文摘
心房纤颤(房颤),最熟悉的心律紊乱,是中风的主要原因,而房颤背后的机制基本上仍不清楚。在目前的研究中,我们使用RNA-seq方法识别275积极监管mrna和117负监管mrna在房颤与健康对照组相比。通过生物信息学分析,表明这些独特的表达基因参与调节多种房颤生物过程和途径,如血小板聚集、血小板激活,pri-miRNA转录,转化生长因子(TGF -β)受体信号通路。蛋白质相互作用(PPI)网络分析确定ITGB5 SRC, ACTG1,同类,ITGA2B, ITGB3, TUBB4B, CDK11A, PAFAH1B1, CDK11B,房颤的监管机构和TUBG1中心。此外,实时定量PCR(存在)进行了测定,表明这些基因中心是非常在房颤样品相比正常样本。我们相信这项研究将丰富房颤的发病机制的理解,使对房颤的发病机制的进一步研究。
1。介绍
心房颤动(房颤)目前属于列出了最常见的引起世界各地的心脏节律疾病(1]。房颤引起的发病率和死亡率近年来正在增加。在过去的几十年中,一些致病因素与房颤的进展。例如,miR-31产生损耗在AF心律失常的神经元一氧化氮合酶和肌营养不良蛋白2]。PVT1调节房颤的进展通过mir - 128 - 3 - p - sp1 tgf -β1-Smad轴(3]。然而,房颤背后的机制还有待进一步研究。
随着高通量技术的发展,如门店(下一代测序)和基因表达芯片,它有助于进一步了解房颤的潜在机制的发展和进步。多个组表明,编码和非编码基因的异常表达与房颤相关。例如,码头等人发现了112不同的microrna表达和40 circRNAs特异表达在房颤使用rna序列的方法(4]。同样,王等人发现多个microrna,如mir - 155, mir - 146 b - 5 - p,和miR-19b特异表达的房颤样品使用RNA-seq分析(5]。值得注意的是,长时间未编码的rna也被证明参与调节多种生物过程在房颤的进展。梅等人发现了117和65年调节使之抑制lncRNAs房颤患者相比,控制样品(6]。LncRNA ENST00000559960 uc004aef。3are validated to be dysregulated in AF samples, which are revealed by microarray analysis [7]。然而,进一步理解与房颤相关的致病机制仍迫切需要减少这种疾病的发病率。
在这个研究中,我们采用RNA-seq技术来识别不同的mrna表达和检查这些特异表达基因的功能意义在房颤。PPI网络分析用来确定基因在房颤中心。我们认为这项研究可以提供小说潜在的诊断和治疗房颤的生物标志物。
2。材料和方法
2.1。成人心脏样本集合
血液标本来自3健康样品和5房颤病人的样本。研究符合《赫尔辛基宣言》指导方针。同意捐赠研究是通过组织的转让协议的机构。本研究经医院伦理委员会,并在所有患者获得书面同意。静脉血液样本集合是通过EDTA管和PAXgeneTM血液RNA管(PreAnalytiX)。EDTA管立即被离心机分离血浆,和所有的管子都保持在-80°C。
2.2。RNA隔离和RNA序列
试剂盒试剂用于隔离静脉血标本的总RNA。调查的总RNA样本的数量和完整性NanoDrop 2000分光光度计。靶RNA的完整性测试用1.5%琼脂糖凝胶电泳。安捷伦2100生物分析仪采用调查RIN值( )。信使rna是通过polygo-d升华( )探针与聚(选择一个目标。蒸馏信使rna片段的大小是200个基点。互补脱氧核糖核酸(互补DNA)。修理结束后进行了细化QIAquick PCR试剂盒,和适配器的结扎。凝胶净化(TAE 2%)进行了隔离300 nt碎片。信使rna图书馆建成。此外,18 - 30元RNA是获得的总RNA。互补脱氧核糖核酸注定化学和反向转录。最后,随之而来的cDNA图书馆于2500年采用HiSeq测序平台。
2.3。测序数据分析
最初,每个样本的原始数据的RNA序列都是由Fastqc制造(8]修指甲适配器和驱逐读取与低质量。剩余清洁读取晶莹在基因组采用顶环(9]。袖扣对齐结果输入(10]。单位使用的表达水平在我们的研究中是FPKM。Cuffdiff应用于计算微分表达式。我们发现差异表达基因用以下标准: 和 。
2.4。差异表达基因在房颤(度)
房颤和健康之间的差异表达控制样本相比 - - - - - -测试。度的AF相比,控制校准值< 0.05和 。度的聚类分析和策划热图是由集群包和热地图包软件。
2.5。生物信息学分析
