文摘

目标。透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是最常见的肾细胞癌亚型。癌症相关的成纤维细胞(战乱国家)作为肿瘤基质的主要成分可以通过分泌液影响肿瘤恶化,而液蛋白质的载体,核酸和其他代理负责交付的生物信息。有鉴于此,液来自战乱国家正在成为有前途的生物标志物在临床癌症的诊断。然而,他们的角色在透明细胞肾细胞癌(ccRCC)仍然知之甚少。方法。在这里,我们从ccRCC组织分离成纤维细胞,提取液,观察他们的形态,和发现外来体标记蛋白质包括Hsp70的表达,CD9和CD63。与此同时,我们标记液和coculture进行实验来验证交付mir - 224 - 5 - p从战乱国家到769年- p细胞与液作为载体,以澄清的效果CAF-derived液ccRCC细胞恶性行为,以及讨论如何mir - 224 - 5 - p涉及以上监管。结果。透射电子显微镜是首先应用,指出液我们孤立在正常范围内。此外,免疫印迹也证实存在的外来体标记蛋白Hsp70, CD9和CD63。此外,coculture实验和CAF-derived观察液能够促进ccRCC细胞的恶性行为,和exosomal mir - 224 - 5 - p可以内化ccRCC细胞参与调节细胞增殖、迁移、入侵和细胞凋亡。结论。总之,mir - 224 - 5 - p可以通过CAF-derived液囊进入ccRCC细胞,进而促进ccRCC细胞的恶性行为,这表明mir - 224 - 5 - p有可能切断ccRCC作为治疗目标。

1。介绍

肾细胞癌(RCC)来源于肾上皮,占大约90%的癌症在肾脏,其中透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是最常见的肾亚型负责大部分的癌症死亡(1]。一般来说,ccRCC往往是诊断在一个先进的转移阶段,导致戏剧性的减少病人的存活率(2]。ccRCC因此,早期诊断和监测疾病进展的关键步骤来改善患者的生存3]。

“肿瘤”是由癌症和基质细胞组成的。肿瘤细胞通常被认为是恶性肿瘤细胞不进行分化,而基质细胞是良性的肿瘤细胞周围的细胞。基质细胞由成纤维细胞、血管内皮细胞,免疫细胞(4]。成纤维细胞是肿瘤基质的基础,而癌症相关的成纤维细胞(战乱国家)是成纤维细胞的激活程序5,6]。战乱国家是一种永久激活成纤维细胞在肿瘤被认为有很强的能力管理和参与癌症发展的所有阶段(7,8]。报道,战乱国家可以调节细胞增殖、迁移、代谢、免疫反应和细胞通过分泌各种增长因素和蛋白酶(9,10]。此外,战乱国家可以提供分子成其他细胞通过分泌液改变肿瘤的环境(11]。

液是重要的细胞外囊泡的杯状容器,直径40 - 150海里(12]。核内体首先由细胞膜的内吞作用,然后,大量的囊泡在核内体成形。此后,核内体与质膜融合,使经管囊泡或液释放到细胞外介质(13]。在癌症、肿瘤细胞异常的秘密大规模液转移旁分泌信号或为tumor-environment交互距离(11]。液在信息交流中发挥关键作用的某些夹杂物转移到靶细胞和组织(14]。蛋白质、DNA和RNA的夹杂物的主要成分,其中microrna可能促进肿瘤生长、转移、血管生成和耐药性通过干扰肿瘤免疫微环境15]。因此,exosomal microrna作为有前途的生物标志物应用于(16]。除了事实,肿瘤细胞可以分泌exosomal microrna CAF-derived exosomal microrna也扮演了一个重要的角色在肿瘤的生长17]。先前的研究表明,mir - 224 - 5 - p是一种microrna通常异常高表达的恶性肿瘤。例如,mir - 224 - 5 - p在乳头状甲状腺癌目标EGR2促进癌细胞迁移和入侵18];在乳腺癌中,mir - 224 - 5 - p可以抑制癌症细胞自噬19),而在胃癌,mir - 224 - 5 - p作为癌基因促进癌细胞恶性行为(20.]。然而,mir - 224 - 5 - p的角色由CAF-derived液在调停癌症生物学行为没有被感动了。此外,研究关于mir - 224 - 5 - p调节ccRCC恶性进展仍然贫穷。

