲奇堡)是用于检测荧光素酶活性在转染后48 h。
2.8。免疫印迹分析
radioimmunoprecipitation试验(里帕)缓冲0.1% phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF),和细胞放在冰溶解了20分钟。离心后(12000克,4°C, 10分钟),上层清液被转移到一个新的EP管获得细胞的总蛋白产品。蛋白质浓度的样品是由BCA法,根据不同的蛋白质浓度和蛋白质进行。蛋白质是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),立即转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜处理甲醇。4°C条件下,膜是一夜之间添加5%脱脂奶粉和孵化。随后,主anti-ECT2抗体(英国Abcam)和anti-glyceraldehyde 3 -磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(英国Abcam)被添加到膜在室温下孵化2 h。然后,细胞膜是孵化为30分钟室温条件与二级抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白(英国Abcam)。GAPDH作为内部参考。光光度计(美国通用电气)是用于扫描和开发;然后,照片拍摄。
2.9。数据统计
所有数据被Prism 8.0统计软件处理。测量数据的形式表示 。对比两组被检测到 - - - - - -测试和对比多个组的评估是单向方差分析(方差分析)。 表明该数据具有统计上的显著差异。
3所示。结果
3.1。ECT2 LUAD调节,LUAD分期有关
为了探索在LUAD ECT2的表达,生物信息学分析获得3611年首次演出差异表达mrna(图1(一)),ECT2 LUAD组织(图中高度表达1 (b))。生存分析显示,ECT2的高表达患者的生存时间明显短于患者的低表达ECT2(图1 (c))。随后,通过TCGA-LUAD数据集数据的进一步分析,我们发现ECT2与LUAD显著相关的临床分期和病理T阶段(数字1 (d)和1 (e))。然后,执行中存在检测ECT2表达在人类支气管上皮细胞系BEAS-2B和LUAD细胞株(Calu-3, NCI-H2009, SPC-A1)。结果表明,与人类支气管上皮细胞相比,ECT2调节LUAD细胞(图1(f))。在LUAD细胞,ECT2提出最大的表达式不同细胞系NCI-H2009;因此,我们选择细胞系NCI-H2009进行进一步的实验。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。表达下调ECT2抑制的可行性、迁移和入侵LUAD细胞
为了研究LUAD ECT2表情的影响,我们首先进行了存在和免疫印迹试验来检测mRNA表达和蛋白质的表达ECT2 NCI-H2009细胞与si-ECT2转染后,结果显示,ECT2的信使rna和蛋白质的表达水平降低(数字2(一个)和2 (b))。随后,CCK-8 Transwell迁移和入侵检测进行测试的影响抑制ECT2表情细胞生存能力,迁移和入侵的能力。结果表明,低表达ECT2抑制(图的可行性2 (c))和迁移和入侵的能力NCI-H2009细胞(图2 (d))。因此,我们相信ECT2施加LUAD细胞的致癌作用。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。miR-30a-5p目标和调节ECT2
为了进一步探索ECT2 LUAD细胞上的分子调控机制,我们发掘上游监管ECT2 microrna。首先,磨边机微分分析。共有186个差异表达microrna是获得,包括147调节基因和39个表达下调基因(图3(一个))。ECT2的上游调控基因预测数据库使用母星。预测的基因与前面得到的差异表达下调microrna,和三个差异表达microrna与有针对性的结合位点ECT2获得(图3 (b))。皮尔森ECT2之间进行了相关分析,这三种microrna。发现miR-30a-5p ECT2呈负相关,特别是在LUAD组织中表达下调(数字3 (c)- - - - - -3 (e))。高miR-30a-5p表达与患者的生存时间长(图3 (f))。为了明确目标绑定ECT2和miR-30a-5p之间的关系,我们首先使用母星数据库来预测目标ECT2和miR-30a-5p(图的结合位点3 (g))。Dual-luciferase化验。结果表明,overexpressing miR-30a-5p可以抑制细胞的荧光素酶活性与ECT2 3 - - - - - -UTR-WT质粒序列,但没有显著的改变与细胞ECT2 3 - - - - - -UTR-MUT序列(图3 (h)),表明目标绑定miR-30a-5p和ECT2之间的关系。随后,存在和免疫印迹进行评估miR-30a-5p ECT2 mRNA和蛋白水平。结果表明,miR-mimic成功调节miR-30a-5p水平和miR-inhibitor成功地减少了miR-30a-5p水平。表达miR-30a-5p抑制时,信使rna和蛋白质的表达的ECT2会相应增加;miR-30a-5p过表达时,信使rna和蛋白质的表达的ECT2相应地下降(数字3(我)和3 (j))。上述结果表明,ECT2 miR-30a-5p的直接目标,和miR-30a-5p目标和负调节ECT2。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
