文摘
介绍。神经胶质瘤是广泛发生致命的肿瘤引起的神经胶质细胞癌变在中枢神经系统,包括大脑和脊髓。AP1S3非凡的功能在许多疾病,但其确切作用在神经胶质瘤仍未知。方法。生物信息学分析。基于TCGA数据库,得到差异表达基因。蛋白质相互作用网络分析是由字符串(PPI)。注释、可视化和合成(大卫)发现数据库程序被用于基因本体浓缩京都百科全书基因和基因组的分析和路径分析。kaplan meier曲线绘制,以确定AP1S3的预后价值,在体外在我们的研究实验。结果。4370个差异表达基因被确定。筛选215关键基因(PPI)蛋白质间交互作用分析;AP1S3有更高的学位。AP1S3包含五大丰富通路相关蛋白处理的内质网(ER)受体细胞外基质(ECM)受体相互作用,粘着斑,晚期糖化终产物(AGE)受体年龄(愤怒)信号通路在糖尿病并发症,与信使核糖核酸的监测途径。此外,AP1S3水平显著调节胶质母细胞瘤(GBM)样本,但大大降低在低度恶性神经胶质瘤(LGG)相比,在正常组织样本。kaplan meier曲线数据显示AP1S3密切相关神经胶质瘤的无病生存期(DFS)。我们的数据表明,AP1S3增加在神经胶质瘤的表达与正常组织相比,符合临床样本的数据。更重要的是,我们的数据表明,AP1S3在神经胶质瘤细胞的减少可能导致细胞增殖的抑制作用,入侵和迁移。结论。总的来说,我们的研究结果暗示AP1S3是一种很有前途的生物标志物的神经胶质瘤诊断和显示为神经胶质瘤的致癌基因。
1。背景
神经胶质瘤是最常见的中枢神经系统的神经胶质肿瘤(1]。相关病因仍然难以捉摸,可能是暴露于高剂量电离辐射或罕见的基因突变2]。增加颅内压、神经和认知功能障碍、癫痫、头痛、活动如呕吐、视力模糊、感觉丧失、疲劳、发泡、四肢抽搐,其他症状的主要表现是神经胶质瘤(3]。神经胶质瘤会引起多种神经系统症状,恶化患者的生活质量,甚至威胁到他们的生命(4]。5年致命性神经胶质瘤的比例大约是15% - -50%,根据不同条件的诊断(5]。手术结合放疗、化疗等综合治疗是治疗胶质瘤的主要策略1,6]。探索新型生物标志物和治疗神经胶质瘤患者还迫切的目标,即使现有的策略当然可以延长许多病人的寿命(7]。
AP1S3(适配器蛋白复合物1σ3)属于适配器蛋白质(美联社)家族(8]。美联社复杂是一种运输heterotetramer,这可以通过组装的小分类跨膜蛋白的运输小泡胞质(9]。五美联社AP1组成的复合物,AP2, AP3, AP4、和AP5筛选,和他们确定的细节10]。AP1便利的运输过程TGN通过针对PI4KIIa和PI4KIIb(核内体8]。四个单元,两个大亚基(G和B1),一个介质单元(M1),和一个小亚基(S1),都包含在AP1,类似于其他美联社复合物(11]。不同的基因包括两个g (AP1G1和AP1G2),两个m1 (AP1M1和AP1M2),和三个S1 (AP1S1、AP1S2 AP1S3)编码的四个亚基在相应亚型的AP1 (Boehm和Bonifacino, 2001)12]。到目前为止,很少有报道AP1S3在人类癌症的作用。户田拓夫等人发现,高度表达AP1S3 RACGAP1, ELOVL6, LRRC59协会方面表现出显著的乳腺癌患者的预后状况较弱(13]。此外,户田拓夫等人报道,mir - 204 - 5 - p直接目标和AP1S3进一步调制在乳腺癌细胞RNA网络(13]。事实上,更多的新兴报告表明AP1S3高度表达在多种癌症。然而,AP1S3在神经胶质瘤的作用还不是很清楚。
在这里,我们的数据显示,AP1S3 glioma-specific基因。去和KEGG分析数据表明,有五大AP1S3丰富通路相关。公共数据集进行了分析评估AP1S3 LGG表情,“绿带运动”组织。链接表达式存在的神经胶质瘤患者的无病生存期(DFS) AP1S3验证,以深入揭示AP1S3的面纱。此外,我们试图评估AP1S3在神经胶质瘤的表达和功能。在接下来的研究中,我们的数据表明,AP1S3表达神经胶质瘤组织和细胞的增加。此外,AP1S3-mediated促进神经胶质瘤细胞增殖和迁移可能是有利于发现新的生物标志物或治疗神经胶质瘤患者。
2。材料和方法
2.1。公共数据库
癌症基因组图谱(TCGA) [14)覆盖了20000多原发性癌的分子特性和匹配正常样本33类型的癌。基因表达综合(GEO) (15)数据库是一种NCBI-executed基因表达数据库。测序数据提供的人类神经胶质瘤标本GSE4271 TCGA并进行了分析。
2.2。建立可视化PPI网络