这里,战乱国家ccRCC病人被发现有能力分泌液可使影响癌细胞表型像扩散。另外,液被发现明显高表达mir - 224 - 5 - p,而mir - 224 - 5 - p可以脱离液ccRCC细胞参与癌症细胞表型。总的来说,我们的分析提供的结果有助于确定一个潜在的生物ccRCC治疗的目标。

2。材料和方法

2.1。生物信息学分析

正常组织和癌组织样品12 ccRCC病人GSE109368从GEO数据库获得数据集(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。基因差异分析( , )基于获得的样本通过应用“刨边机”方案,执行和差异表达microrna (DEmiRNAs)。相关文献搜索识别目标microrna的,感兴趣的exosomal microrna的表达是局部使用EVmiRNA数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/EVmiRNA)。

2.2。人类主要的成纤维细胞的分离

总共三个接受部分或根除性肾脏切除手术的患者在唐山Gongren医院从2018年12月到2019年10月被纳入本研究。从上面的病人包括肿瘤组织样本和收集邻近正常组织,正常部分应至少3厘米远离肿瘤的边缘。所有患者符合标准如下:(1)所有患者病理诊断为ccRCC;(2)所有的患者淋巴转移或远处转移;(3)所有的患者术前放疗或化疗;(4)所有患者签署知情同意前开始研究,这个研究是唐山Gongren医院的伦理委员会批准。

刚切除组织样本被剁碎成大约1毫米³立方体块,这些块然后用胶原酶消化。细胞在1000转离心液过滤后通过离心10分钟75μm过滤器。接下来,杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)与10%胎牛血清(补充的边后卫;Gibco,卡尔斯巴德,CA)以及适当的100μ青霉素g / ml链霉素和100 U /毫升(Gibco热费希尔科学,Inc .)是用于细胞培养、和文化条件将5%的股份有限公司₂和37°C。大约10天后,一系列统一的成纤维细胞形成细胞碎片。成纤维细胞,通过10倍多被用于后续的实验。

2.3。ccRCC细胞培养

ccRCC细胞株769 - p(写明ATCC®crl - 1933)提供的美式文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)放置在10% FBS-supplemented DMEM文化在含有5%孵化器有限公司₂37°C的温度,适当增加100μ青霉素g / ml链霉素和100 U /毫升(Gibco热费希尔科学,Inc .)。

2.4。液提取

的Hieff™外来体快速隔离设备(Yeasen、上海、中国)来提取液,操作是按照制造商的协议。首先,成纤维细胞与磷酸盐(PBS)洗4°C时在融合增长到80%,然后在2500×g持久受到离心10分钟分离细胞碎片和死细胞介质。随后,10毫升治疗中收集到一个新的离心管与2.5毫升提取试剂混合,站2 h。此后,混合物在10000×g离心1 h在4°C。100年的沉淀收集后续再悬浮μl PBS加载缓冲区。之后,解决方案被转移到一个EP管又离心机(12000×g, 2分钟,4°C)收集上层清液液。

2.5。透射电子显微镜法

孤立的分数和液被暴露在消息灵通的缓冲区(表达载体),后一个整除的悬架被上的碳涂层网格JEOL jem - 2100透射电子显微镜(100 kV)。此后,网格被转移到新鲜的PBS (Hyclone)洗(5分钟/ 3次),固定在3%戊二醛(Sigma-Aldrich) 10分钟,洗了dH₂阿三次(5分钟),最后,暴露于2%醋酸双氧铀(Sigma-Aldrich)。然后样本在透射电子显微镜下观察几分钟后的干燥。

2.6。Coculture

液与PKH67混合染料在加载缓冲区和复苏后在室温下培养5分钟。样本然后离心器在100000×g 1 h去除自由染料的PBS + 5%的边后卫。然后cocultured染色液和769 - p细胞系6 h和4%多聚甲醛固定的20分钟25°C。最后,PKH67-labled液囊是否出现在769 - p细胞决心通过荧光显微镜。

