miR-18a-5p促进恶性进展头颈部鳞状细胞癌的细胞通过调节SORBS2

文摘

本研究试图探讨可能的分子机制和作用的miR-18a-5p头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。微分microrna TCGA及其可能的目标是通过分析数据库。测试进行中存在,miR-18a-5p是增加,SORBS2评估HNSCC细胞中表达下调。CCK-8 Transwell,流式细胞术分析透露,miR-18a-5p促进HNSCC细胞增殖,迁移和入侵和抑制细胞凋亡。由dual-luciferase报告基因分析,验证,miR-18a-5p SORBS2结合位点。救援的实验显示,强制表达SORBS2恢复的影响miR-18a-5p HNSCC细胞过度。总的来说,我们的研究初步确定的促销效果miR-18a-5p / SORBS2轴HNSCC细胞的恶性表型。我们的发现可能对HNSCC治疗提供临床参考。

1。介绍

据统计GLOBOCAN,头部和颈部癌症的比例——(HNC)相关癌症相关的死亡率远远高于其发病率在2020年(1]。大多数的肿瘤在头部和颈部区域是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC),占了近90%。HNSCC来源于上皮细胞在上呼吸道的粘膜和食管(口腔、口咽、喉及下咽部)(2]。虽然主要激进疗法和手术,同步放化疗,或单独放疗,仍与头颈部鳞状细胞癌患者患有局部复发和肿瘤转移。患者不能接受激进的治疗,化疗本身并不是足够有效(3]。因此,探索新颖和有效的治疗方法是重视减少HNSCC的复发率。

异常microrna的表达谱的变化是无处不在的现象在不同的肿瘤。研究人员分析了microrna的表达谱在乳腺癌组织中,然后发现121个差异表达microrna (DE-miRNAs)利用微阵列方法[4]。此外,异常的microrna的表达谱也存在于各种肿瘤组织如肺腺癌,肝癌,口腔鳞状细胞癌和大肠癌。越来越多的研究在HNSCC microrna的影响。例如,mir - 150 - 5 - p和mir - 150 - 3 - p抑制入侵通过绑定在HNSCC SPOCK1癌细胞。此外,overexpressing mir - 642 b - 3 - p可以显著降低HNSCC细胞的迁徙和侵入性属性和移植细胞凋亡的能力5]。作为一个microrna的家族的重要成员,miR-18a-5p加强辐射敏感度降低肺癌干细胞的ATM和HIF-1的表达式α近年来(6]。基于增加miR-18a-5p表达在肾细胞癌(RCC)组织和细胞系,进一步的研究发现,增加miR-18a-5p积极调节RCC细胞的恶性表型。miR-18a-5p中和这种差别不过,对这些效应,表明miR-18a-5p作为癌基因和预后生物标志物在碾压混凝土7]。miR-18a-5p直接目标IRF2促进骨肉瘤的入侵和迁移(8]。也目标SPEBP1形成抑制复杂蜗牛和HDAC1/2to调节epithelial-mesenchymal过渡(EMT)乳腺癌[9]。然而,在HNSCC学习很差。

SORBS2可以与肌动蛋白和细胞骨架蛋白(10]。在现有的研究中,SORBS2作为抑制因子在癌症,如抑制卵巢癌细胞的入侵(11)和扩散、入侵和肝癌细胞的迁移在活的有机体内和在体外(12]。到目前为止,没有研究的影响SORBS2 HNSCC。

这项研究显示,在HNSCC miR-18a-5p水平显著调节分析概要文件从癌症基因组图谱(TCGA)数据库。此外,我们预测下游靶基因miR-18a-5p和SORBS2揭示绑定。接下来,我们研究HNSCC miR-18a-5p / SORBS2的调节机制,它提供了新的基础,阐明HNSCC的迁移和入侵的分子机制。与此同时,我们提供新靶点治疗HNSCC之间的紧密联系,进一步揭示miR-18a-5p HNSCC和恶性发展。

2。材料和方法

2.1。生物信息学方法

成熟microrna的表达数据和总RNA序列数据HNSCC TCGA获得(https://portal.gdc.cancer.gov/)数据库。筛选后的数据,我们得到518癌症组织样本和44个microrna的正常组织样本数据。我们还获得495年癌症组织样本和44正常组织总RNA样本测序数据。之后,miR-18a-5p水平识别和DE-mRNAs被确定通过R包“刨边机”( , )。microrna测定后,可能microrna的目标被确定通过TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/),mirDIP (http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/),miRDB (http://mirdb.org/),母星(http://starbase.sysu.edu.cn/)数据库,并与DE-mRNAs重叠。最后,microrna与mrna之间的相关性进行了分析和miRNA-mRNA监管对测定。

