文摘
积累的研究显示神经胶质瘤和microrna的失调的发展之间的联系。一个典型的例子是mir - 381 - 3 - p,但它在神经胶质瘤的机制还不清楚。在这项工作中,我们确认过表达mir - 381 - 3 - p压抑的神经胶质瘤细胞的生物功能。此外,我们还发现,调节炭疽毒素受体1 (ANTXR1)负面由mir - 381 - 3 - p。我们进一步证明,mir - 381 - 3 - p -目标ANTXR1能够抵消mir - 381 - 3 p的抑制神经胶质瘤的生物功能。我们的结论是,mir - 381 - 3 - p和ANTXR1都在调节神经胶质瘤发展重要因素。mir - 381 - 3 - p / ANTXR1轴将神经胶质瘤的分子目标。
1。介绍
神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经肿瘤,这源于胶质祖细胞(1]。低级神经胶质瘤的10年生存率是47%,而平均生存时间等4级神经胶质瘤患者的胶质母细胞瘤只有15个月(2,3]。传统治疗如手术、化疗和放射治疗仍是治疗胶质瘤的主要手段,但神经胶质瘤患者的预后是有限的(4]。与此同时,靶向治疗已进入科学家的视野。过去的几年中有了长足的发现神经胶质瘤生物学由于不断集中,如关键分子和遗传机制。这些肿瘤的分子特性所提供的肿瘤发生发展和扩大我们的视野丰富具体有针对性的途径(5]。新型靶向抑制剂,如热休克蛋白90抑制剂和脱乙酰基酶抑制物,提高病人的生活质量(6]。结果,探索潜在的治疗目标和诊断标记具有巨大意义的改善神经胶质瘤患者的生存。研究表明,microrna能调节神经胶质瘤进展。例如,mir - 1254可以抑制癌症相关的功能神经胶质瘤(7]。沉默的mir - 769 - 5 - p明显抑制胶质瘤细胞增殖和促进细胞凋亡8]。作为一个microrna的家族的重要成员,mir - 381 - 3 - p也介导肿瘤进展。mir - 381 - 3 - p明显过度压制细胞乳头状甲状腺癌的恶性行为(9]。低水平的mir - 381 - 3 - p限制增长口腔鳞状细胞癌(10]。然而,没有研究显示,mir - 381 - 3 - p可以调节神经胶质瘤进展。
在这里,我们审查microrna的表达数据集,发现mir - 381 - 3 - p明显下调。我们观察到的功能overexpressing mir - 381 - 3 - p在神经胶质瘤进展并探讨相应的功能机制,将提供一个理论依据mir - 381 - 3 - p作为分子的目标。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
人类星状细胞NHA (BNCC341796)和神经胶质瘤细胞U87 (BNCC337885), H4 (BNCC100988) T98G (BNCC338721)和U251 (BNCC100497)是由希伯来文名字文化收集(BNCC;北京,中国)。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;生活技术,卡尔斯巴德,CA) + 10%胎牛血清(的边后卫;生命技术)+ 100 U /毫升青霉素+ 100μg / mL链霉素应用细胞培养。NHA细胞生长在星形胶质细胞增长媒体+抗坏血,rhEGF, ga - 1000、谷酰胺,胰岛素,5%的边后卫。所有的细胞通常是在湿润孵化器孵化。
2.2。转染的细胞
mir - 381 - 3 p -模仿oe-ANTXR1,和相应的负控制(nc) (NC-mimic和oe-NC)从GeneChem订购(上海,中国)和转染成神经胶质瘤细胞U87 50 nM使用Lipofectamine 2000(美国卡尔斯巴德表达载体)。
2.3。中存在
总RNA的提取是通过使用试剂盒试剂(热费希尔科学)。的质量和浓度RNA通过分光光度法检测。然后mRNA cDNA, microrna的互补脱氧核糖核酸合成使用miRcute microrna的第一链cDNA工具包(Tiangen生物技术)和实时PCR一步工具包(北京Transgen生物技术)11]。SYBR绿色PCR分析工具包(试剂盒,希尔登)被用来执行中存在。GAPDH和U6担任内部控制检测ANTXR1和mir - 381 - 3 - p的表达水平,分别。2- - - - - -ΔΔCt方法用于计算定量表达式的值。引物如表所示1。
2.4。免疫印迹