PPI网络构造了预测蛋白质之间的相互作用。候选人数字签名都进入了字符串网站置信水平为0.4,作为截止标准建设的生产者价格指数网络。一个简单的PPI表创建的文本字符串是可视化使用胞嘧啶(3.6.0版本,http://www.cytosine.org/)。界定 ,节点分数划分 , ,和最大 被表示为分界点的标准。合格的中心基因被选为潜在的关键基因和生物标志物。
2.3。去和KEGG途径分析
去AP1S3-associated基因的功能富集分析是利用分子进行注释系统MAS 3.0 (http://mas.capitalbiotech.com/mas3/)。大卫工具(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)应用于执行AP1S3-related KEGG通路的通路富集分析。 意味着显著差异。
2.4。病人和标本
确定AP1S3的表达,15例胶质瘤组织和匹配paracancerous组织来自华山医院(上海,中国)。华山医院的研究伦理委员会的许可获得使用人类的样本。
2.5。细胞培养
四个神经胶质瘤细胞系(SW1783, U373、SW1088 U87)和人类大脑上皮细胞系(HBEC-5I)获得的生物化学和细胞生物学研究所中国科学院(中国上海)。他们在rpmi - 1640有10%的边后卫(GIBCO)和1%青霉素和链霉素37°C下孵化器有限公司为5%2。
2.6。细胞转染
特定的核对抗AP1S3被英杰公司上海工厂的设计和合成。同时,相应的小干扰rna合成负控制。细胞被播种在生长培养基培养,直到细胞密度达到70%。然后,siRNAs转染到细胞利用Lipofectamine 2000试剂(英杰公司)作为描述的手册。这些细胞被收集并进行相应的实验在posttransfection 48小时。消极的控制(数控)序列如下:5 - - - - - -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ;有效的序列淘汰赛siRNA如下:si-AP1S3: 5 - - - - - -CCGGGAAATTGTTCAGATT-3 。
2.7。CCK-8化验
细胞计数Kit-8(东京都路,日本)被应用于测量细胞增殖的能力是制造商的指令。简单地说,大约 神经胶质瘤细胞被放置在一个96孔板和处理10μl / CCK-8每4小时的文化解决方案。然后,450纳米波长的吸光度测量(OD450)标(Bio-Rad)与细胞增殖曲线绘制在每个时间点。
2.8。实时定量PCR(存在)
总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体)。收获RNA被转录成cDNA PrimeScript RT工具包(美国豆类)。实施中存在利用SYBR预混料交货Taq(美国豆类)。详细的条件中存在的95°C 10分钟,94°C 30年代,共有40个周期,60°C 30年代,30年代72°C,然后永远72°C。GAPDH是应用于正常基因的表达。相对AP1S3表达式估计的2−ΔΔCt方法。PCR引物的序列如下:AP1S3 F底漆:5 - - - - - -ctggaaggagctaaaacttgttt-3 ,R底漆:5 - - - - - -ctccacgtaacgatgcacaa-3 ;GAPDH F底漆:5 - - - - - -GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3 ,R底漆:5 - - - - - -GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3 。
2.9。Transwell化验
在200年的细胞培养μl血清DMEM没有维持的上层舱Transwell孵化器(康宁,MA) 48小时。细胞迁移到舱底部固定在甲醛10分钟和DAPI染色15分钟。迁移细胞的数量是在显微镜下计数,和迁移细胞的相对百分比显示直方图。在评估侵袭性,过滤器与矩阵凝胶预镀。
2.10。统计分析
所有数据来源于被表示为三个独立的实验 。对比学生的组织进行了分析 - - - - - -测试。单向方差分析进行比较多个组。无病生存期(DFS) kaplan meier概率分析的方法,和总生存概率和单变量分析计算生存率较。 意味着显著差异。
3所示。结果
3.1。算出度和构建PPI网络