2.7。中存在

总RNA提取细胞或液使用试剂盒试剂(表达载体,热费希尔科学,Inc .)。互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript RT试剂盒(豆类、日本)根据制造商的指示。microrna的互补脱氧核糖核酸的合成miRcute + microrna的第一链cDNA合成装备(天津)。执行中存在应用生物系统公司ABI 7500实时PCR系统(热费希尔科学,Inc .)使用由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色大师(火箭)试剂盒(罗氏制药、巴塞尔、瑞士)。正常化microrna的表达是通过使用U6表达式。mir - 224 - 5 - p正向引物:5 - - - - - -CTGGTAGGTAAGTCACTA-3 ,反向引物:5 - - - - - -TCAACTGGTGTCGTGGAG-3 ;U6正向引物:5 - - - - - -GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ,反向引物:5 - - - - - -CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3 。褶皱变化是由相对量化计算方法(方法)。的数据是代表三个独立的实验。

2.8。免疫印迹

细胞收获与PBS指定时间和清洗。总蛋白质分离细胞的浓度是由BCA蛋白质分析检测设备(热费希尔科学、美国)。蛋白质分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)(美国表达载体)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。一夜之间,细胞膜被孵化与特定的抗体主要在4°C和5%的脱脂牛奶被屏蔽后在室温下2 h。表示主要抗体包括兔子anti-CD63,兔子anti-CD9,兔子anti-Hsp70,兔抗αsma,兔子anti-GAPDH。膜被TBST三次清洗和孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白在室温下1 h。最终,所有的蛋白质都可视化使用增强化学发光试剂(热费希尔科学,Inc .)。这里使用的抗体都从Abcam订购。

2.9。细胞转染

至于细胞转染,mir - 224 - 5 (100 - p模仿μ米),其负控制数控模拟(100μ米)从RiboBio购买(广州)被用于mir - 224 - 5 - 769 - p p超表达细胞。转染后细胞培养48 h在37°C到进行后续实验。

2.10。细胞凋亡检测

细胞凋亡测定使用膜联蛋白V-FITC细胞凋亡测定工具包(Beyotime,中国)。细胞被trypsin-treated(美国BD生物科学)和洗冷PBS。细胞离心,然后resuspended在195年μl 1×膜联蛋白V加载缓冲区后上层清液被移除。随后,细胞被孵化与5μl Annexin-V / FITC,紧随其后的是10μlπ在黑暗中在室温下15分钟。分析的结果是CellQuest软件(美国新泽西州BD生物科学)流式细胞仪石中剑流式细胞术(美国,正欲CA)。

2.11。细胞增殖实验

细胞增殖测定使用CCK-8工具包(Dojindo、日本)根据制造商提供的信息。在表示时间点(0,24、48和72 h), 10μl CCK-8补充每个好,细胞被孵化额外2 h在37°C。分光光度计(美国Bio-Rad)被用来分析光密度(OD)在450海里。

2.12。迁移和入侵检测

迁移和入侵检测是使用Transwell钱伯斯(0.8执行μ米孔隙大小;美国默克密理博)。Transwell迁移试验,细胞( )在200年暂停了μl无血清培养基和镀到参议院,而DMEM和10%的边后卫作为引诱剂添加到众议院。Transwell入侵检测,参议院与50预镀μl基底膜基质(美国康宁公司)和干4 h在37°C。测量细胞迁移或入侵进行24 h postculture。细胞迁移或入侵下议院处理4%多聚甲醛结晶紫跟着上涨了1%。最后,细胞数量统计在四个领域的能力评估随机选择在光学显微镜下观察(100 x)。

2.13。统计分析

本研究分析的数据是进行GraphPad Prism 6.0(拉霍亚,CA),和所有的实验都重复一式三份。数据显示使用 。通过学生的群体间的差异进行评估 - - - - - -测试或单向方差分析。统计学意义时定义值小于0.05,高度统计学意义被定义的值小于0.01。