从U87细胞总蛋白的提取后使用radioimmunoprecipitation化验和蛋白酶抑制剂在冰上,蛋白质浓度(上层清液)是衡量bicinchoninic酸(BCA)工具包(美国沃尔瑟姆热费希尔)。蛋白质样品(50μg) 10% 1 - 2 h的sds - page电泳分离;样本加载PVDF膜。之后,膜被对待ANTXR1 (15091 - 1 - ap, 1: 1000年,Proteintech,武汉,中国)或GAPDH (10494 - 1 ap1 1: 5000年,Proteintech,武汉,中国),其次是杂交与二次抗体(Abcam ab6721, 1: 8000年,英国)。最后一步是可视化蛋白质乐队与电化学发光分析工具包(Solarbio,北京)。
2.5。细胞增殖检测
简而言之,神经胶质瘤细胞( (3)被播种在96 -孔板。在特定的时间点,每个添加10μL细胞计数设备8 (CCK-8)(美国Dojindo)和细胞培养在一般温度4 h。最后,每个在450 nm读的吸光度。
2.6。愈合试验
神经胶质瘤细胞被播种到6-well盘子。融合细胞达到90%后,刮了细胞无菌吸管。被PBS洗后,增加了新的FBS-free介质和细胞孵化了额外的24小时。后,细胞在0 h和24 h,见和愈合率进行了计算。 。
2.7。Transwell入侵检测
神经胶质瘤细胞( (4)被播种到参议院涂层与基底膜基质(美国BD),而650年μL DMEM含有20%的边后卫加入下议院刺激细胞入侵。24小时后,入侵细胞(细胞在下议院)收集,与4%多聚甲醛固定,沾0.1%结晶紫。最后,五个领域的观点被随机,在倒置显微镜下观察,结果表示为平均水平。
2.8。Dual-Luciferase记者分析
ANTXR1-WT和ANTXR1-MUT向量生成的克隆野生型(WT)和突变(傻瓜)ANTXR1 3UTR psiCHECK-2向量(WI Promega,麦迪逊,美国)。使用Lipofectamine 2000试剂,ANTXR1-WT / ANTXR1-MUT向量和数控模拟/ mir - 381 - 3 - p模仿转染成U87细胞。48小时后,萤火虫和Renilla荧光素酶强度进行了测试使用Dual-Luciferase记者分析工具包(美国Promega)。
2.9。统计分析
结果上处理GraphPad棱镜6 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。上述细胞功能化验都是重复三次。测量数据显示 。分析两组之间的差异是由学生的处理 - - - - - -测试。统计学意义时定义 。
3所示。结果
3.1。表达下调mir - 381 - 3 - p在神经胶质瘤
研究表明,mir - 381 - 3 - p对癌症恶化是至关重要的。例如,它限制了乳头状甲状腺癌的恶性行为,OSCC,宫颈癌(9,10,12在神经胶质瘤),但其监管作用从未被报道过。因此,mir - 381 - 3 - p被选为本研究的研究对象。mir - 381 - 3 - p显示低级别胶质瘤TCGA-GBM和TCGA-LGG相对于正常组织(图1(一))。然后,存在与低水平的mir - 381 - 3 - p在神经胶质瘤细胞与正常细胞相比,和U87显示(图的最低水平1 (b))。因此,U87随后。总的来说,mir - 381 - 3 - p在神经胶质瘤醒目地表达不佳。
(一)
(b)
3.2。mir - 381 - 3 - p抑制胶质瘤细胞的功能
我们转染数控模拟/ mir - 381 - 3 - p模仿与神经胶质瘤细胞,之后效率试验表现出刺激mir - 381 - 3 - p水平mir - 381 - 3 - p模仿组(图2(一个))。然后,CCK-8表示,迫使mir - 381 - 3 - p明显阻碍神经胶质瘤细胞的增殖能力(图2 (b))。同样,克制的迁移和入侵也发现在实验数据2 (c)和2 (d))。一般来说,mir - 381 - 3 - p对神经胶质瘤进展产生了抑制作用。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。ANTXR1 mir - 381 - 3的目标- p