我们分析了转录组数据和4370个差异表达基因筛选(度)在神经胶质瘤的基础上TCGA数据库(图1)。获得度后,建立了215个节点组成的PPI网络数据库(图使用字符串2)。PPI网络主要包括AP1S3、FLNA CALU, ACTN1, MAPT, HSPA4, UBQLN4, RPN2, P4HB, MSN, AURKA, QGAP1 AURKA, PGK1。这些基因可能被用于识别关键的生物标志物,和AP1S3拥有更高的学位。
基于转录组数据76 LGG样本和77年的“绿带运动”TCGA样本数据库,4370度被确定。绿色表示度调节,红色表明度表达下调,和黑色表明它不是表达的一个样本。
3.2。功能性浓缩和通路富集分析
我们进行浓缩和KEGG通路分析,数据显示,AP1S3-related富集在生物过程方面(BP)包括neutrophil-mediated免疫力,中性粒细胞激活,中性粒细胞脱粒,中性粒细胞激活参与免疫反应,糖蛋白的代谢过程,aminoglycan代谢过程中,粘多糖代谢过程、膜脂质代谢过程、糖蛋白生物合成的过程,aminoglycan生物合成的过程(图3(一个))。AP1S3-related浓缩在细胞方面组件(CC)包含内质网腔中,细胞基质连接,粘着斑,分泌颗粒膜,黑素体,色素颗粒,lamellipodium,内质网的膜不可或缺的组成部分,空泡的腔,溶酶体腔(图3 (b))。AP1S3-related浓缩在分子方面函数(MF)覆盖转移酶活动(转移hexosyl组),水解酶活性(水解O-glycosyl化合物),水解酶活性(作用于糖基债券),蛋白二硫化物异构酶活动,分子内氧化还原酶活性(移调s债券),细胞粘附分子绑定,UDP-glycosyltransferase活动,转移酶活动(糖基转移组),碳水化合物结合,蛋白酶绑定(图3 (c))。AP1S3-related KEGG内质网途径组成蛋白质浓缩处理,溶酶体,细胞凋亡,蛋白聚糖在癌症,其他多糖降解,志贺氏菌病,arrhythmogenic右心室心肌病,沙门氏菌感染,粘多糖硫酸biosynthesis-heparan /肝素,和鞘脂类代谢(图3 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。高度与DFS表示AP1S3 GBM相关
AP1S3基因表达映射(49 LGG和81 GBM) 130神经胶质瘤患者从GSE4271下载。“绿带运动”组织的数据显示,AP1S3A表达式是显著高于LGG组织(图4(一))。同样,TCGA数据库分析数据表明,“绿带运动”样本高度表达AP1S3比LGG样品(图4 (b))。我们进行了进一步的研究对AP1S3表达式GBM / LGG之间的比较样本和正常样本。TCGA数据库分析数据表明,“绿带运动”样本高度表达与正常相比AP1S3样品(图4 (c))。然而,AP1S3 LGG样本的表达低于正常样本(图4 (d))。
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(f)
我们执行kaplan meier曲线分析评估AP1S3表达之间的相关性和GBM无病生存使用GBM TCGA数据库。上部中间AP1S3基因表达在所有GBM样品作为分界点,将所有病例分成AP1S3低组( )和AP1S3高集团( )。数据显示,高表达患者AP1S3较低比低表达患者无病生存AP1S3(图4 (e))。TCGA此外,我们进行数据分析来验证是否高表达AP1S3神经胶质瘤的存活率较低有关。TCGA数据显示,高表达患者AP1S3 DFS要低于低表达患者AP1S3(图4 (f))。
3.4。调节AP1S3在神经胶质瘤
在神经胶质瘤中存在进行检测AP1S3表达组织和邻近的正常组织。结果显示,与相邻正常组织相比,AP1S3高度在15对神经胶质瘤样本(图表示5(一个))。为了进一步确定AP1S3在神经胶质瘤的表达,我们也发现AP1S3在神经胶质瘤细胞的表达。数据显示AP1S3在神经胶质瘤细胞明显增加,尤其是SW1783和U373,而正常的大脑细胞(图5 (b))。SW1783 U373细胞选择在以下研究。我们的研究结果表明,神经胶质瘤AP1S3表达增加。
(一)
(b)
3.5。沉默AP1S3抑制胶质瘤细胞增殖、入侵和迁移
然后,我们探索神经胶质瘤AP1S3的特定功能。图6(一)表明AP1S3在SW1783沉默,U373 si-AP1S3转染后。接下来,CCK-8和Transwell化验确定进行了切除AP1S3对细胞增殖的影响,入侵和迁移。与si-AP1S3神经胶质瘤细胞转染后,细胞增殖能力降低(图6 (b))。此外,Transwell化验表明,沉默AP1S3抑制细胞迁移和入侵能力(数据6 (c)和6 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