3所示。结果

3.1。ccRCC患者的成纤维细胞可以秘密液

主要战乱国家和正常成纤维细胞(NFs)被孤立的从12 ccRCC患者包括在这项研究中,和的表达α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)是用于区别于其他细胞。结果发现,αsma表达在NFs和战乱国家,的表达αsma在战乱国家(图的风险高1(一))。透射电子显微镜是用来进一步确定液的大小,我们从初级战乱国家和NFs孤立。这是指出液的直径范围从40纳米到120纳米(图1 (b)),这是在正常范围内的液。随后,外来体表面标记蛋白HSP70, CD9、和CD63液分泌通过NFs和战乱国家被免疫印迹检测,分别表达这些蛋白质被发现在两组液(图1 (c))。基于液的大小和标记蛋白质的存在,我们证实,成功从成纤维细胞分离液。

3.2。液来自战乱国家促进增殖、迁移和入侵ccRCC细胞和抑制细胞凋亡

由于液发挥重要作用在肿瘤微环境(时间),我们设计研究的潜在影响液来自战乱国家ccRCC细胞性质。在考试之前,首先从战乱国家分离液或NFs cocultured 769 - p癌细胞。24小时后,相关函数评估进行了分析。显示的数据从CCK-8和流式细胞术,769 - p细胞的生存能力与CAF-derived cocultured液强相比,细胞cocultured NF-derived液(图2(一个)),而细胞凋亡与NF-derived更高的组中的液(图2 (b))。此外,细胞迁移和侵袭性能力也指出加强与液组细胞来自战乱国家,根据Transwell试验(数字2 (c)和2 (d))。因此,我们可以得出结论,CAF-derived液发挥积极作用在ccRCC细胞增殖,迁移和入侵,但在细胞凋亡抑制的作用。

3.3。液可以转移mir - 224 - 5 - p战乱国家ccRCC细胞

探索的内在机理CAF-derived液调停ccRCC进展,我们专注于microrna的失调CAF-derived液。作为微分表达式分析显示基于地理数据库,24个不同调节和33个表达下调microrna(图3(一个))获得GSE109368数据集。mir - 224 - 5 - p在肿瘤组织(图观察到显著的调节3 (b))。此外,文献显示,exosomal mir - 224作为预后生物标志物ccRCC [21]。结合发现在3.2中,我们假设CAF-derived液可能富含mir - 224 - 5 - p和可以提供mir - 224 - 5 - p ccRCC细胞影响ccRCC细胞表型。

为了确认上述猜测,我们做了一个比较分析mir - 224 - 5 - p表达CAF和NF-derived液囊。mir - 224 - 5 - p被发现显著高表达CAF-derived液的价格相比NF-derived液的存在(图3 (c))。然后,我们cocultured CAFs-exosomes或NFs-exosomes 769 - p细胞,发现mir - 224 - 5 - p的表达在细胞培养CAFs-exosomes显著升高(图3 (d)),这表明769 - p细胞cocultured CAF-derived液负责mir - 224 - 5 - p的增加表达。确定mir - 224 - 5 - p CAF-derived液可以进入和影响ccRCC细胞的活动,我们使用PKH67染料标签CAF-derived液,然后进行coculture 769 - p细胞,发现PKH67荧光可以发现在769 - p细胞(图3 (e))。总之,这些发现说明,mir - 224 - 5 - p可以从CAF-derived转移液ccRCC细胞。

3.4。超表达mir - 224 - 5 - p的促进增殖,迁移和入侵ccRCC细胞和抑制细胞凋亡

因为我们已经证明,mir - 224 - 5 - p可以从CAF-derived液囊转移到ccRCC细胞,我们进一步分析了mir - 224 - 5 - p是否参与监管ccRCC CAF-derived液囊的细胞表型。起初,mir - 224 - 5 - p模仿或数控模拟转染成769 - p细胞。之后,CCK-8、Transwell和流式细胞术进行了化验,结果表明,mir - 224 - 5 - p后高度表达,OD值在450 nm增加,表明细胞生存能力升高(图4(一)),但细胞凋亡抑制显著(图4 (b))。此外,细胞发生迁移和入侵的数量显著增加在mir - 224 - 5 - p upregulation,证明细胞迁移和侵袭性能力都高度增强(数字4 (c)和4 (d))。集体,mir - 224 - 5 - p可能作为发起人ccRCC的恶性发展。