1303年DE_mRNAs包括356调节和947下调收购(补充图。1)。接下来,13个候选基因被发现之间的重叠的目标基因预测的生物信息学数据库和DE_mRNAs(补充图。1 b)。,ANTXR1最高度相关和mir - 381 - 3 - p,和这两个基因是非常显著的负相关(补充图。1 c)。TCGA ANTXR1在胶质瘤组织显著调节数据集(图3(一个))。因此,ANTXR1被选为研究对象。而NHA ANTXR1 U87调节,H4, T98G, U251细胞系(图3 (b))。此后,减少ANTXR1蛋白质和mRNA水平被发现在mir - 381 - 3 - p过度(数字3 (c)和3 (d))。dual-luciferase方法显示,mir - 381 - 3 - p模仿ANTXR1-MUT但并不影响荧光素酶强度下降的ANTXR1-WT(图3 (e))。总的来说,mir - 381 - 3 - p调制ANTXR1表达水平。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。mir - 381 - 3 - p针对ANTXR1抑制恶性神经胶质瘤细胞的行为
我们调查ANTXR1能否抵消mir - 381 - 3 p的抑制胶质瘤细胞功能。首先,通过使转染mir - 381 - 3 - p模仿和oe-ANTXR1,我们将细胞分成3组。关于mir - 381 - 3 - p -模仿+ oe-NC集团ANTXR1显著调节在mir - 381 - 3 - p -模仿+ oe-ANTXR1集团所提出的免疫印迹和存在(数字4(一)和4 (b))。随后,实验结果表明,抑制mir - 381 - 3 - p模仿神经胶质瘤细胞功能中和在ANTXR1过度(数字4 (c)- - - - - -4 (e))。在一起,我们证实,mir - 381 - 3 - p可以通过针对ANTXR1抑制胶质瘤细胞的生物功能。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
microrna似乎代表一个最具吸引力的目标分子和生物标志物的诊断和预后的潜力。他们在肿瘤发生中发挥重要作用,干细胞特征、血管生成和转移也参与影响临床结果和耐药性13]。在这里,我们调查的作用和可能机制在神经胶质瘤mir - 381 - 3 - p。mir - 381 - 3 - p是异常表达在多种癌症(12,14,15),普遍被认为是一种肿瘤抑制基因,它可以调节增殖,迁移,癌细胞的入侵潜力和促进细胞凋亡。我们探索mir - 381 - 3 - p通过生物信息学分析和表达中存在,在差别mir - 381 - 3 - p对这些神经胶质瘤。更重要的是,我们调节mir - 381 - 3 - p U87神经胶质瘤细胞,观察细胞增殖,减少迁移和入侵利率,如前所述。因此,我们建议,mir - 381 - 3 - p可能是一个潜在的目标,为神经胶质瘤生物标志物。
由564个氨基酸(16],ANTXR1第一次被发现是在人类结肠癌的血管内皮细胞(17]。它是三个受体能够驱动炭疽毒素进入细胞(18]。不同的肿瘤抑制基因mir - 381 - 3 - p, ANTXR1已经在多个癌症发现调节(19- - - - - -21),可以促进这些癌症的恶化。有趣的是,耿et al。22)透露,ANTXR1可能与胶质瘤的恶性程度有关,并通过ANTXR1 miR-26b-3p抑制神经胶质瘤的过程。我们的结果还证实,ANTXR1正在调节神经胶质瘤细胞系。目前的调查发现高水平的ANTXR1及其负面协会研究microrna的神经胶质瘤细胞。鼓舞地,我们发现mir - 381 - 3 - p可能目标ANTXR1神经胶质瘤细胞。进一步的实验透露,ANTXR1撞倒在mir - 381 - 3 - p超表达。此外,救助实验发现,过度ANTXR1可能抵消mir - 381 - 3 p的抑制神经胶质瘤细胞行为,增殖,迁移和入侵。总的来说,mir - 381 - 3 - p通过调制ANTXR1压抑的神经胶质瘤的恶性行为。
总之,mir - 381 - 3 - p失活在神经胶质瘤TCGA所说明的数据,这是建立在细胞水平。本文证明了mir - 381 - 3 - p可以通过调制ANTXR1抑制恶性神经胶质瘤的行为,这可能是一个有前途的神经胶质瘤的目标。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
同意
不同意是必要的。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
所有作者导致数据分析和起草和修改这篇文章,给了最后批准的版本发布,并同意负责所有方面的工作。志强盾和Jinglong张了同样的工作。
确认
本研究支持的基金Cuiying科技创新项目的兰州大学第二医院(CY2019-MS04)。
补充材料
补充图1:潜在的目标基因mir - 381 - 3 - p基于生物信息学分析。(一)DE_mRNAs火山图所示;13 (B)基因与结合位点mir - 381 - 3 - p;(C) mir - 381 - 3 - p的相关性和13个重叠的mrna。(补充材料)