2.2。细胞培养

不朽的人类角质细胞HaCaT从细胞资源中心访问,基础医学研究所,中国医学科学院。FaDu (BNCC316798) SCC-9 (BNCC250260) SCC-15 (BNCC275715)和SCC-25 (BNCC315876)是所有人类HNSCC细胞系,并买了从希伯来文名字文化集合(BNCC)。他们保持在10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)和氢化可的松(400 ng / mL)。在MEM-EBSS HaCaT细胞孵化15%的边后卫。FaDu细胞保持在鹰的MEM(30 - 2003)(美国类型文化集合(写明ATCC))与10%的边后卫。文化条件是孵化器有限公司为5%₂在37°C。注入学位后的细胞达到80%,他们用于亚文化或化验。

2.3。细胞转染

miR-18a-5p-mimic (miR-mimic)、消极控制NC-mimic pcDNA3.1-SORBS2 (oe-SORBS2)和pcDNA空质粒(oe-NC)从GenePharma购买(上海,中国)。作为厂家的指导下指令,miR-18a-5p-mimic,暂时NC-mimic,质粒转染到SCC-15细胞系利用Lipofectamine 1800(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。此后,细胞维持2天在媒介公司为5%₂-95%的空气在37°C的研究。

2.4。存在分析

从HNSCC细胞总RNA分离试剂盒设备(美国纽约生活技术)在遵守指令。MiScript IIRT工具包(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)和PrimeScript RT大师混合(豆类,大连,中国)应用于相对地抄写microrna和mRNA cDNA、分别。MiScript SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)和SYBR®预混料交货Taq™II(豆类生物有限公司、志贺、日本)分别用于检测microrna和mRNA水平。应用生物系统公司®7500实时PCR系统(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)来执行中存在试验。GAPDH和U6,分别担任SORBS2和miR-18a-5p引用。相对表达比较差的2^{- - - - - -ΔΔCt}价值。引物序列表中列出1。

2.5。免疫印迹分析

免疫印迹是一个试验,测试的相对表达蛋白质通过三个方法:sds - page、免疫印迹、酶免疫分析法。这里有详细的流程。首先,细胞细胞溶解蛋白质样品做准备。蛋白质提取与10% sds - page分离,然后被转移到PVDF膜的蛋白质。之后,孕育了膜在4°C主要抗体在一夜之间:兔子anti-SORBS2 (ABIN5553826 1: 100年,抗体,我们)和兔anti-GAPDH(1: 10000年,ab181602 Abcam,剑桥,英国),其次是2 h与二次孵化抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白g h和l (ab6721 Abcam,剑桥,英国)。最后,与GAPDH内部参考,ECL工具包(美国通用电气医疗集团,芝加哥)是用来测试蛋白质的表达。

2.6。CCK-8化验

Posttransfected HNSCC细胞被镀成一个96孔板( 细胞/)。每个添加CCK-8解决方案(10μ在天信用证)1、2、3和4。样本保持在37°C 2 h。光密度在450 nm化验了标(Bio-Rad实验室、CA、美国)。

2.7。细胞迁移和入侵检测

Transwell室(BD生物科学、钙、美国)接种转染细胞( 细胞/),降低室补充细胞媒介加上10%的边后卫。在培养后48小时37°C,细胞仍然被丢弃在膜的顶部。其他细胞被固定为70%乙醇和0.1%结晶紫染色。光学显微镜观察实施染色细胞,和那些在5随机地区数统计分析(放大100倍)。细胞入侵检测是在类似的方式进行的,除了细胞入侵检测的第一步,上面的房间添加了人工基底膜(BD生物科学、钙、美国)。

2.8。细胞凋亡检测

分析细胞凋亡,转染细胞培养48收集。符合制造商的指示,FITC细胞凋亡测定工具包(美国BD Pharmingen, CA)是应用于确定细胞凋亡率。最后,FACSCalibur流式细胞分析仪(美国,正欲CA)测定细胞凋亡实现的。

2.9。Dual-Luciferase化验

确认miR-18a-5p目标SORBS2 3UTR,我们构建质粒psiCHECK-SORBS2 dual-luciferase记者(Sangon有限公司,上海,中国)3 - - - - - -翻译区(UTR)野生型(wt-SORBS2)和SORBS2 3UTR突变(mut-SORBS2)。规范后Lipofectamine 2000工具包(表达载体、钙、美国),psiCHECK-SORBS2 wt /狗和miR-18a-5p-mimic / NC-mimic cotransfected SCC-15细胞。Dual-Luciferase记者分析系统(美国WI Promega)是实现测量荧光素酶的可行性。化验上面有重复一式三份。

2.10。统计分析

GraphPad Prism 6.0 (La Jolla、钙、美国)来分析所有数据从三个独立的化验。结果被表示为 ,和一个 - - - - - -测试两组之间进行。 显示显著的统计学意义。