进一步探索势函数和信号通路由度在房颤,基因本体论(去)11)术语分析和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)途径12]分析进行基于目标由大卫(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)[13]。生物过程和途径值< 0.05被认为是重要的。
2.6。定量实时聚合酶链反应
结核病绿色™预混料交货Taq™II(豆类,大连,中国),ABI 7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)被用来执行定量实时PCR(存在)。引物在实验(列在表中实现S1)被Sangon生物技术合成。Ct值的归一化计算β肌动蛋白或RNU6内部控制评估基因的表达水平。相对mRNA的表达是由采用2- - - - - -ΔΔCt方法。每个样本重复了三次。
2.7。蛋白质相互作用分析
旨在研究蛋白质之间的相互作用差异表达mrna在房颤,检索的搜索工具相互作用的基因(字符串)数据库(14)进行蛋白质对以互惠的行动。蛋白质相互作用(PPI)网络建成Cytoscape 3.4.0 (http://cytoscape.org/)[15]。在这个网络中,每个节点是一个蛋白质,边代表两个蛋白质之间的相互关系。
2.8。分析统计数据
度进行了分析,采用DESeq2包工作室(版本:3.6.1)。 和调整值< 0.05被选为截止值的识别度。实验数据显示为 (标准差)不少于三个复制测量。学生的 - - - - - -测试组之间使用。的值< 0.05被认为是重要的统计数据的置信水平为95%。
3所示。结果
3.1。识别的独特表达了对房颤的mrna
通过比较AF和健康之间的全基因组基因表达变化控制样品使用RNA-seq方法,得到了392度,其中包括275积极监管mrna和117年负监管mrna在房颤与健康对照组相比。微分mRNA的表达层次聚类是数据所示1(一)和1 (b)。
(一)
(b)
3.2。去和KEGG通路分析AF的度
我们接下来进行和KEGG分析针对突出的潜在功能独特的mrna表达在房颤。如图2,排名前十的丰富生物过程(BP)条款规定度包括血小板聚集,integrin-mediated信号通路,血小板脱粒,铁离子稳态,内耳发育、调节细胞生长,蛋白质磷酸化,pri-miRNA转录的积极管理,转化生长因子(TGF -β)受体信号通路和细胞内的雌激素受体信号通路(图2(一个))。大大丰富了蜂窝组件(CC)条款规定度包括内质网、线粒体膜,血小板α颗粒膜,黑素体,整合素复杂(图2 (b))。显著富集的分子功能(MF)条款规定度包括蛋白结合,细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性,ATP绑定,吡哆醛磷酸酶活性,蛋白激酶活动,整合素绑定(图2 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
同时,KEGG路径分析表明,相关的差异表达基因调节焦点粘连,血小板激活,扩张型心肌病,雌激素信号通路,肥厚性心肌病(HCM)多巴胺能神经突触,ECM-receptor交互,破骨细胞分化、促性腺激素信号通路,昼夜夹带(图2 (d))。
3.3。蛋白质相互作用网络分析AF的度
接下来,我们探讨这些度在房颤的关系通过构造基于字符串的PPI网络数据库。如图3蛋白质,网络包含126和265的边缘。中心高度与其他蛋白质的蛋白质。在PPI网络,SRC ( ),ACTG1 ( ),ITGB3 ( ),BMP2 ( ),H2AFX ( ),和H2BFS ( )是中心的基因。
3.4。识别基因网络在房颤的中心
随后,中心基因网络分析应用了MCODE插件。截止度≥2。两个中心网络被确定在上面的PPI网络。如图4(一)中心网络1包括ITGB5 SRC, ACTG1,同类,ITGA2B, ITGB3。和中心网络2包括TUBB4B、CDK11A PAFAH1B1 CDK11B, TUBG1(图4 (b))。
(一)
(b)
3.5。验证表达式的关键度AF的存在
我们验证的表达关键度5 AF样品和3正常使用中存在试验样品。因为在数据5(一个)- - - - - -5 (j)、RNA-seq分析的结果表明,TUBG1 CDK11B, PAFAH1B1, CDK11A, TUBB4B, ITGA2B,同类,ACTG1, SRC, ITGB5调节5 AF样品相比3正常样本。然后,这些关键度的表达式是房颤样本高于证实,在健康控制样品使用中存在试验(图5 (k))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