4所示。讨论

肿瘤恶化是深受当地的微环境。战乱国家是最丰富和活跃的细胞类型的时间(22]。myofibroblast-like战乱国家的性质,如强大的收缩性和细胞外基质(ECM)沉积,使他们产生机械和化学信号,支持侵入性肿瘤的生长23]。功能上讲,战乱国家作为一个重要的球员,送液调节肿瘤恶化相邻细胞(24]。

在这项研究中,我们从战乱国家,研究提取液对ccRCC CAF-derived液囊细胞行为的影响。CAF-derived液被发现能够促进ccRCC的恶性肿瘤细胞表型。Exosome-delivered microrna与癌症细胞通讯,使肿瘤细胞“形状”和影响他们的环境(14]。到现在,几个来自不同来源的exosomal microrna在ccRCC已报告。例如,歌曲等。25)发现尿液exosomal miR-30c-5p抑制ccRCC进展通过直接调节HSPA5的表达在活的有机体内和在体外。Zhang et al。26)报道,血清exosomal mir - 210和mir - 1233具有良好的特异性和敏感性作为ccRCC诊断工具。王等人证明,液源自癌症干细胞运输miR-19b-3p ccRCC细胞并启动epithelial-mesenchymal过渡(EMT)促进转移27]。在这项研究中,确定致癌microrna在CAF-derived液囊,和生物信息学分析在体外实验进行。mir - 224 - 5 - p在ccRCC不同调节组织细胞被确认。此外,mir - 224 - 5 - p CAF-derived液囊中高度表达,能够从CAF-derived液囊转移到ccRCC细胞。因此,我们相信,mir - 224 - 5 - p参与监管ccRCC CAF-derived液囊的细胞表型。

microrna在战乱国家的失调是一个重要因素,影响细胞增殖,入侵和各种实体肿瘤的迁移28]。这里,我们设计了mir - 224 - 5 - 769 - p p过表达ccRCC细胞讨论的潜在奖励的效果exosomal mir - 224 - 5 - p ccRCC细胞恶性行为,这是在协议与mir - 224 - 5 - p在肾细胞癌的细胞(29日]。此外,我们还发现,过度的mir - 224 - 5 - p抑制细胞凋亡。总的来说,这些发现表明,液mir - 224 - 5 - p从战乱国家转移成ccRCC细胞促进ccRCC恶性特征的细胞。

综上所述,我们的研究发现高表达mir - 224 - 5 - p CAF-derived液澄清,mir - 224 - 5 - p可以交付给ccRCC细胞参与的监管CAF-derived液ccRCC细胞恶性属性。鉴于我们的发现,我们相信,mir - 224 - 5 - p有望成为ccRCC小说诊断或预后的生物标志物。我们的研究不仅提出了新的见解机制ccRCC进展还ccRCC患者有效的治疗带来了希望。然而,仍然存在局限性。例如,我们没有探讨的具体机制mir - 224 - 5 - p影响ccRCC恶性发展。此外,mir - 224 - 5 - p的影响从ccRCC CAF-derived液囊肿瘤的生长在活的有机体内还没有被确认。对于这些不足,我们的目标是识别相关下游目标mir - 224 - 5 - p或信号通路和构建动物模型在未来,帮助支持的角色mir - 224 - 5 - p ccRCC作为一个潜在的治疗目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。数据和材料在当前的研究中可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

本研究进行了符合赫尔辛基宣言二世和唐山中心医院的研究伦理委员会批准(TZYLK202009)。

同意

所有作者同意提交出版的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

刘YF和傅WQ导致的起草和修改这篇文章。曹XN,李SP,熊泰,张XL了概念和设计,采集的数据,分析和解释数据。高B是负责所有方面的工作。吴XT, L,魏YB已经出版的版本的最终批准。傅Yifei刘和文强贡献同样这项工作。

确认

Lianjie夏,我们感谢冯阴Baocun王腾飞,婷婷,Lijuan Wang Yubo张Na张苗苗,刘寰彩,东里太阳导致了手稿。