3所示。结果分析

3.1。miR-18a-5p HNSCC细胞增加

我们进行了生物信息学分析TCGA通过数据库过滤掉大量的DE-miRNAs在正常组织和HNSCC组织。miR-18a-5p水平明显高HNSCC组织(图1(一))。miR-18a-5p水平差异正常细胞系和人类HNSCC细胞系使用中存在方法进行测试。这个试验进一步验证HNSCC细胞系miR-18a-5p水平明显高,而在正常细胞时线(图1 (b))。

上述结果表明,miR-18a-5p水平大幅度增加HNSCC细胞系。在各种HNSCC细胞系,miR-18a-5p SCC-15细胞系中表达最高。因此我们选择SCC-15细胞进行后续的生物功能化验。

3.2。过表达miR-18a-5p充当HNSCC致癌基因

基于显著增加miR-18a-5p HNSCC细胞和生物信息学分析HNSCC TCGA中执行数据库,我们体现miR-18a-5p水平明显高HNSCC组织相对于正常组织。这个结果表示miR-18a-5p施加一个致癌效应。进一步了解HNSCC miR-18a-5p的功能,我们构造miR-18a-5p模仿质粒转染细胞。后来,超表达效率miR-18a-5p SCC-15细胞是通过存在化验。结果展示,miR-18a-5p水平中组显著高于对照组(图所示2(一个))。miR-18a-5p模仿从而可以用于后续分析。接下来,我们进行CCK-8试验测试的影响中miR-18a-5p SCC-15 HNSCC细胞的可行性。miR-18a-5p过表达后,细胞的可行性SCC-15细胞显著增强(图2 (b))。随后,Transwell的结果表明,迁移和入侵的速度miR-18a-5p SCC-15细胞模拟组显著高于数控模拟组当执行表达miR-18a-5p证实miR-18a-5p HNSCC细胞可以作为癌基因(数字2 (c)和2 (d))。此外,我们应用流式细胞术的影响评价中miR-18a-5p SCC-15细胞的凋亡。结果表明,SCC-15细胞的凋亡率明显降低在miR-18a-5p模拟组相对于数控模拟组。过表达miR-18a-5p可以抑制HNSCC细胞的细胞凋亡(图2 (e))。上述结果表明,被迫表达miR-18a-5p加速HNSCC的恶性发展。

3.3。HNSCC miR-18a-5p阻碍SORBS2水平细胞

我们首先分析基因的微分表达式,并获得2008年显著差异表达基因,其中1130个基因调节,而878人显著下调(图3(一个), )。我们进一步采用miRDB、TargetScan mirDIP和母星数据库来识别可能miR-18a-5p的目标。然后,他们与调节基因的获得目标基因(图2候选人3 (b))。相关分析表示,负面miR-18a-5p和SORBS2之间的联系是最强的(图3 (c))。此外,TCGA数据结果表明SORBS2明显低表达的癌组织(图3 (d))。有显著差异的SORBS2患者不同阶段(补充图1)。因此,我们选择SORBS2为下面的研究对象。此外,我们利用生物信息学数据库评估可能的结合位点miR-18a-5p和SORBS2 3UTR(图3 (e))。此外,我们执行dual-luciferase化验确定绑定miR-18a-5p和SORBS2之间。miR-18a-5p upregulation显著抑制荧光素酶活性wt SORBS2 3UTR虽然没有这样的影响的突变类型(图3 (f))。此外,我们应用中存在检查SORBS2 mRNA表达不同组的SCC-15细胞系和结果显示,过表达miR-18a-5p明显抑制SORBS2 HNSCC mRNA水平细胞(图3 (g))。免疫印迹结果也表明,显著减少SORBS2 miR-18a-5p过表达(图后蛋白质水平3 (h))。上述结果证明了专制miR-18a-5p对HNSCC SORBS2水平细胞的影响。

3.4。miR-18a-5p减少SORBS2加速HNSCC细胞的迁移和增殖,阻碍了细胞凋亡

我们建造overexpressing miR-18a-5p细胞系(miR-mimic + oe-NC)和同时过表达细胞系SORBS2 miR-18a-5p (miR-mimic + oe-SORBS2)来验证miR-18a-5p的影响和SORBS2 HNSCC细胞的生物功能。在存在化验,我们检查了SORBS2水平转染细胞。SORBS2水平减少细胞系miR-18a-5p过表达时,虽然SORBS2表达恢复当SORBS2和miR-18a-5p同时(图中4(一))。CCK-8试验表现出执行表达式的结果miR-18a-5p HNSCC细胞的生存能力增强,但同时迫使SORBS2和miR-18a-5p减少这样的表达增强的效果(图4 (b))。细胞移民和入侵检测表明,执行表达式HNSCC miR-18a-5p增强迁移和入侵能力的细胞,而同时强制表达SORBS2和miR-18a-5p会减少这样的效果(图4 (c)和4 (d))。流式细胞术结果显示overexpressing miR-18a-5p HNSCC细胞凋亡能力减弱,同时并发执行的表达miR-18a-5p SORBS2会阻碍这样的效果(图4 (e))。因此,miR-18a-5p SORBS2表达目标加速HNSCC细胞的恶性行为。