3.4。miR-30a-5p抑制的可行性、迁移和入侵LUAD通过调节ECT2
救援实验被用来进一步调查的影响miR-30a-5p / ECT2轴LUAD细胞。首先,信使rna和蛋白质的表达水平ECT2 miR-30a-5p抑制时仅当miR-30a-5p和ECT2抑制同时检测到存在和免疫印迹,分别。结果表明,当表达miR-30a-5p抑制,信使rna和蛋白质的表达水平ECT2显著增加;当表达水平miR-30a-5p和ECT2同时抑制,mRNA和蛋白表达水平明显低于集团抑制miR-30a-5p(图4(一))。CCK-8和Transwell试验的结果表明,与NC组相比,可行性,迁徙,NCI-H2009细胞集团和入侵能力抑制miR-30a-5p单独增加;与单独组抑制miR-30a-5p相比,当miR-30a-5p ECT2同时表达水平被抑制,可行性,迁徙,NCI-H2009细胞的入侵能力明显降低(图4 (b)和4 (c))。因此,我们相信miR-30a-5p抑制的可行性,迁徙,NCI-H2009细胞的入侵能力目标和规范ECT2表达式。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
ECT2,蛋白质与细胞生存能力,被认为是有促进作用的肺癌和其他癌症。徐et al。12)报道,mir - 223介导细胞增殖的骨肉瘤细胞通过针对ECT2 p21的信号通路。此外,Hirata et al。13ECT2表达差别)透露,对这些能有效地抑制肺癌细胞的生长,他们发现ECT2也扮演监管角色在细胞周期进程和细胞分裂。周et al。14月初]还发现的异常表达ECT2 LUAD细胞,这被认为是有关癌症的恶性发展。这些发现表明,ECT2 LUAD中高度表达,可能在促进LUAD的发展中发挥作用。在这项研究中,通过生物信息学分析显示,在LUAD ECT2明显调节,明显与LUAD临床阶段和病理T阶段。在体外ECT2的差别研究表明,对这些基因的表达可以显著抑制的可行性,迁徙,LUAD细胞和侵入性能力,这与先前的研究的趋势是相一致的。
细胞内蛋白编码基因的表达,如ECT2主要是由非编码基因,和小分子核糖核酸(microrna)是关键调控分子之一。microrna是内源性小非编码单链rna的组件之一RNA-induced沉默复杂(RISC)。他们认识到3 - - - - - -翻译区(3 - - - - - -UTR)目标mRNA通过互补的碱基配对和指导RISC降解目标信使rna或抑制目标mRNA的翻译根据不同程度的互补(15]。研究显示,ECT2受microrna在各种癌症的发展:mir - 194抑制癌细胞扩散通过定位和规范ECT2在胆管癌16];mir - 490 - 5 - p抑制肝癌的转移表达下调E2F转录因子2 (E2F2)和ECT2 [17];mir - 223 - 3 - p抑制增殖,入侵,乳腺癌细胞迁移目标ECT2 [18]。因此,在这项研究中,为了进一步探索的具体分子机制的功能在LUAD ECT2,我们试图挖掘ECT2的上游调控microrna。我们筛选的生物信息学数据获取miR-30a-5p异常低表达LUAD组织和有针对性的结合位点ECT2 mRNA。miR-30a-5p已经体现在各种癌症肿瘤抑制效果。赵et al。19)发现miR-30a-5p在前列腺癌中表达下调,且可以通过针对PCLUADF抑制细胞增殖。关丽珍et al。20.]发现miR-30a-5p能抑制SRY-box转录因子4 (SOX4)抑制增殖,凋亡,NSCLC的迁移。目前还没有相关研究miR-30a-5p对目标和规范ECT2癌症的发生。在这项研究中,针对miR-30a-5p和ECT2之间的关系首先澄清了dual-luciferase记者分析。其次,当miR-30a-5p的表达和ECT2同时被抑制在体外的促进作用,我们发现抑制miR-30a-5p独自LUAD细胞生存能力明显恢复。同样地,我们发现同样的情况在细胞迁移和入侵实验;,同时抑制miR-30a-5p的表达式和ECT2恢复的影响抑制miR-30a-5p独自LUAD细胞的迁徙和入侵的能力。因此,我们相信miR-30a-5p可以抑制细胞生存能力,迁徙,LUAD的入侵能力目标和抑制ECT2的表达。
总之,这项研究表明,ECT2的表达在LUAD显著调节,而其上游调控miR-30a-5p表达下调。此外,miR-30a-5p可以目标和抑制ECT2抑制可行性,LUAD细胞的迁移和入侵。因此,miR-30a-5p和LUAD ECT2可能潜在的治疗靶点。与此同时,也有一些局限性在这项研究中,如不验证miR-30a-5p和ECT2临床样本的表达,而不是确认的影响miR-30a-5p LUAD的恶性发展在活的有机体内环境。因此,仍然需要进一步的研究。
数据可用性
数据和材料在当前的研究中可从相应的作者以合理的要求。
同意
同意不适用。
的利益冲突
作者没有利益冲突的状态。
作者的贡献
作者参与本研究的贡献如下:Sangsang陈:草稿,可视化,并研究设计;Xuqing朱:数据分析和数据采集;京郑:数据分析和文献研究;婷婷徐:数据分析和文献研究;沉积徐:编辑和可视化;和陈冯:最终批准。