4所示。讨论
值得注意的是,调节房颤机制发展仍需要进一步研究。随着RNA序列的发展,该方法已广泛应用于探索有关多种人类疾病的病理机制,包括癌症和房颤。我们已经基于整个知识,研究mRNA的表达分析在房颤组织RNA序列是罕见的。在这个实验中,我们认识到275年积极的监管和117消极监管mrna 5 AF样品相比3控制样本。
生物信息学分析显示,这些度参与一些生物过程和途径,例如,血小板聚集、血小板激活,pri-miRNA转录,TGF -β受体信号通路,这已经被证明与房颤相关的先前的研究。Pourtau集团发现房颤病理学与血小板聚集异常和急性房颤导致增加的血小板聚集(16]。除此之外,它还报道,血小板活化是一个关键的阶段与房颤相关监管机构对中风风险(17]。有趣的是,我们发现在房颤度显著参与调节pri-miRNA转录。小分子核糖核酸(microrna)已被证明是与房颤相关进展。例如,过度的miR-31房颤导致心律失常通过耗尽肌营养不良蛋白和神经元一氧化氮合酶(2]。mir - 328控制不良电重构在房颤18]。新兴的研究表明,多个下游目标TGF -β信号导致房颤的发展,包括CD44 / STAT3和SMAD2/3 [19]。
在过去的几十年中,发展高通量技术帮助研究人员识别差异表达基因相关疾病的进展。然而,一个巨大的挑战在理解疾病的机制是如何识别的核心监管机构从数以百计的不同表达基因。最近的研究表明,PPI分析中心监管机构的识别是一种有效的工具。例如,邹等人发现,CD19 FGF9, GNGT1,支撑中心SOX9基因在房颤与中风(20.]。钟山等人发现交流发挥了关键调节器在2型糖尿病使用PPI网络分析(21]。揭示本研究构建PPI网络的交互在房颤。总共有126度蛋白质和265边缘被包含在这个网络。在这些蛋白质、SRC ACTG1、ITGB3 BMP2, H2AFX, H2BFS基因被确定为中心。SRC被报道在心房重构提供由于tachypacing使用kinomic阵列分析(22]。ACTG1是细胞骨架的组成部分,与听力损失和皮肤癌相关细胞增殖(23,24]。我们的研究表明,ACTG1首次与房颤。先前的研究表明,BMP2参与心脏发展和可能影响对缺氧的反应(25]。此外,我们发现两个中心网络,其中包括6蛋白质和5蛋白质,分别。存在验证表明,这些中心基因ITGB5 SRC, ACTG1,同类,ITGA2B, TUBB4B, CDK11A, PAFAH1B1, CDK11B, TUBG1明显在房颤样品相比正常样本。这些蛋白质已报告在人类疾病中扮演不同的角色。例如,家族是广泛地显示丝氨酸/ threonine-protein激酶中存在局部粘连,扮演核心角色作为生长因子信号的多用途效应和cell-matrix交互(26]。TUBB4B TUBG1were微管蛋白,发挥了关键作用在维持细胞形状和调节cell-matrix粘连,信息交互,蛋白质运输和细胞运动(27]。CDK11A CDK11B和细胞周期蛋白依赖性激酶,参与调节细胞周期(28]。我们认为这些报告一起了解我们的研究将提供一个新的见解机制调节房颤。
5。结论
总的来说,我们筛选275 mrna积极监管和117 mrna消极监管与健康对照组相比,房颤。生物信息学分析表明这些度参与调节多种房颤生物过程和途径,如血小板聚集、血小板激活,pri-miRNA转录,TGF -β受体信号通路。PPI网络分析确定ITGB5, SRC, ACTG1同类,ITGA2B, ITGB3, TUBB4B, CDK11A, PAFAH1B1, CDK11B,房颤的监管机构和TUBG1中心。此外,存在试验的结果表明,这些中心基因明显在房颤样品相比正常样本。我们相信这项研究将丰富房颤的发病机制的理解,为进一步的研究奠定基础。
数据可用性
的数据支持本研究的结果和作者的批准是可用的。
的利益冲突
作者(年代)(s)宣称他们没有利益冲突。
作者的贡献
小南南陈和μ秦执行概念和设计。小南南陈和Qunlin锣执行方法的发展。南徐和Yu林进行样本集合。嘉鸿小王和Qunlin锣导致了数据的分析和解释。小南南陈、王嘉鸿和Pengxiang郑导致了写作,评论,和/或修改的手稿。小南南陈和μ秦贡献同样并列第一作者。
确认
这项研究是由上海卫生和计划生育委员会项目(批准号201940057)。
补充材料
补充表S1:定量实时PCR引物。(补充材料)