4所示。讨论

研究HNSCC显示异常的各种microrna的表达。例如,两股mir - 99 - a -双(mir - 99 a - 5 - p:导链,和mir - 99 - a - 3 - p:客运线)(13]和mir - 876 - 5 - p [14]在HNSCC lowly-expressed, mir - 125 - 5 - p (15和mir - 127516)具有高度表达。所有上述microrna与HNSCC进展。因为miR-18a-5p对其他癌症也有类似的影响在HNSCC学习不好,是选择的研究。此外,miR-18a-5p HNSCC组织高表达是通过生物信息学方法,这结果是相同的,在随后的存在分析。我们的研究指出,其规模和深度前所未有miR-18a-5p HNSCC组织和细胞被激活水平。

miR-18a-5p培养各类癌症进展。例如,其upregulation具有积极作用HNSCC细胞的恶性表型(7]。miR-18a-5p也促进肺癌细胞增殖和迁移,阻碍他们的细胞凋亡17]。近年来,miR-18a-5p证明提高辐射敏感度的干细胞表达下调ATM和HIF-1α在肺癌6]。此外,它直接目标IRF2促进骨肉瘤细胞的入侵和迁移(8]。此外,它调节EMT的乳腺癌针对SPEBP1,蜗牛,HDAC1/2形成抑制复杂(9]。我们在HNSCC细胞系中也是miR-18a-5p SCC-15确认这个过程会导致增殖和迁移的加速度和镇压HNSCC细胞的凋亡。最后,我们证实miR-18a-5p也充当了一个启动子促进HNSCC进展。

大量的研究证明,miR-18a-5p有多个下游基因。郑et al。18指出miR-18a-5p可以目标CDK19乳腺癌。此外,Zhang et al。19]建议RUNX1 miR-18a-5p在恶性黑色素瘤的目标。到目前为止,没有文献揭示HNSCC miR-18a-5p的下游目标。本研究使用R包“刨边机”来确定差异表达基因,TCGA数据库,利用mirDIP TargetScan,母星,miRDB数据库评估可能的miR-18a-5p目标基因。然后他们被重叠的差异表达基因分析miR-18a-5p之间的相关性和mrna。miR-18a-5p HNSCC和SORBS2显著负相关。此外,生物信息学分析的结果显示低HNSCC SORBS2水平。后来,绑定miR-18a-5p和SORBS2通过dual-luciferase试验评估。最后,我们进行了存在和免疫印迹证明在SORBS2 miR-18a-5p表达的抑制作用。

深入调查的机制miR-18a-5p / SORBS2 HNSCC轴,我们被迫表达式miR-18a-5p细胞系和并发执行表达式生成miR-18a-5p SORBS2细胞系。一系列生物化验证实过表达miR-18a-5p促进恶性进展的HNSCC而过表达SORBS2将扭转这样的效果。这个结果表明,SORBS2充当HNSCC阻遏,证明miR-18a-5p促进HNSCC细胞的增殖和迁移特性,阻碍了细胞凋亡。

简而言之,我们证明了在HNSCC miR-18a-5p水平提高。与此同时,过表达miR-18a-5p培育HNSCC细胞的增殖和迁移,抑制细胞凋亡。HNSCC,我们发现SORBS2,一个有效的目标miR-18a-5p,表达下调的miR-18a-5p加强增殖和迁移能力,削弱HNSCC细胞的凋亡能力。现有的研究揭示了SORBS2在癌症的抑制作用。我们的研究说明了miR-18a-5p / SORBS2监管途径的作用机理HNSCC为了更好地理解HNSCC的发展,因此开发新型治疗提供依据。然而,具体机制仍unelucidated。因此,我们需要进一步研究如何将信号通路调节细胞表型,以发现一个预后的标志HNSCC的早期临床诊断。我们的目标是为HNSCC的早期诊断提供基础,并提供替代途径治疗这种疾病。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。数据和材料在当前的研究中可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

陈钱给概念化和分配方法。钱陈和陈京徐倩和徐经负责写作和草稿准备。Mingzhen朱镕基提交版本的最终批准。所有作者阅读和批准最终的手稿。

补充材料

补充图1:表达差异的SORBS2 HNSCC患者不同阶段。SORBS2差异表达在肿瘤患者各种T阶段,虽然它是明显降低患者的T3 + T4与T1 + T2肿瘤肿瘤相比。(补充材料)

引用

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