神经胶质瘤,伴随着广泛的临床行为,是普遍致命的肿瘤引起的神经胶质细胞癌变(16]。神经胶质瘤的预后通常是可怜的,其发病率和致死率预计将增加在未来的几年中,尤其是在发展中国家(17]。目前治疗神经胶质瘤手术结合化疗和/或放射治疗(18]。然而,大量的肿瘤表现出高度的抵抗这些干预措施,和复发频繁,因为传统的疗法并不反对不同亚型的神经胶质瘤的分子特征(19]。分子遗传学为神经胶质瘤分类和预测提供新的见解对治疗的反应,从常规治疗新的革命性的治疗方法(20.]。由于治疗这种癌症的挑战,迫切需要确定额外的目标可以作为生物标志物早期诊断和治疗。
在这项研究中,4370度相关的神经胶质瘤被确定数据集的分析。通过富集分析,我们发现这些度富含neutrophil-mediated免疫力,内质网腔,转移酶活性,蛋白质在内质网处理,等等。同时,我们筛选215 PPI网络的高表达基因的识别关键的生物标志物。细丝蛋白(FLNA),作为一种新的下游效应器mTORC2控制GBM细胞的能动性,发挥重要的是在胶质母细胞瘤细胞的运动和入侵21]。研究人员发现,CALU可以作为一个潜在的血清生物标志物为胶质母细胞瘤的一个重要分析微阵列。ACTN1基因相关的微环境,显示恶性神经胶质瘤患者预后价值(22]。microtubule-associated蛋白的高表达τ(MAPT)基因密切相关的改善LGG总体存活率和无病生存期(23]。目前,没有报告探索AP1S3在神经胶质瘤。在此,我们试图系统地调查AP1S3在神经胶质瘤的功能和机制。
神经胶质瘤通常包含致命的成人大脑肿瘤,占所有脑部肿瘤的50%20.]。神经胶质瘤包含低级神经胶质瘤(LGG)(二级)、高级神经胶质瘤(HGG)(三级+ IV)、胶质母细胞瘤组(多形性胶质母细胞瘤,GBM) (IV级),和其他成绩的神经胶质瘤(OGG) (II级+ 3)18]。其中,“绿带运动”是大脑广泛发生的恶性肿瘤。“绿带运动”的高侵袭性导致更高的死亡率比其他任何脑部肿瘤(24]。因此,它是非常重要的准确预测神经胶质瘤的等级,并采取相应的临床治疗。在这里,我们的数据表明,“绿带运动”样本高度表达AP1S3比LGG样本。更重要的是,与正常组相比,AP1S3表达GBM极大的调节,而在LGG明显下调。此外,我们的数据表明,高表达AP1S3很大程度上是与短DFS BGM的病人。这些数据表明AP1S3是识别GBM的生物标志物和预测DFS的“绿带运动”。
AP1S3报道与许多癌症的发展,如皮肤癌和神经胶质瘤(8]。李等人透露,减少AP1S3能导致Huh7.5.1丙肝病毒生产的抑制细胞,随后阻碍肝癌的发病率(9]。另一项研究表明,高表达AP1S3参与胰腺导管腺癌的发病机制和不良预后的一个重要预测PDAC [25]。在我们的研究中,发现AP1S3促进神经胶质瘤细胞增殖通过执行CCK-8化验,和Transwell化验证明AP1S3增强神经胶质瘤细胞的转移。这些结果表明AP1S3可能在神经胶质瘤发生、发展发挥重要的是通过促进细胞增殖,迁移和入侵。
这项研究有一些局限性。首先,丰富的相关条款和KEGG通路AP1S3通过生物信息学分析需要通过实验评估。第二,需要更多的临床样本收集进一步验证的临床价值AP1S3 GBM LGG。在未来的研究中,我们将收集更多的临床样本探索AP1S3表达式之间的关系和临床参数(包括临床分期、年龄、和生存时间)和“绿带运动”的微分表达式和LGG。
总之,我们进行了生物信息学分析神经胶质瘤数据库和4370个差异表达基因的筛选。我们建立了一个视觉PPI网络和获得215关键基因,和AP1S3拥有更高的学位。我们的研究结果表明,AP1S3丰富功能和神经胶质瘤的途径。我们证明了AP1S3可能有用的诊断“绿带运动”和被报道与DFS的神经胶质瘤患者。我们进一步探索和讨论AP1S3在神经胶质瘤细胞的功能。我们的数据显示,AP1S3 SW1783和U373细胞调节。AP1S3的差别,对这些基因的抑制神经胶质瘤细胞增殖和迁移,揭示AP1S3作为生物标志物的可能性和神经胶质瘤的治疗目标。据我们所知,这是第一个研究表明AP1S3作为生物标志物为神经胶质瘤和预测神经胶质瘤的预后不良。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
婷婷你们尝试和起草了手稿。曹国伟李试验和起草了手稿。Yifei程试验和起草了手稿。你们婷婷和程Yifei贡献同样这项工作。